Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. DNA ty thể 1. Ty thể Ty thể là bào quan có hình trụ dài, toàn bộ cấu trúc của ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng cấu tạo bởi protein và lớp phospholipid kép. Không gian bên trong chứa chất nền, DNA ty thể, ribosom… Ty thể là trung tâm hô hấp của tế bào, là nơi sản sinh ra ATP, cung cấp năng lượng cho tế bào.
Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả năng tự sinh sản bằng cách phân đôi ty thể mẹ để sinh ra các ty thể con [8]. Cấu trúc DNA ty thể DNA ty thể có cấu trúc sợi kép, mạch vòng không liên kết với protein histon, nằm trong chất nền của ty thể và chiếm khoảng 5% tổng số DNA của mỗi tế bào. Trình tự DNA ty thể hoàn chỉnh của người đầu tiên đã được Anderson và các tác giả công bố năm 1981 [9], năm 1999 Andrews và các tác giả đã chỉnh sửa lại trình tự này và hiện nay được gọi là “trình tự chuẩn Cambridge đã chỉnh sửa - rCRS” [10]. DNA ty thể có kích thước 16569 bp, mã hóa cho 37 gen, 13 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22 gen mã hóa cho 22 RNA vận chuyển, 2 gen mã hóa cho 2 RNA ribosom.
Có thể thấy hệ gen ty thể người khá gọn và hầu hết đều tham gia vào mã hóa gen. Vùng duy nhất không mã hóa ở DNA ty thể là vùng điều khiển D-loop (Displacement loop) có chứa hai vùng HV1 (Hypervariable region 1) và HV2 (Hypervariable region 2). LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1: Sơ đồ cấu tạo chi tiết của DNA ty thể người [11] Chú thích: Phân tử DNA mạch vòng, kép, kích thước 16569 bp. Vị trí của các gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptid, 2 RNA ribosom (12S và 16S) và 22 RNA vận chuyển được trình bày tương ứng trên hình trên.
Vùng điều khiển D-loop chứa các điểm khởi đầu sao chép, promoter của chuỗi nặng, nhẹ và chứa vùng siêu biến HV1 và HV2. Vùng HV1 và HV2 trên DNA ty thể 1. Vùng điều khiển D-loop Vùng điều khiển D-loop có kích thước 1121bp, nằm từ vị trí 16024- 16569/0-576 và giữa hai gen tRNA vận chuyển cho Phenylanalin và Prolin, chiếm khoảng 7% tổng lượng DNA ty thể, chứa các trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản DNA ty thể và các đoạn điều khiển cho quá trình phiên mã của các gen chức năng trong vùng được mã hóa [9]. Đây là vùng được xem là có nhiều đột biến nhất với tần số đột biến cao hơn các vùng khác của hệ gen ty thể khoảng 4,4 lần [12].
Trình tự hoàn chỉnh vùng điều khiển D - loop trên DNA ty thể của nhiều dân tộc thuộc các chủng tộc người khác nhau, ở các châu lục khác nhau trên thế LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 giới được công bố trong (http://www.org), cho đến nay đã có vài nghìn trình tự vùng D - loop đã được công bố. Có trên 300 trình tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thể người thuộc các chủng tộc khác nhau được nghiên cứu và đăng ký trong các ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL/Genbank/DDBJ (http://www.se/mtDB/index. Các công bố này cho thấy trình tự hệ gen ty thể nói chung và vùng điều khiển D-loop nói riêng của các chủng tộc và dân tộc khác nhau có những khác biệt nhất định [13]. Số lượng các trình tự D-loop cũng như trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của các cá thể người thuộc các dân tộc khác nhau trên thế giới được giải mã vẫn tăng lên không ngừng.
Vùng HV1, HV2 của DNA ty thể Năm 1981, Anderson và cộng sự đã xác định được hai đoạn DNA trong vùng D-loop được gọi là vùng siêu biến 1 (HV1- Hypervariable region 1) và vùng siêu biến 2 (HV2- Hypervariable region 2) [9]. Với tần số đột biến cao, nhiều điểm đa hình nên hai vùng này được tập trung nghiên cứu nhiều hơn cả, đặc biệt là vùng HV1. Vùng điều khiển DNA ty thể người 16569bp Hình 1.2: Hình trình bày vị trí hai vùng HV1 và HV2 trên DNA ty thể (theo www.com) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 Ở một số cá thể, hai vùng HV1 và HV2 có các đoạn lặp lại liên tiếp các nucleotid Cytosin, thường được gọi là các đoạn poly C. Trên vùng HV1 đoạn poly C nằm từ vị trí 16183 - 16193 còn trên vùng HV2 đoạn poly C nằm từ vị trí 303 - 327.
Ở trình tự mtDNA hoàn chỉnh của người đầu tiên được công bố năm 1981 [9], đoạn poly C của vùng HV1 được ngắt quãng bởi nucleotid Thymin ở vị trí 16189. Tuy nhiên, rất nhiều trình tự DNA ty thể có đột biến T16189C tạo thành chuỗi có 10 nucleotid Cystosin liên tiếp. Đột biến T16189C được xem là đột biến có tốc độ cao nhất trong hệ gen ty thể người [14]. Các nghiên cứu cho thấy, trong các tế bào, có nhiều loại DNA ty thể có chiều dài và trình tự đoạn poly C khác nhau, đây là hiện tượng “dị tế bào chất” đoạn poly C.
Tỷ lệ phần trăm các phân tử DNA ty thể mang các độ dài đoạn poly C khác nhau là ổn định ở mỗi cá thể, được di truyền theo dòng mẹ và được tạo mới trong quá trình phát triển [15]. Việc phân tích các đa hình di truyền DNA ty thể nhằm làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, đồng thời nghiên cứu mối liên quan giữa DNA ty thể với các bệnh di truyền theo dòng mẹ. Đa số các nghiên cứu dựa trên tính đa hình của vùng điều khiển D-loop. Các nghiên cứu cũng cho thấy có mối liên hệ nhất định giữa các bệnh với trạng thái “dị tế bào chất” ở DNA ty thể của các bệnh nhân [16].
Mặc dù, các nghiên cứu về hai vùng HV1 và HV2 được thực hiện nhiều trong những năm gần đây, nhưng người ta vẫn chưa tìm thấy mối liên quan giữa vùng HV1 và vùng HV2 của DNA ty thể. Các nghiên cứu khác nhau đánh giá tốc độ đột biến liên quan tới di truyền của vùng HV1 và HV2 vẫn còn gây tranh cãi. Do DNA ty thể không tái tổ hợp nên toàn bộ phân tử DNA có một lịch sử tiến hóa chung. Tuy nhiên, hai vùng HV1 và HV2 lại có tốc độ đột biến khác nhau và nếu sự khác nhau trong tốc độ đột biến này đủ lớn thì các yếu tố đa hình của hai vùng này có thể phản ánh được các quá trình tiến hóa khác nhau [17].
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 Có rất nhiều loại đột biến trong vùng điều khiển của DNA ty thể: đột biến thay thế, mất đoạn, thêm đoạn nhưng hay gặp nhất là loại đột biến thay thế nucleotid. Tốc độ đột biến của DNA ty thể cao nhất ở vùng điều khiển D- loop, đặc biệt là ở hai vùng HV1và HV2, tốc độ này phụ thuộc vào vị trí các nucleotid khác nhau. Một số vị trí nucleotid trong vùng điều khiển bị đột biến thường xuyên hơn các vị trí khác được gọi là điểm nóng đột biến (mutational hotspots) [1]. Việc nghiên cứu hệ gen ty thể, giải mã trình tự nucleotid vùng điều khiển D-loop cũng như các gen khác của DNA ty thể, dẫn đến việc giải mã toàn bộ hệ gen ty thể của nhiều đại diện dân tộc người khác nhau trên thế giới, cùng với các nghiên cứu về đặc điểm, tính đa hình của vùng HV1 và HV2 sẽ cung cấp số liệu cần thiết cho các nghiên cứu về y học, di truyền học và nhiều lĩnh vực có liên quan khác.
Đặc điểm di truyền DNA ty thể Hệ gen người gồm có hai phần: hệ gen trong nhân và hệ gen ty thể. Việc sử dụng hệ gen trong nhân làm đối tượng nghiên cứu có một số nhược điểm như: tần số đột biến thấp, được di truyền từ cả bố và mẹ, mặt khác lại bị phân ly qua các thế hệ. Vì vậy, gen ty thể với các đặc điểm di truyền theo dòng mẹ, tần số đột biến cao, số lượng bản sao nhiều và không tái tổ hợp là thế mạnh nên DNA ty thể nhanh chóng trở thành đối tượng được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực y học, di truyền. Ngoài ra, thông tin về các trình tự nucleotid trên DNA ty thể còn có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán, điều trị các bệnh di truyền ty thể.
DNA trong nhân có cấu trúc mạch thẳng thường không bền, dễ bị phân hủy, làm cho việc phân tích gặp nhiều khó khăn. Trong khi đó, DNA ty thể mạch vòng, có kích thước nhỏ, nằm trong tế bào chất, bền theo thời gian trong LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 các mô khó phân hủy như mô xương, răng và tóc, nên việc tách chiết, thu nhận DNA ty thể dễ dàng hơn, đặc biệt trong những trường hợp phân tích các mẫu bệnh phẩm sau nhiều năm [18]. Ở động vật có vú 99,99% DNA ty thể được di truyền theo dòng mẹ [19], [20]. Trong quá trình thụ tinh, tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen trong nhân cho hợp tử chứ không đóng góp hệ gen ty thể.
Ty thể của tinh trùng bị loại bỏ ngay sau khi vào trứng có thể do quá trình phân hủy protein phụ thuộc ubiquitin [21]. Vì vậy, trong đa số các trường hợp DNA ty thể đều được nhận từ mẹ. Điều này giúp cho việc nghiên cứu xác định một số bệnh di truyền theo dòng mẹ. Hiện tượng tái tổ hợp của DNA ty thể rất hiếm khi hoặc hầu như không xảy ra do đó có thể coi DNA ty thể không có sự tái tổ hợp, vì vậy DNA ty thể gần như hoàn toàn giống DNA ty thể mẹ ban đầu [22].
Các đặc điểm của hệ gen ty thể như không có histon bảo vệ, phân bố gần chuỗi phosphoryl oxy hóa, nơi mà các gốc tự do được tạo ra trong quá trình oxy hóa, đã làm cho khả năng bị đột biến của DNA ty thể cao hơn DNA trong nhân rất nhiều lần. Đặc biệt, các đột biến của DNA ty thể thường trung tính, đặc hiệu theo quần thể [23]. Tốc độ đột biến thay thế trong hệ gen ty thể gấp khoảng 10-100 lần tốc độ đột biến trung bình của hệ gen nhân [24]. Tốc độ đột biến của vùng điều khiển cao hơn vùng mã hóa, cao nhất ở hai vùng HV1, HV2 [25].
Tốc độ đột biến này có thể là do trong quá trình sao chép có lỗi và ty thể thiếu cơ chế để sửa chữa các sai sót như ở trong nhân [26]. Mặt khác, ty thể là nơi luôn diễn ra quá trình oxy hóa, sản sinh ra các chất oxy hóa mạnh như các gốc tự do. Các chất này sẽ tác động đến hệ gen của ty thể và phát sinh ra các đột biến.