Luận án tiến sĩ y học đặc điểm sinh học phân tử của escherichia coli mang gen mcr 1 kháng colistin phân lập từ người và vật nuôi thực phẩm và nước tại xã thanh hà hà nam năm 2015

Luận án tiến sĩ y học nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Mai
• Người hướng dẫn: TS. Trần Huy Hoàng
• Trường học: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Vi sinh y học
• Đề tài: Đặc điểm sinh học phân tử của Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại Thanh Hà, Hà Nam 2015
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.1. Sự đề kháng kháng sinh
• 1.1.2. Các nguyên nhân gây gia tăng và lan truyền các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.2. Vi khuẩn gram âm đường ruột và thực trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.1. Vi khuẩn gram âm đường ruột
• 1.2.2. Thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gram âm đường ruột hiện nay
• 1.3. Đặc điểm vi sinh vật học và tình hình kháng colistin của E. coli
• 1.3.1. Đặc điểm vi sinh vật học
• 1.3.2. Các nghiên cứu về gen mcr-1 kháng colistin của E. coli và các vi khuẩn gram âm đường ruột trên thế giới và Việt Nam
• 1.3.3. Một số đặc điểm về gen mcr-1 và plasmid của các chủng E. coli kháng colistin
• 1.4. Các kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh và các kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng trong phát hiện các gen kháng kháng sinh
• 1.4.1. Kĩ thuật phát hiện kháng kháng sinh
• 1.4.2. Các kĩ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh
• 1.4.2.1. Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh
• 1.4.2.2. Kỹ thuật RADP PCR
• 1.4.2.3. Kỹ thuật điện di xung trường
• 1.4.2.4. Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn
• 1.4.2.5. Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing
• 1.4.2.6. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.5. Các vấn đề cần giải quyết trong nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp lấy mẫu và kỹ thuật xét nghiệm
• 2.6.1. Kĩ thuật nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
• 2.6.2. PCR phát hiện gen mcr-1
• 2.6.3. Kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng máy MALDI TOF
• 2.6.4. Kỹ thuật đánh giá nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu
• 2.6.5. Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE
• 2.6.6. Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn
• 2.6.7. Kỹ thuật tiếp hợp đánh giá sự lan truyền gen mcr-1 qua plasmid
• 2.7. Biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập thông tin
• 2.9. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.10. Khống chế sai số
• 2.11. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người và động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà, Thanh Liêm, Hà Nam, năm 2015
• 3.1.1. Đặc điểm chung về các loại mẫu được thu thập trong nghiên cứu
• 3.1.2. Tỷ lệ mẫu có chứa chủng E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.3. Tỷ lệ chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước
• 3.1.4. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.1.5. Tỷ lệ phân bố của gen mcr-1 trên NST và plasmid của các chủng E. coli
• 3.1.6. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trong phân người và động vật nuôi, thức ăn và nước
• 3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 3.2.1. Các gen kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1
• 3.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng vi khuẩn mang gen mcr-1
• 3.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen
• 3.3. Kết quả xác định đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid và cấu trúc di truyền động của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1
• 3.3.1. Xác định đặc điểm của các plasmid mang gen mcr-1
• 3.3.2. Xác định khả năng lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid giữa các chủng vi khuẩn
• 3.3.3. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.1. Một số đặc điểm về quần thể thu thập mẫu nghiên cứu
• 4.1.2. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ người, động vật nuôi, thực phẩm và nước tại xã Thanh Hà huyện Thanh Liêm, Hà Nam giai đoạn 2014-2015
• 4.1.3. Mức độ nhạy cảm colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin
• 4.1.4. Sự phổ biến của các chủng E. coli mang gen mcr-1 trên NST và plasmid
• 4.1.5. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại cộng đồng trong nghiên cứu
• 4.2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 phân lập được trong nghiên cứu
• 4.2.1. Các gen kháng kháng sinh
• 4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật PFGE
• 4.2.3. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1 bằng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ bộ gen
• 4.3. Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo
• ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đặc điểm sinh học phân tử của E

Nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học phân tử của E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015. Gen mcr-1 được phát hiện trên các chủng E. coli phân lập từ người, vật nuôi, thực phẩm và nước. Kết quả cho thấy sự hiện diện của gen mcr-1 trên cả nhiễm sắc thể và plasmid, với khả năng lan truyền qua plasmid là chủ yếu. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, PFGE, và giải trình tự toàn bộ hệ gen được sử dụng để phân tích đặc điểm di truyền của các chủng vi khuẩn.

1.1. Phân bố gen mcr 1 trên các nguồn mẫu

Gen mcr-1 được tìm thấy trên các chủng E. coli từ phân người, phân động vật, thực phẩm và nước. Tỷ lệ phân bố cao nhất ở phân động vật, cho thấy vật nuôi có thể là nguồn lây lan chính của gen mcr-1. Sự hiện diện của gen mcr-1 trong thực phẩm và nước cũng chỉ ra nguy cơ lây nhiễm qua chuỗi thức ăn và môi trường.

1.2. Cơ chế lan truyền gen mcr 1

Gen mcr-1 được lan truyền chủ yếu qua plasmid, đặc biệt là các loại plasmid IncI2 và IncHI2. Kỹ thuật tiếp hợp đã chứng minh khả năng truyền gen mcr-1 giữa các chủng E. coli. Điều này làm tăng nguy cơ lan rộng kháng colistin trong cộng đồng và môi trường.

II. Tình hình kháng colistin tại Thanh Hà Hà Nam

Nghiên cứu đã xác định tỷ lệ kháng colistin của các chủng E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà, Hà Nam năm 2015. Kết quả cho thấy kháng colistin phổ biến ở cả người và vật nuôi, với tỷ lệ cao hơn ở vật nuôi. Điều này phản ánh việc sử dụng colistin trong chăn nuôi có thể là nguyên nhân chính dẫn đến sự gia tăng kháng colistin.

2.1. Tỷ lệ kháng colistin ở người và vật nuôi

Tỷ lệ kháng colistin ở vật nuôi cao hơn đáng kể so với người, cho thấy vật nuôi có thể là nguồn lây nhiễm chính. Sự hiện diện của gen mcr-1 trong phân người cũng chỉ ra nguy cơ lây lan từ vật nuôi sang người qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp.

2.2. Ảnh hưởng của việc sử dụng colistin trong chăn nuôi

Việc sử dụng colistin trong chăn nuôi đã tạo áp lực chọn lọc, thúc đẩy sự phát triển của các chủng E. coli mang gen mcr-1. Điều này làm tăng nguy cơ lan truyền kháng colistin trong cộng đồng và môi trường.

III. Ứng dụng và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu cung cấp bằng chứng khoa học về sự hiện diện và lan truyền của gen mcr-1 trong cộng đồng tại Thanh Hà, Hà Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc đề xuất các biện pháp kiểm soát kháng colistin, đặc biệt là trong chăn nuôi và quản lý thực phẩm.

3.1. Kiểm soát kháng colistin trong chăn nuôi

Nghiên cứu nhấn mạnh sự cần thiết của việc hạn chế sử dụng colistin trong chăn nuôi để giảm áp lực chọn lọc và ngăn chặn sự lan truyền gen mcr-1. Các biện pháp quản lý chặt chẽ hơn cần được áp dụng để kiểm soát kháng colistin.

3.2. Quản lý an toàn thực phẩm và nước

Sự hiện diện của gen mcr-1 trong thực phẩm và nước đòi hỏi các biện pháp quản lý nghiêm ngặt hơn để đảm bảo an toàn thực phẩm và chất lượng nước. Điều này giúp giảm nguy cơ lây nhiễm kháng colistin từ môi trường sang người.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn đang gia tăng do việc sử dụng kháng sinh không hợp lý trong cơ sở y tế kết hợp với lạm dụng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản để điều trị, phòng bệnh và kích thích tăng trưởng. Khi các vi khuẩn gram âm đường ruột mang gen blaNDM-1 kháng carbapenem xuất hiện, carbapenem dần mất đi hiệu lực đối với các trường hợp nhiễm trùng nặng do vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng (ESBLs). Trước tình hình đó, colistin (kháng sinh nhóm polypeptide) được tái sử dụng trên lâm sàng như giải pháp lựa chọn cuối cùng. Dù colistin từng bị ngừng chỉ định trên người từ những năm 1970 do độc tính trên thận và thần kinh, hoạt chất này vẫn được dùng phổ biến trong chăn nuôi. Năm 2015, Liu và cộng sự tại Trung Quốc đã phân lập chủng vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 (mobilized colistin resistance-1 hay mediated colistin resistance-1) có khả năng đề kháng colistin và truyền ngang qua plasmid. Phát hiện này củng cố giả thuyết mcr-1 phát sinh từ sức ép chọn lọc của colistin trong đường ruột động vật nuôi rồi lan truyền sang người. Gen mcr-1 gắn liền với các yếu tố di truyền động như transposon Tn6330 (ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1) và nhiều nhóm plasmid, tạo điều kiện cho các chủng E. coli tích lũy đồng thời nhiều gen kháng khác (blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65, floR).

Tại Việt Nam, các nghiên cứu ban đầu đã ghi nhận vi khuẩn mang gen mcr-1 trong bệnh viện, động vật và thực phẩm, song khu vực nông thôn miền Bắc chưa có khảo sát đồng bộ trên toàn bộ hệ sinh thái cộng đồng. Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là việc thiếu hụt dữ liệu tổng thể về tình trạng mang gen mcr-1 của các chủng E. coli cùng lúc ở người, động vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước trong cùng một quần thể dân cư, cũng như đặc tính sinh học phân tử và cơ chế truyền ngang của gen này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được đánh số cụ thể gồm:

1. Xác định tỷ lệ chủng E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin phân lập được từ phân người và vật nuôi, thực phẩm, nước tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam, năm 2015.
2. Xác định một số đặc điểm sinh học phân tử chủng E. coli mang gen mcr-1 đã phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ 4 nhóm mẫu: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN), thực phẩm sống/thức ăn (TĂ) và nguồn nước sinh hoạt/môi trường (N). Phạm vi không gian được thực hiện tại các hộ gia đình thuộc xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam. Thời gian thu thập mẫu và triển khai nghiên cứu thực địa diễn ra trong năm 2015 (giai đoạn 2014-2015).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về cơ chế kháng colistin và sự phân bố của gen mcr-1:

• Liu và cộng sự (2015): Lần đầu tiên công bố phát hiện gen mcr-1 truyền qua plasmid ở E. coli và Klebsiella pneumoniae thu thập từ 5 thành phố của Trung Quốc giai đoạn 2011-2014. Tỷ lệ mang gen là 15% (78/523 mẫu thịt sống), 21% (166/824 mẫu từ động vật) và 1% (16/1322 mẫu từ bệnh nhân nội trú). Nhóm nghiên cứu giải trình tự 4 plasmid mang gen gồm pHNSHP45 (từ phân lợn) và 3 plasmid pE15004, pE15015, pE15017 (từ bệnh phẩm người), chỉ ra gen mã hóa phosphoethanolamine transferase làm biến đổi cấu trúc lipid A.
• Fernandes MR và cộng sự (2016): Phân lập chủng E. coli mang mcr-1 từ bệnh nhân đái tháo đường nhiễm trùng bàn chân tại Brazil, xác định chủng thuộc Sequence Type 101 (ST101) và mang plasmid IncX4.
• Wong, Sally CY và cộng sự (2016): Giám sát tại bệnh viện đại học ở Hồng Kông giai đoạn 2015-2016, phân lập 5 chủng Enterobacteriaceae mang mcr-1 (trong đó có 4 chủng E. coli, chiếm 0,4%) từ bệnh nhân từng điều trị bằng colistin.
• Anjum MF và cộng sự: Phát hiện chủng E. coli và Salmonella mang mcr-1 tại trang trại nuôi lợn ở Anh, đồng thời mang enzym sinh ESBLs và yếu tố xen đoạn ISApl1.
• Nghiên cứu tại Đan Mạch: Phân lập chủng E. coli mang mcr-1 từ máu bệnh nhân nhiễm trùng huyết, đồng mang gen blaCTX-M-55 và blaCMY-2; 5 chủng từ thịt gà mang blaSHV-12 và blaCMY-2.
• Dan-xia Guo và cộng sự: Phát hiện K. pneumoniae và E. coli mang mcr-1 trong phân trẻ em bị tiêu chảy tại Trung Quốc.
• Patrick McGann và cộng sự: Phân lập E. coli sinh ESBL mang mcr-1 từ bệnh nhân nhiễm trùng đường niệu tại Mỹ.
• Yao, Xu và cộng sự: Ghi nhận chủng E. coli THSJ02 (ST167) từ cánh gà siêu thị Quảng Châu (Trung Quốc) kháng hầu hết kháng sinh ngoại trừ doxycycline và tigecycline, mang đồng thời mcr-1, blaNDM-9, fosA3, rmtB, blaCTX-M-65 và floR.
• Các nghiên cứu tại Việt Nam:
  • Dương Thị Toan và cộng sự (2014): Điều tra 20 trại lợn thịt và 20 trại gà thịt tại Bắc Giang, ghi nhận 100% trang trại dùng kháng sinh với 17 loại khác nhau, colistin chiếm 45,0% tại trại lợn; 50% mẫu thức ăn chăn nuôi tồn dư kháng sinh.
  • Phạm Kim Đăng và cộng sự: Khảo sát tại Hải Phòng ghi nhận người nuôi dùng ít nhất 38 loại kháng sinh thuộc 10 nhóm; phát hiện việc sử dụng colistin, maduramycin và bambermycin trộn vào thức ăn để kích thích sinh trưởng.
  • Nguyễn T. Nhung và cộng sự: Điều tra 12 trang trại tại Tiền Giang, mức kháng colistin của E. coli ở gà và lợn lần lượt là 22,2% và 24,4%; tỷ lệ mang gen mcr-1 từ 19% đến 22%.
  • Surbhi Malhotra-Kumar và cộng sự (2016): Sàng lọc 24 chủng E. coli sinh ESBL phân lập năm 2014-2015 từ phết trực tràng lợn và gà tại Văn Lâm (Hưng Yên) và Hoài Đức (Hà Nội), ghi nhận 9/24 chủng (37,5%) mang mcr-1, MIC colistin 4 hoặc 8 mg/L, trình tự gen đồng nhất 100% với gen phát hiện tại Trung Quốc.

Vị trí của luận án: Nghiên cứu của Malhotra-Kumar và cộng sự mới khảo sát trên mẫu trực tràng gia súc, gia cầm tại trang trại, chưa đánh giá sự lây lan ra nguồn nước, thức ăn và người sinh sống cùng khu vực. Luận án của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai giải quyết khoảng trống này bằng cách thu thập đồng bộ các nguồn mẫu trong cùng hộ gia đình ở nông thôn miền Bắc, phân tích sâu cơ chế lan truyền qua plasmid và transposon bằng các kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn hóa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên nền tảng lý thuyết vi sinh học và dịch tễ học phân tử:

• Cơ chế tác dụng của colistin: Colistin là phân tử polycationic tương tác tĩnh điện với lipopolysaccharid (LPS) và phospholipid màng ngoài tế bào vi khuẩn gram âm, cạnh tranh vị trí của các cation hóa trị hai $Ca^{2+}$ và $Mg^{2+}$, gây xáo trộn màng nguyên sinh chất, rò rỉ các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn.
• Cơ chế đề kháng colistin: Đề kháng tự nhiên do đột biến trên nhiễm sắc thể ở hệ điều hòa hai thành phần (pmrAB, phoPQ, mgrB), làm thay đổi điện tích màng. Đề kháng thu được truyền ngang qua cơ chế chuyển gen ngang (HGT - Horizontal Gene Transfer) trung gian bởi plasmid mang các gen họ mcr (mcr-1 đến mcr-10), mã hóa enzym phosphoethanolamine transferase gắn nhóm phosphoethanolamine vào lipid A, làm giảm ái lực liên kết của colistin.
• Hệ thống gen kháng kháng sinh: Các gen kháng thuốc được phân bố trên nhiễm sắc thể hoặc các yếu tố di truyền động (MGEs: plasmid, transposon, integron), tạo điều kiện cho vi khuẩn lan truyền dọc qua phân chia tế bào và truyền ngang giữa các cá thể cùng hoặc khác loài.

Nhóm kháng sinh	Cơ chế tác động chính	Gen đề kháng quan trọng theo ghi nhận của luận án
Polypeptid (Polymyxin/Colistin)	Rối loạn chức năng màng nguyên tương, thay đổi tính thấm chọn lọc	mcr-1 đến mcr-10, lpxA, lpxC, lpxD, đột biến pmrAB, phoPQ, mgrB
Beta-lactam	Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn qua gắn kết PBPs	AmpC, ESBL (blaTEM, blaSHV, blaCTX-M), Carbapenemase (KPC, NDM, OXA, IMP, VIM)
Aminoglycosid	Ức chế sinh tổng hợp protein qua gắn tiểu đơn vị ribosome 30S	Methylase 16S rRNA (armA, rmtA-D, npmA), enzym AAC, ANT, APH
Quinolon	Ức chế enzym ADN gyrase (gyrA, gyrB) và topoisomerase IV (parC, parE)	Đột biến NST trên gyrA, parC; gen plasmid: qnrA, qnrB, qnrS, aac(6')-Ib-cr, qepA
Chloramphenicol	Ức chế tổng hợp protein qua gắn tiểu đơn vị ribosome 50S	catA, catB (acetyltransferase), bơm đẩy cmlA, floR (kháng florfenicol)
Sulfonamid & Trimethoprim	Ức chế tổng hợp acid folic cần thiết cho chuyển hóa tế bào	folP, sul1, sul2, sul3 (sulfonamid); folA, dfrA, dfrB, dfrK (trimethoprim)
Glycopeptid	Ức chế trùng hợp peptidoglycan tạo vách vi khuẩn	vanA, vanB (plasmid/NST); vanC1, vanC2/3, vanD, vanE, vanG (NST)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được tác giả triển khai bao gồm:

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích sinh học phân tử.
• Thu thập mẫu: Lấy mẫu tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn của xã Thanh Hà, thu nhận 4 loại bệnh phẩm: phân người (PN), phân động vật nuôi (PĐVN: lợn, gà, thủy cầm), thực phẩm (TĂ) và nguồn nước sinh hoạt/ao hồ (N).
• Phân lập và định danh vi khuẩn: Mẫu được nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc MacConkey/thạch dinh dưỡng; định danh khẳng định loài Escherichia coli bằng hệ thống máy phổ khối MALDI-TOF.
• Kỹ thuật PCR: Khuếch đại đặc hiệu gen mcr-1 với cặp mồi chuyên biệt, phát hiện sản phẩm qua điện di trên thạch agarose.
• Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Thử nghiệm vi pha loãng canh thang hoặc pha loãng trên thạch theo hướng dẫn chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI), nhằm đánh giá mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với colistin và các kháng sinh thông dụng khác (ampicillin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, ciprofloxacin...).
• Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE - Pulsed-Field Gel Electrophoresis): Sử dụng enzym giới hạn cắt toàn bộ hệ gen ADN vi khuẩn, điện di xung trường để so sánh mức độ tương đồng di truyền, xây dựng cây phả hệ kiểu gen.
• Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS - Whole Genome Sequencing): Phân tích trình tự ADN hệ gen xác định cấu trúc gen kháng thuốc, phân loại trình tự đa vị trí (MLST) xác định Sequence Type (ST), phân tích hệ gen lõi (core genome).
• Phân tích plasmid và yếu tố di truyền di động: Phân loại nhóm replicon plasmid bằng PCR (PBRT) và WGS (nhóm IncI2, IncHI2/IncHI2A, IncN, IncX4); kỹ thuật Southern blot kết hợp enzym S1 (S1-PFGE) xác định vị trí gen mcr-1 nằm trên plasmid hay trên nhiễm sắc thể; phân tích cấu trúc transposon Tn6330 chứa các yếu tố xen đoạn ISApl1.
• Thử nghiệm tiếp hợp (Conjugation assay): Đánh giá khả năng lan truyền gen kháng mcr-1 trung gian qua plasmid bằng cách lai giữa chủng E. coli cho phân lập từ thực địa với chủng nhận E. coli J53 (hoặc DH5-alpha), kiểm tra sự chuyển đổi kiểu hình kháng colistin trên môi trường chọn lọc kép.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết cơ sở lý thuyết về kháng sinh và các cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn: đột biến gen đích tác động, thay đổi mạng lưới chuyển hóa qua enzym phân hủy/biến đổi, giảm tính thấm của màng ngoài (porin), và hoạt hóa bơm đẩy (efflux pump). Tác giả làm rõ vai trò của truyền gen ngang (HGT) qua ba con đường biến nạp, tải nạp và tiếp hợp, nhấn mạnh tiếp hợp là phương thức phổ biến trong đường tiêu hóa thông qua các yếu tố di truyền động (plasmid mang gen tra, transposon chứa chuỗi lặp ngược chiều IR, và integron mang cassette gen kháng). Tiếp đó, chương phân tích đặc tính cấu trúc phân tử của colistin, cơ chế cạnh tranh ion gắn màng ngoài tế bào vi khuẩn, lịch sử sử dụng colistin trong thú y và sự tái sử dụng trong lâm sàng đối với các chủng vi khuẩn gram âm đường ruột kháng carbapenem mang gen blaNDM-1. Tác giả điểm lại chi tiết các phát hiện về gen mcr-1 trên thế giới (từ công bố đầu tiên năm 2015 của Liu và cộng sự đến hơn 30 quốc gia) và tại Việt Nam (các nghiên cứu tại Bắc Giang, Hải Phòng, Tiền Giang, Hà Nội, Hưng Yên). Cuối cùng, chương 1 trình bày nguyên lý của các kỹ thuật định danh, kỹ thuật kháng sinh đồ (khoanh giấy khuếch tán, E-test, vi pha loãng xác định MIC) và các công cụ sinh học phân tử (PCR, PFGE, MLST, S1-PFGE, WGS, thử nghiệm tiếp hợp).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm được tiến hành tại xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam trong năm 2015. Quần thể nghiên cứu gồm các mẫu lấy tại 69 hộ gia đình thuộc các thôn trên địa bàn xã. Thiết kế nghiên cứu là mô tả cắt ngang kết hợp thực nghiệm phân tử. Các bước kỹ thuật được tác giả chuẩn hóa:

• Thu thập mẫu phân người, phân vật nuôi, mẫu thức ăn và mẫu nước;
• Nuôi cấy chọn lọc và định danh vi khuẩn E. coli bằng máy MALDI-TOF;
• Tách chiết ADN, thực hiện phản ứng PCR để sàng lọc gen mcr-1;
• Xác định giá trị MIC của colistin và các kháng sinh đại diện cho các nhóm beta-lactam, aminoglycosid, quinolon theo hướng dẫn CLSI;
• Phân tích mối liên hệ kiểu gen bằng kỹ thuật PFGE sau khi cắt ADN bằng enzym giới hạn thích hợp;
• Thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) trên các chủng đại diện để xác định Sequence Type (MLST), lập bản đồ core genome, phân tích các nhóm gen kháng thuốc đồng hiện diện;
• Sử dụng enzym S1 kết hợp điện di xung trường và Southern blot để phân biệt vị trí định vị của gen mcr-1 trên nhiễm sắc thể hay trên plasmid;
• Xác định nhóm replicon plasmid mang gen mcr-1;
• Tiến hành thử nghiệm tiếp hợp in vitro với chủng nhận E. coli J53 để chứng minh khả năng truyền ngang tính kháng colistin;
• Khống chế sai số qua kiểm chuẩn chủng chứng, quy trình bảo quản mẫu và tuân thủ các quy định về đạo đức nghiên cứu sinh học y học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của luận án được trình bày qua 3 hợp phần chính:

1. Tỷ lệ vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 kháng colistin: Luận án ghi nhận tỷ lệ xuất hiện chủng E. coli mang gen mcr-1 trên 4 loại mẫu (phân người, phân động vật nuôi, thực phẩm và nước). Phân tích heatmap tại 69 hộ gia đình chỉ ra sự phân bố của gen kháng kháng sinh colistin trong quần thể. Thử nghiệm MIC colistin cho thấy đa số các chủng mang gen mcr-1 có biểu hiện kiểu hình kháng colistin với MIC vượt ngưỡng nhạy cảm. Đánh giá vị trí định vị cho thấy phần lớn gen mcr-1 nằm trên plasmid, đồng thời ghi nhận một tỷ lệ gen đã tích hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Thử nghiệm với các kháng sinh khác cho thấy vi khuẩn mang mcr-1 có tỷ lệ đa kháng cao, đề kháng với nhiều kháng sinh thông thường.
2. Đặc điểm sinh học phân tử của các chủng E. coli mang gen mcr-1: Kết quả WGS và PCR xác định sự đồng hiện diện của các gen kháng beta-lactam (các biến thể ESBLs), aminoglycosid, quinolon, phenicol, sulfonamid và trimethoprim. Cây phả hệ kiểu gen từ kỹ thuật PFGE và phân tích core genome cho thấy tính đa dạng di truyền cao giữa các chủng phân lập. Phân tích MLST phát hiện nhiều sequence types (STs) khác nhau lưu hành trong quần thể. Tác giả phát hiện các chủng E. coli mang gen mcr-1 có cùng ST xuất hiện đồng thời ở các loại mẫu khác nhau (giữa phân người và phân vật nuôi, hoặc giữa thực phẩm và nước) trong cùng một hộ gia đình.
3. Đặc điểm plasmid, cơ chế lan truyền và cấu trúc di truyền động: Xác định các nhóm replicon plasmid chính mang gen mcr-1 gồm plasmid IncI2 và IncHI2/IncHI2A/IncN (thể hiện qua biểu đồ Venn). Thử nghiệm tiếp hợp khẳng định plasmid mang gen mcr-1 có khả năng truyền thành công sang chủng nhận E. coli J53, biến chủng nhận thành vi khuẩn kháng colistin. Phân tích cấu trúc di truyền động transposon Tn6330 trên plasmid và nhiễm sắc thể ở 6 mẫu đại diện làm rõ vai trò của trình tự xen đoạn ISApl1 trong cơ chế chuyển vị và tích hợp gen mcr-1.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích ý nghĩa của các phát hiện:

• Mức độ lưu hành mcr-1 trong cộng đồng: Tác giả so sánh tỷ lệ phân lập E. coli mang gen mcr-1 tại xã Thanh Hà với các dữ liệu quốc tế (như nghiên cứu của Liu tại Trung Quốc, các báo cáo tại châu Âu, Nam Mỹ) và các nghiên cứu tại Việt Nam (nghiên cứu của Malhotra-Kumar, Dương Thị Toan, Nguyễn T. Nhung). Việc xuất hiện đồng thời gen kháng ở người, vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước phản ánh chu trình khép kín của tính kháng thuốc qua chuỗi thức ăn và vệ sinh môi trường nông thôn.
• Mối liên hệ dịch tễ học phân tử trong hộ gia đình: Sự trùng khớp về Sequence Type (ST) giữa các chủng phân lập từ phân người và phân vật nuôi hoặc nguồn nước trong cùng một hộ gia đình cung cấp bằng chứng về sự lây truyền ngang giữa các mắt xích của hệ sinh thái nông thôn.
• Vai trò của plasmid IncI2, IncHI2 và transposon ISApl1: Bàn luận làm rõ khả năng tiếp hợp truyền gen kháng qua plasmid IncI2 và IncHI2 là nguyên nhân giúp gen mcr-1 lan rộng nhanh chóng. Phân tích cấu trúc transposon cho thấy sự hiện diện hoặc khuyết thiếu của các yếu tố chèn ISApl1 ở hai đầu cấu trúc di truyền động liên quan mật thiết đến sự ổn định hoặc khả năng chuyển vị của gen mcr-1 từ plasmid vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án nêu rõ các đóng góp mới về mặt lý thuyết khoa học và thực tiễn:

• Về mặt khoa học và lý thuyết:
  1. Đây là công trình đầu tiên tại miền Bắc Việt Nam khảo sát đồng bộ sự hiện diện của gen mcr-1 trên vi khuẩn E. coli trong toàn bộ các thành tố của hệ sinh thái cộng đồng nông thôn (người, gia súc/gia cầm nuôi, thực phẩm, nguồn nước) tại cùng một địa bàn nghiên cứu (xã Thanh Hà, Hà Nam).
  2. Cung cấp bằng chứng dịch tễ học phân tử thông qua kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS), PFGE và MLST, chứng minh các chủng E. coli mang gen mcr-1 có cùng Sequence Type (ST) tồn tại đồng thời giữa người, động vật nuôi và môi trường xung quanh trong cùng một hộ gia đình.
  3. Xác định đặc tính phân tử của các plasmid mang gen mcr-1 tại thực địa, chỉ ra các nhóm replicon plasmid chủ đạo là IncI2 và IncHI2/IncHI2A/IncN, đồng thời chứng minh bằng thực nghiệm khả năng truyền ngang gen kháng colistin sang chủng E. coli nhận qua cơ chế tiếp hợp.
  4. Làm rõ cấu trúc phân tử của transposon Tn6330 mang gen mcr-1 và các yếu tố xen đoạn ISApl1 định vị cả trên plasmid và nhiễm sắc thể ở các chủng vi khuẩn đại diện tại Việt Nam.
• Về mặt thực tiễn và ứng dụng:
  1. Cung cấp số liệu dịch tễ học thực địa về mức độ kháng kháng sinh, tình trạng đa kháng thuốc và mức độ nhạy cảm MIC colistin của vi khuẩn đường ruột tại cộng đồng.
  2. Cung cấp bằng chứng thực tế phục vụ các nhà quản lý y tế và nông nghiệp trong việc kiểm soát lạm dụng colistin trong chăn nuôi thú y, bảo vệ hiệu lực của colistin trong điều trị lâm sàng trên người.

Các giải pháp và kiến nghị được tác giả đề xuất:

• Cần thắt chặt quy chế quản lý và ngừng sử dụng colistin với mục đích phòng bệnh hoặc kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm tại Việt Nam;
• Xây dựng hệ thống giám sát dịch tễ học kháng kháng sinh liên ngành theo mô hình tiếp cận Một sức khỏe (One Health), bao gồm đồng thời y tế dự phòng, thú y và môi trường nông thôn;
• Tăng cường truyền thông cho người dân nông thôn về thực hành vệ sinh ăn uống, rửa tay, xử lý chất thải chuồng trại và nguồn nước sinh hoạt để ngăn chặn chu trình lây truyền vi khuẩn mang gen kháng qua chuỗi thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu được tác giả nêu tại trang 113 của văn bản:

• Phạm vi địa bàn: Nghiên cứu được triển khai tập trung tại một xã nông thôn thuần túy (xã Thanh Hà, huyện Thanh Liêm, tỉnh Hà Nam), do đó số liệu chưa đại diện cho các vùng sinh thái khác nhau của miền Bắc hoặc trên quy mô toàn quốc.
• Thời gian cắt ngang: Mẫu nghiên cứu được thu thập tại một thời điểm cắt ngang (năm 2015), chưa theo dõi dọc được biến động theo thời gian về tỷ lệ lưu hành của gen mcr-1 và sự biến đổi của các dòng plasmid mang gen sau khi có các chính sách điều chỉnh sử dụng kháng sinh.
• Cỡ mẫu giải trình tự: Số lượng chủng vi khuẩn được thực hiện giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và phân tích cấu trúc transposon chi tiết mới dừng lại ở một số chủng đại diện.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng quy mô điều tra dịch tễ học phân tử của vi khuẩn mang gen mcr-1 và các biến thể họ gen mcr mới (mcr-2 đến mcr-10) tại nhiều tỉnh thành trên toàn quốc;
• Thiết kế nghiên cứu theo dõi dọc thuần tập tại cộng đồng để đánh giá động học đào thải hoặc tích lũy gen mcr-1 trong hệ vi sinh đường ruột của người và vật nuôi;
• Phân tích sâu hơn cơ chế biểu hiện gen và sự tương tác giữa plasmid mang mcr-1 với các plasmid mang gen kháng carbapenem (blaNDM) trong điều kiện áp lực kháng sinh thực địa.

Giá trị tham khảo

Nội dung luận án có giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm độc giả học thuật và chuyên môn:

• Nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh y học, Thú y, Công nghệ sinh học: Tham khảo phương pháp luận kết hợp giữa dịch tễ học vi sinh truyền thống và dịch tễ học phân tử; quy trình thực nghiệm đồng bộ từ nuôi cấy, MALDI-TOF, PCR, đo MIC, PFGE đến WGS, phân tích nhóm replicon plasmid và thử nghiệm tiếp hợp.
• Giảng viên, cán bộ nghiên cứu y - dược học: Sử dụng tài liệu để giảng dạy về cơ chế kháng kháng sinh nhóm polymyxin, cơ chế lây truyền ngang qua plasmid và transposon, cũng như thực trạng kháng thuốc của vi khuẩn gram âm đường ruột tại Việt Nam.
• Cán bộ y tế dự phòng và chuyên gia chính sách: Cung cấp cứ liệu thực chứng về sự tồn tại của vi khuẩn đa kháng mang gen mcr-1 ngay trong môi trường sinh hoạt nông thôn, hỗ trợ thiết kế các chương trình giám sát One Health và ban hành quy định cấm hoặc hạn chế colistin trong thức ăn chăn nuôi.

Các phần đáng tham khảo nhất trong văn bản gồm quy trình phân loại replicon plasmid, bản phân tích cấu trúc transposon Tn6330 kết hợp yếu tố xen đoạn ISApl1, và số liệu đối chiếu chủng vi khuẩn có cùng Sequence Type (ST) giữa các nguồn mẫu trong cùng hộ gia đình.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen mcr-1 trên các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được trong nghiên cứu định vị ở đâu trong tế bào? Kết quả phân tích bằng kỹ thuật S1-PFGE và Southern blot cho thấy gen mcr-1 phân bố chủ yếu trên các plasmid của vi khuẩn. Ngoài ra, nghiên cứu cũng ghi nhận sự hiện diện của gen mcr-1 đã tích hợp vào nhiễm sắc thể (NST) ở một số chủng E. coli phân lập từ phân người, động vật và thức ăn.

2. Các chủng plasmid mang gen mcr-1 thuộc những nhóm replicon nào và có khả năng truyền ngang không? Các plasmid mang gen mcr-1 phân lập tại xã Thanh Hà chủ yếu thuộc nhóm replicon IncI2 và nhóm IncHI2/IncHI2A/IncN. Qua thử nghiệm tiếp hợp in vitro với chủng vi khuẩn nhận E. coli J53, các plasmid này đã chuyển gen mcr-1 thành công sang chủng nhận, chứng minh tính truyền ngang của tính kháng colistin trong quần thể vi khuẩn.

3. Nghiên cứu có tìm thấy bằng chứng về sự lây truyền E. coli mang gen mcr-1 giữa các thành tố trong cùng hộ gia đình không? Có. Phân tích kiểu gen bằng giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và phân loại MLST đã phát hiện các chủng E. coli mang gen mcr-1 có cùng Sequence Type (ST) chung xuất hiện đồng thời trong các loại mẫu khác nhau (giữa phân người và phân vật nuôi, hoặc giữa thực phẩm và nước) tại cùng một hộ gia đình.

4. Ngoài tính kháng colistin, các chủng vi khuẩn E. coli mang gen mcr-1 có mang thêm các gen kháng kháng sinh nào khác không? Các chủng vi khuẩn này thể hiện kiểu hình đa kháng kháng sinh. Phân tích hệ gen WGS ghi nhận sự đồng hiện diện của nhiều gen kháng thuộc các nhóm beta-lactam (các gen sinh ESBLs), aminoglycosid, quinolon, phenicol, sulfonamid và trimethoprim nằm cùng trên plasmid hoặc nhiễm sắc thể vi khuẩn.

5. Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen mcr-1 được tác giả xác định như thế nào? Gen mcr-1 gắn liền với cấu trúc transposon Tn6330 gồm trình tự ISApl1-PAP2-mcr-1-ISApl1. Phân tích 6 mẫu đại diện cho thấy sự hiện diện của các đoạn xen ISApl1 ở dạng nguyên vẹn hoặc bị mất đoạn ở một đầu, đóng vai trò chính trong quá trình chuyển vị và cố định gen kháng giữa plasmid và nhiễm sắc thể.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Tuyết Mai đã xác định được tỷ lệ lưu hành của vi khuẩn Escherichia coli mang gen mcr-1 kháng colistin trên 4 nhóm mẫu phân người, phân vật nuôi, thực phẩm và nguồn nước tại xã Thanh Hà, tỉnh Hà Nam năm 2015. Bằng việc kết hợp các kỹ thuật vi sinh truyền thống và sinh học phân tử như MALDI-TOF, đo MIC, PFGE, MLST và WGS, công trình đã làm rõ đặc điểm đa kháng thuốc, sự phân bố của gen mcr-1 trên nhiễm sắc thể và trên các nhóm plasmid chủ đạo (IncI2, IncHI2). Kết quả tiếp hợp và phân tích transposon Tn6330 cùng yếu tố xen đoạn ISApl1 cung cấp bằng chứng thực nghiệm về cơ chế truyền ngang tính kháng colistin trong cộng đồng nông thôn. Đây là nguồn dữ liệu khoa học thực địa quan trọng hỗ trợ công tác giám sát kháng thuốc liên ngành y tế - thú y theo định hướng Một sức khỏe tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh 1. Định nghĩa: Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu [6] 1. Cơ chế tác dụng Sau khi vào tế bào, kháng sinh được đưa tới đích tác động sẽ phát huy tác dụng bằng cách: - Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ví dụ nhóm penicillin, nhóm cephalosporin, vancomycin - Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương, đặc biệt là chức năng thẩm thấu chọn lọc, làm cho các thành phần (ion) bên trong tế bào bị thoát ra ngoài, ví dụ nhóm polymyxin, Daptomycin - Ức chế sinh tổng hợp protein, ví dụn nhóm aminoglycoside, nhóm macrolid - Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic, ví dụ nhóm quinolon - Ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hoá cần thiết cho tế bào như kháng sinh nhóm sulfamid [6] Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh 5 1.

Sự đề kháng kháng sinh Kháng sinh có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, nhưng khi trong môi trường có kháng sinh mà vi khuẩn vẫn phát triển thì được coi là sự đề kháng kháng sinh. Vi sinh vật đa kháng kháng sinh (MDRO) là các vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn có khả năng kháng một hoặc hơn một loại kháng sinh. Một số vi khuẩn chỉ kháng một loại kháng sinh vẫn được coi là đa kháng kháng sinh như tụ cầu vàng kháng methicillin (MRSA) hay vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem (CRE)[31] 1. Phân loại đề kháng kháng sinh Có 2 loại đề kháng: là đề kháng giả và đề kháng thật - Đề kháng giả: Đề kháng giả là có biểu hiện là đề kháng nhưng không phải là bản chất, tức là không do nguồn gốc di truyền.

Khi vào trong cơ thể, tác dụng của kháng sinh phụ thuộc vào ba yếu tố là kháng sinh - người bệnh - vi khuẩn. Đề kháng giả có thể do một trong ba yếu tố hoặc có thể kết hợp hai hay thậm chí cả ba yếu tố[6]. - Đề kháng thật: có 2 loại là đề kháng tự nhiên và đề kháng thu được. + Đề kháng tự nhiên do một số loài vi khuẩn không chịu tác dụng của một số kháng sinh nhất định.

aeruginosa không chịu tác dụng của penicilin G, S. aureus không chịu tác dụng của colistin. Hoặc vi khuẩn không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh beta-lactam ức chế sinh tổng hợp vách. Đề kháng tự nhiên thường mang tính chất đặc trưng theo từng loại vi khuẩn.

- Đề kháng thu được do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gen đề kháng để một vi khuẩn đang từ không có gen đề kháng trở thành có gen đề kháng, nghĩa là đang nhạy cảm trở thành có khả năng đề kháng kháng sinh. Các gen đề kháng có thể nằm trên một, một số hoặc tất cả các thành phần di truyền của vi khuẩn gồm nhiễm sắc thể, plasmid và transposon. Đề kháng thu được thường mang tính chất của từng cá thể trong loài[6]. 6 Đề kháng thu được là yếu tố đóng vai trò chính trong việc gia tăng tình hình kháng kháng sinh hiện nay.

Các nghiên cứu về kháng kháng sinh của vi khuẩn luôn tập trung phân tích những biến đổi về mặt di truyền của vi khuẩn do đề kháng thu được làm thay đổi tính đề kháng của vi khuẩn như thế nào 1. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Sự chọn lọc tự nhiên tạo ra những đáp ứng đặc hiệu dẫn đến các đột biến gen để thích nghi. Gần như toàn bộ các kháng sinh sẵn có hiện nay trong thực hành lâm sàng thu nhận được các đột biến gen từ các chất liệu di truyền hoặc những biến đổi của các gen biểu hiện, tạo ra sự kháng thuốc. Việc hiểu rõ nền tảng cơ bản về sinh học và gen học của sự kháng kháng sinh là vần đề rất quan trọng để làm giảm sự lan rộng của kháng kháng sinh cũng như cải thiện việc điều trị trên lâm sàng.

Vi khuẩn thường sử dụng 2 cơ chế chính về mặt gen học để thích ứng và tạo ra sự kháng kháng kháng sinh là: - Đột biến gen thường liên quan tới sự hoạt động của các thuốc kháng sinh; - Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng từ bên ngoài thông qua lây truyền ngang từ các gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGL). Từ các gen kháng kháng sinh này sẽ tổng hợp ra các protein chức năng, tạo ra các cơ chế kháng khác nhau [69]. Đột biến kháng thuốc Đột biến kháng thuốc xảy ra khi có một tập hợp nhỏ trong quần thể vi khuẩn nhạy cảm với thuốc kháng sinh phát triển các đột biến gen ảnh hưởng tới hoạt động của thuốc kháng sinh. Nhóm vi khuẩn này vẫn tồn tại khi có mặt của thuốc kháng sinh.

Khi đột biến xảy ra, kháng sinh đã loại bỏ hết quần thể nhạy cảm và chỉ còn các vi khuẩn kháng kháng sinh chiếm ưu thế. Các đột biến kháng thuốc thông qua các cơ chế sau: - Làm thay đổi đích tác động Vi khuẩn thay đổi đích tác động của kháng sinh do đó kháng sinh không còn vị trí để tác động, ví dụ: A. baumannii kháng lại imipenem và P. aeruginosa kháng ticarcillin và imipenem do chúng thay đổi vị trí gắn vào protein của các kháng sinh.

Cơ chế tác động của các kháng sinh nhóm quinolon là ức chế hoạt động của đoạn 7 gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV của tế bào vi khuẩn. Ví dụ tính kháng quinolon của S. typhi xảy ra do đột biến điểm của các đoạn gen mã hóa quá trình tổng hợp enzym ADN gyrase và topoisomerase IV trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [103, 124]. - Thay đổi các con đường chuyển hóa thông qua sự thay đổi mạng lưới điều hòa Enzym được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh.

Ví dụ với các enzym beta-lactamase có khả năng phá hủy penicillin được báo cáo trước khi được đưa vào sử dụng vào đầu những năm 1940. Sau đó hàng loạt các enzym beta-lactamase có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện. Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzym kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gen mã hóa các enzym này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài [82]. - Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất, giảm sự hấp thu thuốc Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracyclin hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid.

Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam vào vi khuẩn được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này [82]. - Cơ chế bơm đẩy (efflux pump) của các kháng sinh nhóm quinolon của vi khuẩn E. aeruginosa, thường liên quan đến hệ thống vận chuyển ion qua màng tế bào [69]. Như vậy, từ khi tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn đã phát triển các cơ chế kháng thuốc phức tạp để chống lại sự tác động của kháng sinh và tồn tại, quá trình này diễn ra theo sự tiến hóa tự nhiên, trải qua hàng trăm năm.

Sự đề kháng với một loại kháng sinh thường xảy ra qua nhiều nhiều con đường khác nhau. Tuy nhiên, mỗi loài vi khuẩn có một cơ chế kháng ưu tiên khác với các loài khác đối với cùng loại kháng sinh như các vi khuẩn gram âm kháng kháng sinh nhóm beta-lactam 8 thông qua việc sinh enzym beta-lactamase trong khi vi khuẩn gram dương lại kháng qua việc làm biến đổi vùng gắn kháng sinh trên vách, penicillin-binding proteins (PBPs) [69].2: Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 1. Lây truyền ngang từ gen chuyển (Horizontal Gene Transfer-HGT) Tiếp nhận các DNA mã hóa các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua con đường lây truyền ngang từ gen chuyển là con đường rất thường gặp trong kháng kháng sinh. Vi khuẩn thường thu nhận các gen kháng kháng sinh từ bên ngoài vào thông qua 03 cơ chế chính là: biến nạp, tải nạp và tiếp hợp.

Biến nạp là hình thức đơn giản nhất nhưng chỉ có một số ít các vi khuẩn tự nhiên có thể tiếp nhận các DNA ngoại lai và phát triển tính kháng. Các vụ dịch lây lan các vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện thường liên quan đến cơ chế tiếp hợp- một phương pháp chuyển gen hiệu quả thông qua việc tiếp xúc giữa tế bào cho và tế bào nhận thông qua pili giới tính (như E. coli), thường xảy ra với tỷ lệ cao ở đường tiêu hóa dưới ở người khi được điều trị bằng kháng sinh. Tiếp hợp, theo nguyên tắc chung, thường sử dụng các yếu tố di truyền động (mobile genetic elements- MGEs) là phương tiện để chia sẻ các thông tin di truyền có giá trị trong đó có yếu tố kháng kháng sinh.

MGEs quan trọng nhất là plasmid và transposon-có vai trò quan trọng 9 trong việc phát triển và lây lan các vi khuẩn kháng kháng sinh trên lâm sàng. Một trong những cơ chế hiệu quả nhất để tích lũy các gen đề kháng kháng sinh thông qua các integron, integron cũng chứa trình tự ADN đặc biệt cho phép integraz chèn các nhóm gen gọi là cassette vào nhiễm sắc thể, mà trên đó có promoter cho phép các gen cassette mới được biểu hiện [97].3: Các cơ chế truyền gen ngang: tiếp hợp (A), biến nạp (B), tải nạp (C) và thông qua các yếu tố truyền gen (D) (nguồn: Christian von Wintersdorff (2016), Dissemination of Antimicrobial Resistance in Microbial Ecosystems through Horizontal Gene Transfer)[102]. Plasmid: Plasmid là các phân tử ADN vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự nhân lên. Plasmid chứa các gen mã hóa nhiều đặc tính khác nhau giúp tế bào chủ tồn tại được dưới áp lực của chọn lọc.

Một số plasmid có vai trò quan trọng trong vi sinh y học là plasmid mang gen đề kháng kháng sinh và kim loại nặng (R-plasmid), plasmid sinh độc tố, plasmid chứa yếu tố độc lực (khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào). Các plasmid lớn mang bộ gen tra (transfer) hoặc RTF (Resistance Transfer Factor) có khả năng tiếp hợp với vi khuẩn khác và truyền 10 chất liệu di truyền cho vi khuẩn nhận. Plasmid nhỏ có gen mob (mobilization) sẽ được gắn vào một plasmid có tra+ nào đó và cùng được dẫn truyền sang vi khuẩn nhận.