Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus ở bếp ăn tập thể tại Hà Nội

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus tại bếp ăn trường tiểu học bán trú Hà Nội, góp phần nâng cao an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Huyên
• Người hướng dẫn: Ts. Phạm Thế Hải
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được ở bếp ăn tập thể tại một số trường tiểu học bán trú Hà Nội
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sỹ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• I. MỤC LỤC
• I.1. VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• I.2. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn
• I.3. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng
• I.4. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng
• I.5. Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus
• I.5.1. Giới thiệu về Staphylococcus
• I.5.2. Hình thái, đặc điểm sinh hóa
• I.5.3. Điều kiện sinh trưởng
• I.5.4. Sự phân bố
• I.5.5. Khả năng gây bệnh
• I.5.6. Khả năng kháng kháng sinh
• I.5.7. Các yếu tố độc lực và cấu trúc kháng nguyên
• I.6. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus
• I.6.1. Phân tích plasmid
• I.6.2. Phân tích DNA nhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (RE)
• I.6.3. Phương pháp lai đầu dò (Southern blotting)
• I.6.4. Phương pháp điện di trường xung (PFGE)
• I.6.5. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• I.6.6. Multilocus Sequence Typing (MLST)
• I.7. Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus trong và ngoài nước
• II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• II.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
• II.2. Các hóa chất, môi trường và thiết bị thí nghiệm
• II.2.1. Thiết bị thí nghiệm
• II.3. Phương pháp nghiên cứu
• II.3.1. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus
• II.3.2. Tách chiết DNA tổng số
• II.3.3. PCR xác định các gen sinh độc tố ruột của S. aureus
• II.3.4. PFGE xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng
• III. KẾT QUẢ
• III.1. Kết quả phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm
• III.2. Hình thái khuẩn lạc. Hình thái nhuộm Gram
• III.3. Kết quả thử phản ứng coagulase
• III.4. Kết quả phân loại các gen coa và gen sinh độc tố ruột của S. aureus bằng kỹ thuật PCR
• III.5. Kết quả chạy gen coa bằng PCR
• III.6. Kết quả phân loại các gen sinh độc tố ruột của S. aureus
• III.7. Kết quả PFGE xác định đa dạng di truyền giữa các chủng S. aureus
• IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus tại bếp ăn trường tiểu học Hà Nội

Đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus là một vấn đề quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật học, đặc biệt là trong bối cảnh an toàn thực phẩm. Tại bếp ăn trường tiểu học Hà Nội, việc phân lập và phân tích các chủng Staphylococcus aureus giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan và nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về sự đa dạng di truyền mà còn giúp xác định các yếu tố nguy cơ trong môi trường bếp ăn tập thể.

1.1. Đặc điểm sinh học của Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng gây bệnh cao. Chúng thường tồn tại trên da và niêm mạc của con người. Vi khuẩn này có khả năng sản xuất nhiều loại độc tố, trong đó có độc tố ruột, gây ra ngộ độc thực phẩm. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học của Staphylococcus aureus là cần thiết để phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus tại Việt Nam

Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus đang gia tăng tại Việt Nam, đặc biệt trong các bếp ăn tập thể. Theo thống kê, hàng năm có hàng triệu ca ngộ độc thực phẩm, trong đó có nhiều trường hợp liên quan đến vi khuẩn này. Việc nghiên cứu tình hình ngộ độc thực phẩm giúp nâng cao nhận thức và cải thiện quy trình an toàn thực phẩm.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về Staphylococcus aureus, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định sự đa dạng di truyền của chúng. Các yếu tố như điều kiện bảo quản thực phẩm, quy trình chế biến và môi trường sống của vi khuẩn đều ảnh hưởng đến sự phát triển và lây lan của Staphylococcus aureus. Việc phân lập và phân tích các chủng vi khuẩn này là cần thiết để hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa chúng và các yếu tố nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập các chủng Staphylococcus aureus

Phân lập các chủng Staphylococcus aureus từ thực phẩm không phải là một nhiệm vụ dễ dàng. Các yếu tố như sự hiện diện của các vi khuẩn khác, điều kiện môi trường và kỹ thuật phân lập đều có thể ảnh hưởng đến kết quả. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại như PCR và PFGE có thể giúp cải thiện độ chính xác trong việc phân lập và xác định các chủng vi khuẩn.

2.2. Thách thức trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng

Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng Staphylococcus aureus là một thách thức lớn. Các phương pháp phân tích di truyền như MLST và PFGE cần được áp dụng để xác định sự khác biệt giữa các chủng. Việc này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về sự lây lan của vi khuẩn mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

III. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus

Nghiên cứu đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus tại bếp ăn trường tiểu học Hà Nội được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm phân lập vi khuẩn, phân tích gen và đánh giá khả năng kháng kháng sinh. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại giúp cung cấp thông tin chi tiết về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn này.

3.1. Phân lập và xác định các chủng Staphylococcus aureus

Quá trình phân lập các chủng Staphylococcus aureus được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc và các kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật. Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn sẽ được xác định thông qua các phương pháp sinh hóa và di truyền. Việc này giúp đảm bảo tính chính xác trong việc xác định các chủng vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm.

3.2. Phân tích di truyền và khả năng kháng kháng sinh

Phân tích di truyền của Staphylococcus aureus được thực hiện thông qua các kỹ thuật như PCR và PFGE. Các phương pháp này giúp xác định sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các chủng. Đồng thời, việc đánh giá khả năng kháng kháng sinh cũng rất quan trọng để xác định các chủng vi khuẩn có nguy cơ cao trong việc gây ngộ độc thực phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus

Kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus tại bếp ăn trường tiểu học Hà Nội không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về sự lây lan của vi khuẩn mà còn giúp nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm. Các kết quả này có thể được áp dụng trong việc cải thiện quy trình chế biến và bảo quản thực phẩm, từ đó giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

4.1. Kết quả phân lập và phân tích các chủng Staphylococcus aureus

Kết quả phân lập cho thấy sự hiện diện của nhiều chủng Staphylococcus aureus khác nhau trong thực phẩm tại bếp ăn trường tiểu học. Các chủng này có khả năng sản xuất độc tố và có thể gây ngộ độc thực phẩm. Việc phân tích di truyền giúp xác định mối quan hệ giữa các chủng và nguồn gốc lây nhiễm.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong quản lý an toàn thực phẩm

Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp quản lý an toàn thực phẩm hiệu quả hơn. Việc áp dụng các quy trình chế biến và bảo quản thực phẩm an toàn sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus

Nghiên cứu về đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus tại bếp ăn trường tiểu học Hà Nội đã chỉ ra sự cần thiết phải tiếp tục nghiên cứu và cải thiện quy trình an toàn thực phẩm. Tương lai của nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao nhận thức về an toàn thực phẩm mà còn hỗ trợ trong việc phát triển các biện pháp phòng ngừa hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu đa dạng di truyền

Nghiên cứu đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus là rất quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về sự lây lan và nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Việc này giúp các nhà quản lý và chuyên gia y tế có thể đưa ra các biện pháp phòng ngừa hiệu quả.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về đa dạng di truyền của Staphylococcus aureus bằng cách áp dụng các công nghệ mới và phương pháp hiện đại. Việc này sẽ giúp cung cấp thông tin chi tiết hơn về sự lây lan của vi khuẩn và các yếu tố nguy cơ liên quan đến ngộ độc thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các bệnh truyền qua thực phẩm ảnh hưởng đến hàng trăm triệu người mỗi năm trên toàn cầu, trong đó vi khuẩn là tác nhân hàng đầu gây ra khoảng 66,7% các vụ ngộ độc. Tại Việt Nam, các báo cáo y tế ghi nhận trung bình trên 3.000.000 ca ngộ độc thực phẩm mỗi năm, gây tổn thất kinh tế ước tính hơn 200.000.000 USD. Trong số các vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa, Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) được xác định là một trong ba nguyên nhân phổ biến nhất gây bùng phát dịch ngộ độc tại các bếp ăn tập thể, chỉ đứng sau Salmonella và Clostridium perfringens.

Vấn đề kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm học đường tại các đô thị lớn đang đối mặt với nhiều thách thức nghiêm trọng. Tụ cầu vàng có khả năng sinh tổng hợp các ngoại độc tố ruột (Staphylococcal Enterotoxins - SE) cực kỳ bền vững với nhiệt và không bị phân hủy bởi enzyme tiêu hóa, dẫn đến các đợt ngộ độc cấp tính ở trẻ nhỏ. Đề tài "Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập được ở bếp ăn tập thể tại một số trường tiểu học bán trú Hà Nội" được thực hiện nhằm phân lập, định danh phân tử và đánh giá sự phân bố của các gen sinh độc tố ruột.

Nghiên cứu được triển khai trên 105 mẫu thực phẩm và mẫu phết môi trường tại 6 trường tiểu học bán trú thuộc khu vực nội thành Hà Nội. Mục tiêu trọng tâm là ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để phân tích cấu trúc di truyền, từ đó làm rõ con đường lây truyền vi khuẩn trong chuỗi cung ứng suất ăn bán trú. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học thực nghiệm, đóng góp giải pháp định lượng giúp các cơ quan quản lý y tế giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm học đường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng lý thuyết độc lực học vi sinh vật và dịch tễ học phân tử truyền nhiễm để làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh của Staphylococcus aureus. Tụ cầu vàng là cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi, có đường kính 0,5 - 1,5 µm và khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt độ rộng từ 7°C đến 48,5°C cùng nồng độ muối NaCl vượt quá 15%. Yếu tố độc lực chủ chốt của vi khuẩn gồm enzyme coagulase làm đông huyết tương và các siêu kháng nguyên ngoại độc tố ruột (SEA, SEB, SEC, SED). Những enterotoxin này có khối lượng phân tử khoảng 26 - 30 kDa, giữ nguyên hoạt tính sinh học ngay cả khi đun sôi ở 100°C trong 30 phút.

Khung lý thuyết dịch tễ học môi trường cũng được tích hợp để phân tích chu trình lan truyền chéo của vi sinh vật trong môi trường chế biến kín. Năm khái niệm cốt lõi được chuẩn hóa trong nghiên cứu bao gồm: (1) Độc tố ruột tụ cầu (SE); (2) Gen chỉ thị phân tử coa; (3) Quá trình lây nhiễm chéo bề mặt; (4) Điện di trường xung (Pulsed-Field Gel Electrophoresis - PFGE); và (5) Phân loại kiểu gen dịch tễ học.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu được thu thập từ cỡ mẫu gồm 105 mẫu khảo sát thực địa, chia thành 4 nhóm đối tượng: 17 mẫu nguyên liệu sống, 29 mẫu thực phẩm chín (thịt, trứng, cá), 28 mẫu phết bàn tay nhân viên cấp dưỡng và 31 mẫu phết dụng cụ chế biến (thớt sống, thớt chín, khay đựng). Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng để bao quát toàn bộ các điểm kiểm soát tới hạn trong quy trình chế biến một chiều tại 6 trường tiểu học nội thành.

Quy trình phân tích vi sinh tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn TCVN 4830-1:2005 trên môi trường thạch Baird-Parker (BP) bổ sung nhũ tương lòng đỏ trứng 20% và dung dịch kali tellurite 1%, ủ ấm ở 37°C trong 24 đến 48 giờ. Các khuẩn lạc đặc trưng màu đen, bóng lồi, có vòng phân giải trong suốt được định danh khẳng định qua thử nghiệm nhuộm Gram và phản ứng đông huyết tương thỏ.

DNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp enzyme proteinase K kết hợp phenol-chloroform. Kỹ thuật PCR đa mồi được thực hiện để khuếch đại gen coa (987 bp) và 4 gen sinh độc tố ruột sea (520 bp), seb (163 bp), sec (283 bp), sed (384 bp). Cuối cùng, kỹ thuật PFGE sử dụng enzyme cắt giới hạn SmaI được lựa chọn làm phương pháp phân tích di truyền chủ đạo vì đây là "tiêu chuẩn vàng" có độ phân giải cao nhất, cho phép phân tách các đoạn DNA nhiễm sắc thể kích thước từ 10 đến 800 kb trên hệ thống Bio-Rad CHEF-DR III. Timeline nghiên cứu được thực hiện đồng bộ trong giai đoạn 2017 - 2018 tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 105 mẫu khảo sát ban đầu, nghiên cứu đã phân lập được 19 chủng Staphylococcus aureus, tương ứng với tỷ lệ nhiễm chung là 18,1%. Phân bố tỷ lệ nhiễm vi khuẩn có sự chênh lệch rõ rệt giữa các nhóm mẫu:

• Thực phẩm đã qua chế biến trước khi tiêu thụ ghi nhận tỷ lệ nhiễm cao nhất với 27,6% (8/29 mẫu dương tính).
• Mẫu thực phẩm nguyên liệu sống ghi nhận tỷ lệ nhiễm đạt 17,65% (3/17 mẫu).
• Mẫu phết bàn tay của nhân viên trực tiếp chế biến ghi nhận tỷ lệ 14,29% (4/28 mẫu).
• Mẫu dụng cụ chứa đựng và thớt chế biến ghi nhận tỷ lệ 12,9% (4/31 mẫu).

100% (19/19 chủng) đều mang gen coa kích thước 987 bp qua phân tích PCR, xác nhận tính chính xác tuyệt đối của định danh phân tử, đồng thời phát hiện 31,58% (6/19 chủng) cho kết quả âm tính giả trong thử nghiệm đông huyết tương ống nghiệm truyền thống do chỉ tiết coagulase liên kết bề mặt.

Về kiểu gen sinh độc tố ruột, có 26,31% (5/19 chủng) mang ít nhất một gen độc tố. Trong số các chủng dương tính với độc tố, gen sec chiếm tỷ lệ áp đảo với 60,0% (3/5 chủng), trong khi gen sea và seb cùng ghi nhận tỷ lệ 20,0% (1/5 chủng). Hoàn toàn không phát hiện chủng nào mang gen sed hoặc đồng thời mang hai loại gen độc tố. Đáng chú ý, tỷ lệ mang gen độc tố ruột tập trung rất cao ở mẫu bàn tay người chế biến (50,0%) và thớt chế biến (50,0%).

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S. aureus lên tới 27,6% trong thức ăn chín cho thấy tình trạng ô nhiễm thứ cấp diễn ra nghiêm trọng sau công đoạn nấu chín nhiệt độ cao. Khi dữ liệu được biểu diễn qua biểu đồ hình tròn về phân bố gen độc tố và sơ đồ nhánh cây phả hệ (dendrogram) từ phần mềm BioNumerics 6, các chỉ số tương đồng di truyền đã bộc lộ mối liên hệ mật thiết giữa vi khuẩn phân lập từ bàn tay người thao tác với vi khuẩn trên thớt thái và mẫu thức ăn thành phẩm.

Ưu thế vượt trội của gen sec (60,0%) trong nghiên cứu này phản ánh đặc điểm dịch tễ học cục bộ tại các trường tiểu học Hà Nội, khác biệt với một số nghiên cứu quốc tế như công trình của Mohamed M. Zeinhom năm 2015 tại Ai Cập vốn ghi nhận ưu thế của gen sea (trên 40%) trong các sản phẩm từ sữa. Nguồn lây nhiễm chính được xác định xuất phát từ bàn tay người mang vi khuẩn cơ hội hoặc thớt dùng chung cho thực phẩm sống và chín. Độc tố ruột một khi đã hình thành trong khoảng nhiệt độ phòng (20°C - 37°C) sẽ không bị tiêu hủy trong các khâu hâm nóng lại thông thường, tạo nguy cơ ngộ độc tiềm tàng cho học sinh bán trú.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng khoa học thu được, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp cấp thiết nhằm kiểm soát an toàn thực phẩm học đường:

1. Chuẩn hóa quy trình vệ sinh bàn tay nhân viên cấp dưỡng: Ban Giám hiệu và Trạm Y tế trường học cần thiết lập quy chế bắt buộc rửa tay khử khuẩn bằng cồn 70 độ hoặc xà phòng diệt khuẩn trước mọi công đoạn tiếp xúc với thức ăn chín. Đặt mục tiêu đạt 100% tỷ lệ tuân thủ, phấn đấu giảm tỷ lệ mang vi khuẩn tụ cầu trên bàn tay người chế biến xuống dưới mức 2,0% trong vòng 6 tháng đầu triển khai.
2. Triển khai hệ thống phân định dụng cụ sống - chín nghiêm ngặt: Đơn vị quản lý bếp ăn cần áp dụng ngay trong quý đầu tiên bộ quy tắc mã màu cho thớt và dao (màu đỏ cho đồ sống, màu xanh cho đồ chín). Tiến hành thanh trùng dụng cụ bằng nước nóng trên 80°C hoặc tủ sấy tia cực tím sau mỗi chu kỳ phục vụ, loại bỏ hoàn toàn tình trạng nhiễm chéo vi sinh vật giữa các công đoạn.
3. Thiết lập mạng lưới giám sát vi sinh định kỳ: Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm địa phương cần chủ trì lấy mẫu kiểm nghiệm vi sinh bán niên tại 100% bếp ăn bán trú. Giữ vững chỉ tiêu kiểm soát mật độ S. aureus dưới ngưỡng cho phép 10 CFU/g theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia, duy trì liên tục qua từng năm học.
4. Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử vào truy vết dịch tễ: Các trung tâm y tế dự phòng và viện nghiên cứu chuyên ngành cần đưa kỹ thuật PCR đa mồi và PFGE vào quy trình điều tra chuẩn khi xảy ra sự cố ngộ độc. Rút ngắn thời gian xác định nguồn lây và kiểu gen độc tố xuống dưới 24 - 48 giờ để đưa ra biện pháp xử lý y tế kịp thời.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn cao, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

• Cán bộ quản lý y tế học đường và an toàn thực phẩm: Tiếp cận bộ dữ liệu định lượng thực tế để rà soát, tái cấu trúc quy trình giám sát bếp ăn bán trú và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá nguy cơ sinh học tại cơ sở giáo dục.
• Nhà nghiên cứu vi sinh học và dịch tễ học phân tử: Sử dụng tài liệu làm khung tham chiếu phương pháp luận chuẩn về quy trình tách chiết DNA, thiết kế mồi PCR phát hiện gen độc tố và tối ưu hóa thông số điện di trường xung PFGE trên tụ cầu.
• Doanh nghiệp chế biến suất ăn công nghiệp: Ứng dụng các phát hiện về con đường lây nhiễm chéo để hoàn thiện hệ thống phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP), cải tiến quy trình đóng gói và bảo quản nhiệt cho các suất ăn số lượng lớn.
• Giảng viên và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Y tế Công cộng: Khai thác làm tài liệu giảng dạy, học tập chuyên sâu với đầy đủ case study thực nghiệm về dịch tễ vi khuẩn học đường tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus tại các bếp ăn tiểu học Hà Nội trong nghiên cứu là bao nhiêu? Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ nhiễm tụ cầu vàng trung bình là 18,1% (19/105 mẫu khảo sát). Trong đó, nhóm thực phẩm đã qua chế biến sẵn sàng phục vụ học sinh có tỷ lệ nhiễm cao nhất, chiếm 27,6% tổng số mẫu thức ăn chín được kiểm tra.

Tại sao thực phẩm đã nấu chín vẫn ghi nhận tỷ lệ nhiễm vi khuẩn cao hơn thực phẩm sống? Nguyên nhân chủ yếu do hiện tượng ô nhiễm chéo phát sinh sau quá trình nấu. Vi khuẩn từ bàn tay của người chia thức ăn (nhiễm 14,29%) và thớt, khay chứa chưa khử trùng đạt chuẩn (nhiễm 12,9%) đã tái nhiễm trực tiếp vào thức ăn thành phẩm trong thời gian chờ phục vụ.

Gen sinh độc tố ruột nào chiếm ưu thế trong các chủng tụ cầu vàng được phân lập? Trong số 5 chủng mang gen sinh độc tố ruột (chiếm 26,31% tổng số chủng), gen sec chiếm tỷ lệ phổ biến nhất với 60,0% (3/5 chủng). Hai loại gen độc tố còn lại là sea và seb đều chiếm tỷ lệ 20,0%, trong khi gen sed không xuất hiện.

Kỹ thuật PCR có ưu điểm gì vượt trội so với phản ứng đông huyết tương truyền thống? Phản ứng sinh hóa đông huyết tương ống nghiệm truyền thống đã bỏ sót 31,58% (6/19 chủng) do vi khuẩn chỉ biểu hiện coagulase liên kết. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen coa (987 bp) giúp khẳng định chính xác 100% các chủng S. aureus mà không bị ảnh hưởng bởi biến thiên kiểu hình.

Độc tố ruột của Staphylococcus aureus gây nguy hiểm cho học sinh bán trú như thế nào? Độc tố ruột tụ cầu là siêu kháng nguyên có tính bền nhiệt cực cao, không bị phá hủy ở nhiệt độ đun nấu thông thường. Khi trẻ tiêu thụ thức ăn chứa độc tố, chỉ sau 2 đến 6 giờ sẽ xuất hiện triệu chứng nôn mửa dữ dội, đau quặn bụng và mất nước cấp tính cần can thiệp y tế.

Kết luận

Luận văn đã giải quyết toàn diện bài toán đánh giá dịch tễ học phân tử của Staphylococcus aureus trong môi trường học đường qua các kết quả then chốt:

• Khẳng định tỷ lệ hiện diện của tụ cầu vàng là 18,1% trên 105 mẫu khảo sát, với điểm nóng ô nhiễm tập trung tại khâu thực phẩm sau chế biến (27,6%).
• Chứng minh 100% chủng phân lập mang gen chỉ thị coa, đồng thời chỉ ra tỷ lệ âm tính giả 31,58% của phương pháp sinh hóa truyền thống.
• Xác định 26,31% chủng mang gen sinh ngoại độc tố ruột nguy hiểm, trong đó gen sec chiếm ưu thế tuyệt đối với tỷ lệ 60,0%.
• Làm rõ bàn tay nhân viên cấp dưỡng và thớt chế biến (đều có tỷ lệ mang gen độc tố 50,0%) là hai nguồn phát tán lây nhiễm chéo chính.
• Khẳng định tính ưu việt của phương pháp PFGE như một công cụ chuẩn hóa cao trong việc truy vết phả hệ di truyền vi sinh vật gây ngộ độc.

Công trình tạo bước đột phá trong việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào kiểm soát an toàn thực phẩm bán trú tại Việt Nam. Các đơn vị quản lý giáo dục và y tế cơ sở cần khẩn trương áp dụng ngay các khuyến nghị kỹ thuật này trong năm học tới nhằm bảo vệ tối đa sức khỏe cho thế hệ học sinh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

I HỌ QU GI H N I TRƢ NG I HỌ HO HỌ TỰ NHI N ----------------------- Nguyễn Thị Thu Huyên SỰ D NG DI TRUYỀN Ủ Á HỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ƢỢ Ở BẾP ĂN TẬP THỂ T I MỘT SỐ TRƢ NG TIỂU HỌ BÁN TRÚ HÀ NỘI LUẬN V N TH S KHO HỌ Hà Nội – Năm 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] I HỌ QU GI H N I TRƢ NG I HỌ HO HỌ TỰ NHI N ----------------------- Nguyễn Thị Thu Huyên SỰ D NG DI TRUYỀN Ủ Á HỦNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHÂN LẬP ƢỢ Ở BẾP ĂN TẬP THỂ T I MỘT SỐ TRƢ NG TIỂU HỌ BÁN TRÚ HÀ NỘI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN V N TH S KHO HỌ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌ : TS. PH M THẾ HẢI Hà Nội – Năm 2018 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 Lời cảm ơn Đối với mỗi học viên cao học uận văn tốt nghiệp là một công trình nghiên cứu khoa học nhỏ nhưng ại mang ý nghĩa vô cùng to ớn đánh dấu một bước trưởng thành của mỗi người trên con đường nghiên cứu khoa học. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thế Hải – Bộ môn Vi sinh vật học, khoa Sinh học Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQGHN người đã dành nhiều thời gian, công sức, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Giang – Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia người đã chỉ bảo giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị thuộc khoa Vi sinh vật học, Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã chỉ bảo giúp đỡ tôi tận tình và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin cảm ơn các cô các chị phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã hướng dẫn tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã uôn bên cạnh, động viên, khuyến khích, chia sẻ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập để tôi đạt được kết quả như ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 10 năm 2018 Nguyễn Thị Thu Huyên LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 L I M O N Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Thu Huyên LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 MỤ LỤ ẶT VẤN Ề.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng. Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng.

Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus. Giới thiệu về Staphylococcus. Hình thái, đặc điểm sinh hóa. iều kiện sinh trƣởng.

Sự phân bố. Khả năng gây bệnh. Khả năng kháng kháng sinh. ác yếu tố độc lực và cấu trúc kháng nguyên.

Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền Staphylococcus aureus. Phân tích plasmid. Phân tích DN nhiễm sắc thể sau khi xử lý enzyme cắt giới hạn (RE ). Phƣơng pháp lai đầu dò (Southern blotting).

Phƣơng pháp điện di trƣờng xung (PFGE). ác kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (P R). Multilocus Sequence Typing (MLST). Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus trong và ngoài nƣớc.

22 HƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU. ối tƣợng và địa điểm nghiên cứu. Các hóa chất, môi trƣờng và thiết bị thí nghiệm. Thiết bị thí nghiệm.

Phƣơng pháp nghiên cứu. 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 2. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus. Tách chiết DN tổng số.

P R xác định các gen sinh độc tố ruột của S. PFGE xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng. 29 HƢƠNG III: KẾT QUẢ. Kết quả phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm.

Hình thái khuẩn lạc. Hình thái nhuộm Gram. Kết quả thử phản ứng coagulase. Kết quả phân loại các gen coa và gen sinh độc tố ruột của S.

aureus bằng kỹ thuật PCR. Kết quả chạy gen coa bằng P R. Kết quả phân loại các gen sinh độc tố ruột của S. Kết quả PFGE xác định đa dạng di truyền giữa các chủng S.

43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleic triphosphate ET Exfoliative toxin ( ộc tố chốc lở da) MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi) PFGE Pulsed-field Gel Electroforesis ( iện di trƣờng xung) SE Staphylococcal Enterotoxin ( ộc tố ruột tụ cầu) TSST Toxin Shock Syndrome Toxin ( ộc tố hội chứng sốc) VRSA Vancomicin resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Vancomicin) LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 D NH MỤ BẢNG BIỂU Bảng 1. Các tác nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm ở Pháp năm 1999-2000 (%) [30].

3 Bảng 2: Các loại hóa chất. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR [62]. Thành phần các chất ủ enzyme cắt giới hạn. Số lƣợng các chủng S.

aureus trên các đối tƣợng mẫu. Nguồn gốc các chủng S. 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 D NH MỤ HÌNH ẢNH Hình 1. Hình thái nhuộm Gram của các tế bào Staphylococcus aureus [20].

Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy [20]. Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng Baird Parker [10].

Khuẩn lạc của S. aureus trên môi trƣờng MSA [35]. Vị trí nhiễm trùng và bệnh do Staphylococcus aureus gây ra [59]. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus [59].

Tạo plug chủng vi khuẩn. Rửa plug bằng đệm. Cắt plug thành các miếng nhỏ. Hình ảnh mô tả đổ gel điện di.

iện di gel dƣới trƣờng xung. Khuẩn lạc của Staphylococcus aureus trên môi trƣờng Baird-Parker. Kết quả nhuộm Gram. Kết quả thử phản ứng đông huyết tƣơng của S.

Kết quả điện di sản phẩm chạy PCR gen coa. Kết quả điện di các chủng dƣơng tính với gen sinh độc tố. Biểu đồ phân bố các chủng S. aureus theo gen sinh độc tố.

Kết quả điện di trƣờng xung (PFGE). Kết quả phân tích quan hệ các chủng bằng PFGE. 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 ẶT VẤN Ề Hiện nay, ngộ độc thực phẩm, bao gồm ngộ độc do nhiễm khuẩn đang là vấn đề nghiêm trọng trên thế giới, đặc biệt là ở Việt Nam. Hàng năm, các bệnh lây truyền qua thực phẩm ảnh hƣởng tới hàng triệu ngƣời, nhiều ngƣời trong số đó bị những rối loạn nghiêm trọng, biến chứng lâu dài hoặc tử vong do ăn phải thực phẩm không an toàn.

ác bệnh lây truyền qua thực phẩm là mối quan tâm lớn trên toàn thế giới. Cho đến nay, khoảng 250 bệnh lây truyền qua thực phẩm khác nhau đã đƣợc mô tả. Ở hầu hết các nƣớc, vi khuẩn là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh lây truyền qua thực phẩm, chiếm khoảng 2/3 số dịch bệnh. Nhiều vi khuẩn (bao gồm cả vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm) sản sinh các độc tố gây ngộ độc thực phẩm, dẫn đến các triệu chứng khác nhau, từ rối loạn tiêu hóa đến tê liệt và chết.

Trong số những vi khuẩn ấy, phải kể đến Salmonella, Clostridium perfringen, Clostridium botulinum, Bacillus cereus…và đặc biệt là Staphylococcus aureus (hay còn gọi là tụ cầu vàng). aureus đƣợc xem là một trong ba tác nhân chính gây ngộ thực phẩm chính ở nhiều nƣớc trên thế giới, chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringen. aureus là một thành viên của hệ vi khuẩn ở ngƣời. Phần lớn các chủng đều có một hay một số gen độc lực liên quan đến tình trạng nhiễm trùng hay các bệnh lý khác nhau.

húng mang một số gen chịu trách nhiệm sản xuất các độc tố ruột, độc tố gây hội chứng sốc, hay một số gen liên quan đến hiện tƣợng kháng kháng sinh…. Trên thế giới, ngày càng có nhiều nghiên cứu dịch tễ học phân tử của S. aureus và mối liên quan giữa các yếu tố độc lực, các kiểu gen…. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu là kết quả của việc tiêu thụ thực phẩm có chứa độc tố ruột enterotoxin của loài vi khuẩn này.

aureus là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm. Do khí hậu nóng ẩm, thiếu các điều kiện bảo quản phù hợp, S. aureus xuất hiện với số lƣợng lớn trong thực phẩm. Nƣớc ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu khoa học về tụ cầu của một số nhóm tác giả.

Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ dừng lại ở mức độ tìm hiểu đặc tính của chúng, xác định các kiểu gen độc tố mà chƣa đi sâu vào việc đánh giá mối quan hệ di truyền của chúng. Và hiện vẫn chƣa có nhóm nghiên cứu nào áp dụng kỹ thuật PFGE để điều tra 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 dịch tễ, đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng. Do đó, đề tài “Sự đa dạng di truyền của các chủng Staphylococcus aureus phân lập đƣợc ở bếp ăn tập thể tại một số trƣờng tiểu học bán trú Hà Nội” đƣợc thực hiện với mục tiêu: 1. Phân lập các chủng Staphylococcus aureus trong thực phẩm tại một số bếp ăn tập thể.

ánh giá sự đa dạng di truyền giữa các chủng S. Từ đó xác định con đƣờng lây nhiễm tụ cầu vàng trong thực phẩm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Huyên – K24 HƢƠNG I. TỔNG QU N TÀI LIỆU 1.

Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn ác bệnh gây ra bởi thực phẩm là mối quan tâm hàng đầu trên thế giới.