Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu Trần thị hoa mai tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng aspergillus, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Trần Thị Hoa Mai
• Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Mai Anh
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Chiết Xuất Và Tinh Sạch Hoạt Chất Ức Chế Alpha Glucosidase Từ Aspergillus Niger
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Bệnh Đái tháo đường
• 1.1.1. Khái niệm
• 1.1.2. Phân loại
• 1.2. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng
• 1.2.1. Cơ chế của ĐTĐ typ 1
• 1.2.2. Cơ chế của ĐTĐ typ 2
• 1.2.3. Biến chứng của ĐTĐ
• 1.3. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường
• 1.3.1. Mục tiêu điều trị
• 1.3.2. Điều trị ĐTĐ typ 1
• 1.3.3. Điều trị ĐTĐ typ 2
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Thiết bị thí nghiệm
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Nội dung nghiên cứu
• 2.7. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Nuôi cấy chủng giống
• 2.7.2. Xác định hoạt tính chất ức chế α-glucosidase
• 2.7.3. Tách chiết, tinh sạch hoạt chất ức chế enzym α-glucosidase
• 2.7.4. Xác định giá trị IC50
• 2.7.5. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy và sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase của chủng A.
• 3.2. Tách chiết hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.
• 3.3. Tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.
• 3.4. Tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC-031 của pha nước qua cột sắc ký lọc gel
• 3.5. Kết quả chọn lựa các hệ dung môi pha động chạy SK cột silica gel
• 3.6. Tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A.niger VTCC-03 của pha dung môi qua cột sắc ký silica gel 60
• 3.7. Xác định IC50 của mẫu có hoạt tính ức chế α-glucosidase
• 3.8. Về kết quả tách chiết hoạt chất AGIs từ chủng A.
• 3.9. Về kết quả tinh sạch AGIs từ chủng A.
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về chiết xuất hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger

Chiết xuất và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng nấm Aspergillus niger đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường. Hoạt chất này có khả năng làm giảm đường huyết sau ăn, giúp kiểm soát bệnh hiệu quả hơn. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng các chất ức chế alpha glucosidase có thể giảm thiểu các biến chứng liên quan đến bệnh đái tháo đường, đồng thời mở ra hướng đi mới trong phát triển thuốc điều trị. Việc chiết xuất từ nấm Aspergillus niger không chỉ mang lại hiệu quả cao mà còn an toàn cho người sử dụng.

1.1. Khái niệm về hoạt chất ức chế alpha glucosidase

Hoạt chất ức chế alpha glucosidase là những hợp chất có khả năng ức chế enzym alpha glucosidase, từ đó làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbohydrate. Điều này giúp giảm mức đường huyết sau ăn, đặc biệt quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường typ 2. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất ức chế này có thể cải thiện tình trạng bệnh nhân và giảm nguy cơ biến chứng.

1.2. Tại sao chọn Aspergillus niger cho nghiên cứu

Aspergillus niger là một trong những chủng nấm phổ biến và dễ nuôi cấy. Nấm này có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme và hoạt chất sinh học, trong đó có các chất ức chế alpha glucosidase. Nghiên cứu cho thấy rằng các hoạt chất chiết xuất từ Aspergillus niger có hiệu quả cao trong việc ức chế enzym này, đồng thời có ít tác dụng phụ hơn so với các thuốc truyền thống.

II. Vấn đề và thách thức trong chiết xuất hoạt chất từ Aspergillus niger

Mặc dù việc chiết xuất hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong quá trình nghiên cứu và phát triển. Một trong những vấn đề chính là việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất để đạt được hiệu suất cao nhất. Ngoài ra, việc xác định các điều kiện nuôi cấy và môi trường thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng hoạt chất chiết xuất.

2.1. Thách thức trong quy trình chiết xuất

Quy trình chiết xuất hoạt chất từ nấm Aspergillus niger thường gặp khó khăn trong việc lựa chọn dung môi và điều kiện chiết xuất. Việc sử dụng dung môi không phù hợp có thể dẫn đến hiệu suất chiết xuất thấp và làm giảm chất lượng hoạt chất. Do đó, cần phải nghiên cứu và thử nghiệm nhiều phương pháp khác nhau để tìm ra quy trình tối ưu nhất.

2.2. Vấn đề về tính ổn định của hoạt chất

Tính ổn định của hoạt chất ức chế alpha glucosidase sau khi chiết xuất cũng là một vấn đề cần được quan tâm. Các yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng và độ pH có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của hoạt chất. Do đó, việc bảo quản và xử lý hoạt chất sau khi chiết xuất là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị.

III. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase

Để chiết xuất và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm chiết xuất lỏng-lỏng, sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất.

3.1. Phương pháp chiết xuất lỏng lỏng

Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để tách chiết hoạt chất từ nấm. Kỹ thuật này cho phép tách biệt các hợp chất dựa trên độ hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau. Việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng để đạt được hiệu suất chiết xuất cao nhất.

3.2. Sắc ký cột trong tinh sạch hoạt chất

Sắc ký cột là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase sau khi chiết xuất. Phương pháp này cho phép tách biệt các hợp chất dựa trên kích thước và tính chất hóa học của chúng. Sử dụng sắc ký cột silica gel là một trong những kỹ thuật phổ biến để đạt được độ tinh khiết cao cho hoạt chất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hoạt chất ức chế alpha glucosidase

Hoạt chất ức chế alpha glucosidase chiết xuất từ Aspergillus niger có nhiều ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh đái tháo đường. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt chất này có thể giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả, giảm thiểu các biến chứng liên quan đến bệnh. Ngoài ra, việc phát triển các sản phẩm từ hoạt chất này cũng mở ra cơ hội mới cho ngành dược phẩm.

4.1. Tác dụng của hoạt chất trong điều trị đái tháo đường

Hoạt chất ức chế alpha glucosidase có tác dụng làm giảm đường huyết sau ăn, giúp kiểm soát tình trạng bệnh đái tháo đường. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng hoạt chất này có thể giảm thiểu nguy cơ biến chứng tim mạch và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.2. Tiềm năng phát triển sản phẩm mới

Việc chiết xuất và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm mới trong ngành dược phẩm. Các sản phẩm này không chỉ có hiệu quả cao mà còn an toàn cho người sử dụng, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong điều trị bệnh đái tháo đường.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu hoạt chất ức chế alpha glucosidase

Nghiên cứu về chiết xuất và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger đã mở ra nhiều triển vọng trong điều trị bệnh đái tháo đường. Mặc dù còn nhiều thách thức trong quy trình chiết xuất và tinh sạch, nhưng với sự phát triển của công nghệ và nghiên cứu, tương lai của hoạt chất này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành y tế.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ Aspergillus niger sẽ tiếp tục được mở rộng trong tương lai. Các nhà khoa học sẽ tiếp tục tìm kiếm các phương pháp chiết xuất và tinh sạch hiệu quả hơn, đồng thời nghiên cứu thêm về cơ chế tác động của hoạt chất này trong cơ thể.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị bệnh đái tháo đường

Việc phát triển các sản phẩm từ hoạt chất ức chế alpha glucosidase không chỉ giúp cải thiện tình trạng bệnh đái tháo đường mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý liên quan đến chuyển hóa. Điều này sẽ góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân và giảm gánh nặng cho hệ thống y tế.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đái tháo đường là bệnh lý rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết, bắt nguồn từ sự suy giảm tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc phối hợp cả hai cơ chế. Theo số liệu của Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF) năm 2021, toàn cầu có khoảng 537 triệu người trưởng thành mắc bệnh và dự báo con số này sẽ tăng lên 783 triệu người vào năm 2045. Đái tháo đường được xem là đại dịch không lây nhiễm với tỷ lệ tử vong đứng thứ ba sau bệnh tim mạch và ung thư, đồng thời là yếu tố thúc đẩy tiên lượng nặng ở bệnh nhân nhiễm khuẩn và mắc COVID-19.

Trong phác đồ điều trị đái tháo đường typ 2, nhóm chất ức chế enzym α-glucosidase (AGIs) giữ vai trò kiểm soát đường huyết sau ăn thông qua cơ chế làm chậm quá trình thủy phân carbohydrate tại ruột non mà không kích thích tế bào beta tụy tiết insulin, nhờ đó tránh được nguy cơ hạ đường huyết quá mức. Tuy nhiên, các thuốc AGIs tổng hợp thương mại hiện hành như acarbose, miglitol hay voglibose thường gây ra các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa (đầy hơi, sôi bụng, tiêu chảy) và tiềm ẩn nguy cơ tăng transaminase gan. Xu hướng nghiên cứu dược phẩm hiện nay tập trung khai thác các chất ức chế có nguồn gốc tự nhiên từ vi sinh vật nhờ ưu thế sinh trưởng nhanh, quy trình nuôi cấy ổn định và khả năng tạo ra các hoạt chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng. Trong đó, chi nấm sợi Aspergillus là đối tượng giàu tiềm năng đã được thế giới nghiên cứu nhiều, nhưng tại Việt Nam các công bố về chủng Aspergillus niger sinh tổng hợp AGIs còn rất hạn chế, mới dừng ở các kết quả sàng lọc ban đầu của Phạm Minh Hồng (2020) và Bùi Hồng Sơn (2021).

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận tốt nghiệp dược sĩ thực hiện 2 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Lựa chọn được dung môi tách chiết hợp chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger VTCC 031.
2. Lựa chọn được điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger VTCC 031.

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC 031 do Trung tâm bảo tồn chủng giống VTCC (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) lưu giữ và cung cấp.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 6 năm 2022.
  • Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ sinh học Enzym thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) phối hợp với Bộ môn Hóa Sinh (Trường Đại học Dược Hà Nội).
  • Kinh phí hỗ trợ: Đề tài trực thuộc dự án "Phân lập, tuyển chọn và tinh sạch một số hoạt chất thứ cấp mới ức chế α-glucosidase định hướng ứng dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường typ II từ các chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam" (mã số 01/19-21).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu được thiết lập dựa trên cơ sở bệnh sinh đái tháo đường theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) và cơ chế xúc tác của enzym α-glucosidase (EC 3.2.1.20). Phân tử α-glucosidase gồm hai tiểu phần N tận và C tận có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, thuộc họ glycoside hydrolase GH31 phân nhóm 1 mang chuỗi amino acid xúc tác đặc trưng WiDMNE. Enzym này thủy phân liên kết α-1,4-glucosid ở đầu không khử của cơ chất disaccharid và oligosaccharid tại diềm bàn chải ruột non. Các chất ức chế AGIs cạnh tranh vị trí hoạt động của enzym, làm giảm hấp thu glucose và thúc đẩy giải phóng hormone GLP-1 từ tế bào L ở hồi tràng. Về mặt phân loại sinh học, chủng nấm sợi Aspergillus niger thuộc họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes; là loài nấm vi sinh được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận an toàn (GRAS) và có hoạt lực tiết mạnh các enzym và chất chuyển hóa thứ cấp ra môi trường ngoại bào.

Khóa luận triển khai các phương pháp thực nghiệm chuyên sâu bao gồm:

• Phương pháp vi sinh: Hoạt hóa chủng giống trên thạch đĩa PDA (bột khoai tây 20%, D-glucose 2%, agar 2%, pH 7,0; 30°C trong 72 giờ). Lên men chìm trong bình tam giác với môi trường lỏng gồm D-glucose 5%, cao malt 1%, điều chỉnh pH 5,0 bằng dung dịch HCl 0,1 M và NaOH 0,1 M; nuôi cấy ở 37°C trên máy lắc 200 vòng/phút trong 7 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C để thu dịch lên men ngoại bào.
• Phương pháp đo hoạt tính sinh học: Đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase dựa trên quy trình của Kim và cộng sự. Sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (pNPG) 5 mM trong đệm natri phosphat 0,1 M pH 6,9 kết hợp với enzym α-glucosidase (1–2 U/ml). Đo mật độ quang học sản phẩm thủy phân p-nitrophenol tại bước sóng 405 nm ở các thời điểm 0 phút và 5 phút bằng máy ELISA reader để tính toán phần trăm ức chế.
• Phương pháp tách chiết phân đoạn: Chiết lỏng - lỏng dịch lên men với các dung môi có độ phân cực giảm dần (n-butanol, ethyl acetat, chloroform, dichloromethane, n-hexan) theo tỷ lệ thể tích dịch chiết : dung môi là 1:1, chiết 3 lần trên máy lắc trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng, thu hồi riêng rẽ pha nước và pha hữu cơ.
• Phương pháp sắc ký tinh sạch:
  • Pha nước: Khảo sát tinh sạch qua 3 hệ cột sắc ký lọc gel kích thước phân tử gồm Sephacryl S-200, Sephadex G-100 và Sephadex G-25; đệm rửa giải là natri phosphat 0,05 M, tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thu 12 phân đoạn (1,5 ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng silica gel 60 F254 với hệ dung môi isopropanol : acid acetic : nước (4:1:1, v/v) và phát hiện vết bằng thuốc thử ninhydrin 2%.
  • Pha dung môi: Cắn n-butanol thu được sau khi cất cô quay ở 60°C được hòa tan trong chloroform để loại tạp không tan, tiếp tục cô quay và hòa cắn vào methanol để tạo dịch lên cột. Tinh sạch qua cột sắc ký silica gel 60 (kích thước 52 x 2 cm), tốc độ rửa giải 25 ml/giờ, thu 20 phân đoạn (2 ml/phân đoạn). Khảo sát 5 hệ dung môi pha động trên bản mỏng TLC và phát hiện vết bằng hơi iod.
• Phương pháp xác định giá trị IC50: Thử nghiệm hoạt tính ức chế ở các dải nồng độ pha loãng khác nhau, dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa nồng độ và phần trăm ức chế trên phần mềm Microsoft Excel 2016, đối chiếu song song với chất chuẩn acarbose tinh khiết (Sigma).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các cơ sở lý luận về bệnh đái tháo đường, cập nhật tiêu chuẩn phân loại bệnh của ADA (2021) và mục tiêu điều trị ở người trưởng thành (HbA1c < 7%, glucose huyết tương đói 80–130 mg/dL, đỉnh sau ăn < 180 mg/dL). Tác giả phân tích cơ chế bệnh sinh, biến chứng cấp tính và mạn tính (tổn thương thần kinh 40–45%, bệnh thận 20–40%, mù lòa do tổn thương võng mạc chiếm 2,6% toàn cầu). Nội dung đi sâu tổng kết cấu trúc phân tử của α-glucosidase, cơ chế ức chế cạnh tranh của các nhóm AGIs và tổng hợp 9 nhóm thuốc hạ đường huyết đường uống. Đồng thời, chương 1 phân loại các hoạt chất AGIs tự nhiên theo cấu trúc hóa học (hợp chất giả đường monosaccharide, azasugar, thiosugar và hợp chất phi glycosyl) phân lập từ thực vật (vasicine, deoxynojirimycin, flavonoid glycoside) và từ vi sinh vật (Actinoplanes sp., Bacillus subtilis). Về chủng nấm sợi Aspergillus niger, văn bản tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, điều kiện sinh trưởng (khoảng nhiệt độ 6–47°C, pH 1,4–9,8, hoạt độ nước tối thiểu 0,88) và điểm lại các công trình quốc tế phân lập AGIs từ chi Aspergillus (A. terreus, A. oryzae, A. awamori, A. fumigatus).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng nấm Aspergillus niger VTCC 031, toàn bộ danh mục hóa chất tinh khiết của các hãng Merck, Sigma, Bio Basic, Xilong cùng hệ thống trang thiết bị thí nghiệm (máy ELISA reader, máy cất cô quay Buchi, máy ly tâm lạnh Hitachi, cân phân tích Sartorius). Tác giả chi tiết hóa thành phần môi trường nuôi cấy hoạt hóa PDA và môi trường lên men lỏng D-glucose 5% bổ sung cao malt 1%. Nội dung chương chuẩn hóa quy trình xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase theo phản ứng so màu pNPG; thiết lập sơ đồ khối chiết lỏng - lỏng phân đoạn 5 dung môi; mô tả quy trình nạp mẫu và rửa giải trên các cột sắc ký gel (Sephacryl S-200, Sephadex G-100, Sephadex G-25) và sắc ký cột silica gel 60. Toàn bộ các công thức toán học xác định phần trăm ức chế enzym, quy trình cạo vết TLC điều chế và phương pháp hồi quy tuyến tính xác định nồng độ ức chế 50% (IC50) được văn bản chuẩn hóa chặt chẽ.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương thực nghiệm phản ánh toàn diện các số liệu thu được qua từng công đoạn nghiên cứu:

• Sinh tổng hợp hoạt chất: Dịch nuôi cấy ngoại bào chủng A. niger VTCC 031 sau 7 ngày lên men đạt hoạt tính ức chế α-glucosidase là 67,24% (độ biến thiên mật độ quang ΔA của mẫu đối chứng là 0,019; mẫu thí nghiệm là 0,006).
• Tách chiết lỏng - lỏng: Kết quả khảo sát 5 dung môi chiết xuất cho thấy ở pha hữu cơ, n-butanol cho hiệu quả cao nhất với hoạt tính ức chế đạt 37,50% (các dung môi ethyl acetat, chloroform, dichloromethane, n-hexan dao động từ 8,82% đến 25,46%). Ở pha nước sau chiết, mẫu chiết với ethyl acetat cho hoạt tính ức chế cao nhất đạt 64,71% (các mẫu còn lại dao động từ 55,15% đến 58,41%). Hoạt chất AGIs thể hiện sự phân bố ở cả hai pha.
• Tinh sạch pha nước: Pha nước sau chiết ethyl acetat qua 3 loại cột lọc gel đều cho hoạt tính tập trung ở các phân đoạn từ 4 đến 10, mạnh nhất tại phân đoạn 6–8. Giá trị hoạt tính cực đại của phân đoạn số 7 lần lượt là 46,63% (Sephacryl S-200), 70,52% (Sephadex G-100) và 64,51% (Sephadex G-25). Sắc ký bản mỏng TLC các phân đoạn có hoạt tính hiện màu bằng thuốc thử ninhydrin 2% xuất hiện các vết màu hồng tím, cho thấy hoạt chất có bản chất peptit hoặc protein phân tử lượng thấp. Cột Sephadex G-25 thể hiện khả năng loại tạp và tách vết gọn rõ nhất.
• Khảo sát hệ dung môi pha động TLC pha dung môi: Đánh giá 5 hệ dung môi chạy bản mỏng dịch chiết n-butanol và dịch lên cột:
  • Hệ I (n-BuOH : acid acetic : H2O = 3:1:1) và Hệ II (5:1:4): Vết bị kéo dài, phân tách không rõ ràng.
  • Hệ III (n-BuOH : acid acetic : EtOAc : H2O = 3:1:3:1): Phân tách vết gọn và rõ.
  • Hệ IV (3:1:5:1): Khả năng tách kém hơn hệ III.
  • Hệ V (Hexan : EtOAc : acid acetic = 1:4:2): Tách vết rõ nhất nhưng n-hexan kém phân cực không kéo được toàn bộ chất khỏi điểm chấm mẫu, đồng thời có độc tính cao nên không chọn. Hệ III được chọn làm pha động lên cột silica gel 60.
• Tinh sạch qua cột silica gel 60 và cạo vết điều chế: Dịch phân đoạn 11 sau khi qua cột lần 1 xuất hiện 3 vết trên TLC. Tác giả tiến hành kỹ thuật cạo vết bản mỏng điều chế lặp lại 10 lần, thu được 3 vết: vết TLC1 (Rf = 0,24), vết TLC2 (Rf = 0,65) và vết TLC3 (Rf = 0,94). Kiểm tra hoạt tính sinh học khẳng định duy nhất vết TLC2 có hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 39,31%, hai vết còn lại không thể hiện hoạt tính.
• Xác định IC50: Đo hoạt tính của mẫu TLC2 ở 5 mức nồng độ (333,33 đến 1666,67 µg/ml) xác định được phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng với giá trị IC50 = 7873,72 µg/ml. Chất chuẩn acarbose thử nghiệm ở dải nồng độ 10 đến 90 µg/ml xác định được giá trị IC50 = 30,83 µg/ml. Phần bàn luận phân tích nguyên nhân giá trị IC50 của mẫu nghiên cứu cao hơn acarbose là do mẫu mới qua tinh chế sơ bộ lần 1, lượng mẫu cạo vết thu được quá nhỏ (0,0005 g) và còn chứa tạp chất cản trở.

Kết quả và đóng góp thực nghiệm

Công trình đã ghi nhận các số liệu thực nghiệm gốc và định lượng cụ thể qua các giai đoạn nghiên cứu:

Giai đoạn mẫu	Khối lượng cắn khô (g)	Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%)
Dịch lên men ban đầu	2,52	67,24
Dịch chiết n-butanol	1,23	37,50
Phân đoạn vết TLC2	0,0005	39,31

Số liệu thực nghiệm xác định đường chuẩn IC50 của mẫu TLC2 và acarbose đối chứng được tổng hợp chi tiết:

Mẫu thử	Nồng độ thử nghiệm (µg/ml)	Hoạt tính ức chế (%)	Giá trị IC50 tính toán
Vết TLC2	333,33 666,67 1000,00 1333,33 1666,67	2,08 3,74 5,38 8,56 10,35	7873,72 µg/ml
Acarbose chuẩn	10,00 30,00 50,00 70,00 90,00	34,18 51,20 63,32 77,27 90,31	30,83 µg/ml

• Giải pháp kỹ thuật đề xuất:
  • Đề xuất quy trình chiết phân đoạn 2 pha: Chiết bằng n-butanol để thu nhận hoạt chất phân cực trung bình ở pha hữu cơ và chiết bằng ethyl acetat để giữ lại các hoạt chất phân cực cao trong pha nước.
  • Xác định cột Sephadex G-25 là vật liệu tối ưu để loại tạp cho các hoạt chất ức chế α-glucosidase bản chất protein/peptit trong pha nước.
  • Thiết lập thành công tỷ lệ hệ dung môi pha động n-butanol : acid acetic : ethyl acetat : nước (3:1:3:1, v/v) cho sắc ký cột silica gel 60.
• Đóng góp khoa học: Khóa luận cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về quy trình chiết tách và tinh sạch sơ bộ hoạt chất AGIs từ chủng nấm Aspergillus niger VTCC 031 phân lập tại Việt Nam, chứng minh dịch lên men ngoại bào của chủng này chứa đồng thời cả các chất ức chế bản chất peptit/protein tan trong nước và các hoạt chất chuyển hóa thứ cấp tan trong dung môi hữu cơ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

Khóa luận tự chỉ ra các hạn chế kỹ thuật trong phạm vi thực nghiệm:

• Quá trình tinh sạch pha dung môi mới dừng lại ở sắc ký cột silica gel 60 lần thứ nhất kết hợp cạo vết bản mỏng thủ công; lượng cắn vết TLC2 thu được rất nhỏ (0,0005 g) và chưa loại bỏ được hoàn toàn tạp chất, dẫn đến giá trị IC50 thực nghiệm còn cao hơn nhiều so với acarbose tinh khiết.
• Có hiện tượng suy giảm hoạt tính ức chế từ dịch lên men ban đầu (67,24%) xuống dịch chiết n-butanol (37,50%) và vết TLC2 (39,31%), được nhận định do sự mất mát hoặc loại bỏ bớt các hợp chất có tác dụng hiệp đồng trong dịch thô.
• Pha nước mới dừng ở mức nhận diện sơ bộ sự có mặt của peptit/protein qua phản ứng màu ninhydrin trên bản mỏng TLC, chưa tiến hành định lượng protein, xác định khối lượng phân tử hay tinh chế sâu hơn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất bao gồm:

• Đối với pha nước: Sử dụng màng lọc tiếp tuyến hoặc cột siêu lọc có kích thước giới hạn (cut-off) nhỏ hơn 5 kDa để làm giàu các peptit AGIs; kết hợp điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE), định lượng protein và phân tích khối phổ (MS).
• Đối với pha dung môi: Khảo sát hệ dung môi để chạy sắc ký cột silica gel lần 2, kết hợp sắc ký pha đảo và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm thu nhận hoạt chất ở độ tinh khiết cao phục vụ giải mã cấu trúc hóa học.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Dược học, Hóa sinh học, Công nghệ sinh học và Hóa hợp chất tự nhiên. Các nội dung thực nghiệm cụ thể sau đây có thể ứng dụng trực tiếp:

• Quy trình sàng lọc hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase in vitro trên khay vi thể 96 giếng đo quang phổ ở bước sóng 405 nm.
• Phương pháp khảo sát độ phân cực của dung môi trong chiết xuất lỏng - lỏng dịch lên men vi sinh vật ngoại bào.
• Kỹ thuật thăm dò hệ dung môi khai triển sắc ký bản mỏng và thông số vận hành sắc ký cột lọc gel (Sephadex G-25) và sắc ký cột pha thuận (Silica gel 60).

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng giống Aspergillus niger VTCC 031 được nuôi cấy trong điều kiện công nghệ nào để sinh tổng hợp hoạt chất AGIs? Chủng được hoạt hóa trên môi trường thạch đĩa PDA ở 30°C trong 72 giờ (pH 7,0), sau đó cấy chuyển vào môi trường lên men lỏng gồm 5% D-glucose và 1% cao malt (pH 5,0), nuôi ở nhiệt độ 37°C với chế độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian 7 ngày.

2. Tại sao nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi n-BuOH : acid acetic : EtOAc : H2O (3:1:3:1) thay vì hệ chứa n-hexan để chạy sắc ký cột silica gel? Mặc dù hệ dung môi chứa n-hexan (Hexan : EtOAc : acid acetic = 1:4:2) tách vết gọn trên TLC, nhưng do n-hexan có độ phân cực rất kém nên không kéo được toàn bộ hoạt chất lên khỏi điểm chấm ban đầu. Đồng thời, n-hexan là dung môi độc hại đối với thiết bị và môi trường, không phù hợp cho mục tiêu nâng quy mô chiết xuất sau này. Do đó, hệ dung môi phân cực bậc ba (hệ III) được lựa chọn.

3. Vì sao hoạt tính ức chế α-glucosidase lại xuất hiện ở cả pha nước và pha dung môi sau khi chiết phân đoạn? Dịch lên men ngoại bào của A. niger VTCC 031 chứa nhiều nhóm hoạt chất ức chế khác nhau: pha nước tập trung các hợp chất phân cực cao có bản chất peptit hoặc protein phân tử lượng thấp (dương tính với thuốc thử ninhydrin), trong khi pha n-butanol hòa tan các hoạt chất chuyển hóa thứ cấp ít phân cực hơn.

4. Khóa luận đã phân lập được phân đoạn nào thể hiện hoạt tính sinh học rõ rệt nhất từ cột silica gel lần 1? Từ phân đoạn số 11 qua cột silica gel lần 1, kỹ thuật cạo vết bản mỏng TLC điều chế đã tách được 3 vết, trong đó duy nhất vết TLC2 (có hệ số lưu giữ Rf = 0,65) thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt 39,31%, trong khi vết TLC1 (Rf = 0,24) và TLC3 (Rf = 0,94) hầu như không có hoạt tính.

5. Tại sao giá trị IC50 của mẫu TLC2 (7873,72 µg/ml) lại cao hơn nhiều so với acarbose đối chứng (30,83 µg/ml)? Mẫu TLC2 mới chỉ qua tinh chế sơ bộ 1 lần qua cột silica gel và thu gom bằng cạo vết thủ công với lượng cắn rất nhỏ (0,0005 g). Mẫu vẫn còn chứa các tạp chất chưa được loại bỏ hoàn toàn, làm suy giảm hiệu lực ức chế tương đối so với acarbose ở dạng hợp chất đơn tinh khiết chuẩn thương mại.

Kết luận

Khóa luận đã khảo sát thành công các điều kiện công nghệ tách chiết và bước đầu tinh sạch hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng nấm sợi Aspergillus niger VTCC 031, ghi nhận hoạt tính ức chế của dịch lên men đạt 67,24%. Nghiên cứu xác định n-butanol và ethyl acetat là các dung môi thích hợp cho quá trình chiết phân đoạn hai pha, đồng thời lựa chọn được cột Sephadex G-25 cho pha nước và hệ dung môi n-BuOH : acid acetic : EtOAc : H2O (3:1:3:1) cho sắc ký cột silica gel 60 ở pha hữu cơ. Kết quả phân lập được vết TLC2 có hoạt tính ức chế 39,31% với giá trị IC50 đạt 7873,72 µg/ml là cơ sở thực nghiệm quan trọng phục vụ các bước tinh sạch sâu và xác định cấu trúc hóa học tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Những năm gần đây, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ), một bệnh rối loạn chuyển hóa mạn tính, tăng nhanh liên tục đã khiến cho căn bệnh này trở thành vấn đề sức khỏe toàn cầu và là một gánh nặng kinh tế cho rất nhiều quốc gia trên toàn thế giới. Năm 2021, theo báo cáo của Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF) số người trưởng thành mắc đái tháo đường là 537 triệu người và xu hướng sẽ tăng lên 783 triệu người vào năm 2045 [31], [12], [27]. ĐTĐ đã được xem là một đại dịch không lây nhiễm với tỷ lệ tử vong xếp hàng thứ 3 chỉ sau bệnh ung thư và tim mạch. Theo các nghiên cứu gần đây, ĐTĐ được coi là một trong những yếu tố không những làm tăng nguy cơ nhiễm trùng máu mà còn thúc đẩy sự tiến triển nhanh chóng và nguy cơ tiên lượng nặng ở bệnh nhân mắc COVID-19 [4].

Các chất ức chế alpha glucosidase (AGIs) được sử dụng khá rộng rãi trên lâm sàng để điều trị ĐTĐ typ 2 với mục đích làm giảm đường huyết sau ăn, bảo vệ bệnh nhân tránh khỏi các biến chứng tim mạch và do đó giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân ĐTĐ do biến chứng nguy hiểm này. Mặc dù, các AGIs truyền thống như acarbose và voglibose có thể kiểm soát tốt đường huyết sau ăn, tuy nhiên những tác dụng không mong muốn của những thuốc này cũng phần nào hạn chế việc sử dụng chúng trên lâm sàng. Do đó, trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học rất nỗ lực để tìm kiếm những AGIs mới, vừa có tác dụng điều trị tốt mà lại ít tác dụng không mong muốn. Bên cạnh nguồn tổng hợp Hóa Dược, xu hướng hiện nay trên thế giới và cả ở Việt Nam là quan tâm và chú trọng việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc sinh học, đặc biệt là sinh tổng hợp các chất từ nấm và vi khuẩn.

Trong số các vi sinh vật tiềm năng, nấm Aspergillus là một trong các chủng đang được nghiên cứu sinh tổng hợp các chất ức chế enzym α-glucosidase ứng dụng để điều trị bệnh ĐTĐ [19]. Mặc dù vậy, tại Việt Nam, các nghiên cứu cứu về hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ chủng Aspergillus còn khá hạn chế, cho đến nay mới có một số nghiên cứu của Phạm Minh Hồng (2020) [5], Bùi Hồng Sơn (2021) [6], bước đầu nghiên cứu sinh tổng hợp hoạt chất α-glucosidase từ chủng Aspergillus niger. Chính vì vậy, đề tài “Tách chiết và tinh sạch hoạt chất ức chế alpha glucosidase từ chủng Aspergillus niger” được tiến hành để mở rộng nghiên cứu chủng nấm tiềm năng này tại Việt Nam, giúp mở ra hướng điều trị ĐTĐ mới an toàn, hiệu quả. Đề tài được tiến hành nhằm đạt được 2 mục tiêu sau: 1.

Lựa chọn được dung môi tách chiết hợp chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. Lựa chọn được điều kiện tinh chế hoạt chất ức chế α-glucosidase từ chủng A. Bệnh Đái tháo đường 1. Khái niệm Theo hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ, bệnh Đái tháo đường (ĐTĐ) là một tập hợp những rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi sự tăng glucose huyết do suy giảm sản xuất insulin và/hoặc do không đáp ứng với insulin tại các mô.

Sự tăng glucose huyết mạn tính trong ĐTĐ có liên quan mật thiết với những tổn thương lâu dài, rối loạn và suy giảm chức năng của nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim mạch và mạch máu [8]. Phân loại Theo phân loại của ADA năm 2021 ĐTĐ được chia làm 4 loại [12]: - ĐTĐ typ 1 (phụ thuộc insulin): Chiếm khoảng 5-10% trong số người mắc bệnh ĐTĐ. ĐTĐ typ 1 xảy ra do tế bào β đảo tụy bị phá hủy, nên bệnh nhân không còn hoặc rất ít insulin gây ra thiếu insulin tuyệt đối. Nguyên nhân thường 95% do cơ chế tự miễn (typ 1A) và 5% vô căn (typ 1B).

Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu là ở trẻ em và thanh thiếu niên. - ĐTĐ typ 2 (không phụ thuộc insulin) Thường được gọi là ĐTĐ của người lớn tuổi hay ĐTĐ không phụ thuộc insulin với tỷ lệ chiếm khoảng 90-95% số người mắc ĐTĐ. Nguyên nhân do giảm bài tiết insulin tương đối của tiểu đảo tụy kết hợp với hiện tượng kháng insulin ở mô. - ĐTĐ thai kỳ (GDM): ĐTĐ thai kì được định nghĩa là bất cứ rối loạn dung nạp glucose huyết nào khởi phát hoặc lần đầu tiên được chẩn đoán phát hiện trong thời kì mang thai ở trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ typ 1, typ 2 trước đó.

Khoảng 7% phụ nữ có thai mắc phải ĐTĐ thai kì. - Các loại ĐTĐ đặc biệt do các nguyên nhân khác như: Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen MODY(maturity Onset Diabetes of the young- khởi phát ở người trẻ tuổi, thường trước 25 tuổi). Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen INSR. Bệnh lý tụy ngoại tiết: viêm tụy, chấn thương, cắt bỏ tụy, ung thư tụy.

Bệnh nội tiết (to đầu chi, hội chứng cushing, u tiết glucagon, u tủy thượng thận tăng tiết catecholamin, cường giáp, u tiết somatostatin, u tiết aldosteron). ĐTĐ do sử dụng thuốc và hóa chất: glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô,… 2 1. Cơ chế bệnh sinh và biến chứng 1. Cơ chế của ĐTĐ typ 1 ĐTĐ typ 1 được coi là một trong hơn 80 bệnh được có nguyên nhân do cơ chế tự miễn dịch, do hậu quả của sự phá hủy cơ quan miễn dịch của các tế bào sản xuất insulin trong các tế bào đảo tụy của Langerhans [9].

Trước tiên, do sự phá vỡ cơ chế điều hòa miễn dịch, dẫn đến mở rộng các tế bào T-CD4 và T-CD8 [14], [21], [25], tế bào lympho B sản xuất tự kháng thể [24], [29], [48] và kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh để tiêu diệt các tế bào β-tiểu đảo Langerhans sản xuất insulin [18], [59] gây ra ĐTĐ typ 1. Bệnh ĐTĐ typ 1 phát triển do sự kết hợp của khuynh hướng di truyền, các yếu tố môi trường và các sự kiện ngẫu nhiên. Vì nhiều lý do, được cho là liên quan đến vệ sinh dân số, tiếp xúc với ánh nắng mặt trời và các yếu tố môi trường khác, tỷ lệ mắc bệnh đã tăng mạnh trong hai thập kỷ qua, đặc biệt là ở trẻ em dưới 5 tuổi [26]. Những người dưới 18 tuổi thường mắc ĐTĐ typ 1 [38], nhưng cũng có một số lượng người trên 18 tuổi [13].

Cơ chế của ĐTĐ typ 2 Đái tháo đường typ 2 là một rối loạn không đồng nhất do sự kết hợp của các yếu tố di truyền liên quan đến suy giảm bài tiết insulin, kháng insulin và các yếu tố môi trường như béo phì, ăn quá nhiều, lười vận động, căng thẳng cũng như lão hóa. ĐTĐ typ 2 điển hình là một bệnh đa yếu tố liên quan đến nhiều gen và các yếu tố môi trường [27]. Trong điều kiện sinh lý bình thường, nồng độ glucose huyết tương được duy trì trong một phạm vi hẹp, bất chấp sự biến động lớn về cung và cầu, thông qua sự tương tác giữa mô nhạy cảm với insulin (đặc biệt là ở gan) và bài tiết insulin. Trong ĐTĐ typ 2 những cơ chế trên bị phá vỡ, gây ra hậu quả là suy giảm bài tiết insulin do rối loạn chức năng của tế bào β tuyến tụy và suy giảm hoạt động của insulin thông qua kháng insulin [27].

Theo một nghiên cứu chỉ ra rằng ĐTĐ typ 2 ảnh hưởng 1-2% người da trắng và tỷ lệ này cao hơn nhiều ở một số nhóm dân tộc như người da đỏ Pima và người Ả Rập và tiếp cận đến 50% ở Nam Ấn Độ [43]. Biến chứng của ĐTĐ ĐTĐ gây ra những biến chứng nguy hiểm cấp tính và mạn tính. Biến chứng cấp tính thường gặp là nhiễm toan ceton, nhiễm toan lactic, hạ đường huyết, tăng áp lực thẩm thấu. Khi mức đường huyết trong máu cao lâu dài có thể dẫn đến các biến chứng mạn tính gây ra bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến tim, mạch máu, mắt, thận, thần kinh,.

Theo một nghiên cứu chỉ ra tỷ lệ tổn thương thần kinh do ĐTĐ là thường gặp nhất, chiếm 40-45% số bệnh nhân mắc ĐTĐ; bên cạnh đó sự xuất hiện của bệnh thận ở khoảng 20-40% thay đổi tùy theo sắc tộc, quốc gia [1]. Đây là nguyên nhân hàng đầu gây suy thận giai đoạn cuối, cần phải lọc thận và ghép thận ở các nước phát triển. Người lớn mắc 3 ĐTĐ có nguy cơ tăng gấp 2-3 nhồi máu cơ tim và đột quỵ. Bệnh võng mạc tiểu đường là một nguyên nhân quan trọng gây mù có khoảng 2,6% bệnh mù toàn cầu có thể là do ĐTĐ [1].

Do các biến chứng nghiêm trọng của ĐTĐ nên việc duy trì mức đường máu, huyết áp và cholesterol bình thường hoặc gần bình thường có thể giúp trì hoãn hoặc ngăn ngừa các biến chứng ĐTĐ. Các nguyên tắc điều trị bệnh đái tháo đường 1. Mục tiêu điều trị ĐTĐ là bệnh rối loạn chuyển hóa có ảnh hưởng đến nhiều cơ quan trong cơ thể. Do vậy, trong điều trị ĐTĐ các mục tiêu quan trọng cần kiểm soát là: giảm đường huyết, đạt cân nặng hợp lý, làm chậm xuất hiện các biến chứng và nâng cao chất lượng đời sống của bệnh nhân.

Ngoài ra còn kiểm soát các chỉ tiêu về lipid huyết, huyết áp, chỉ số khối cơ thể [1]. Mục tiêu điều trị ĐTĐ ở người trưởng thành, không có thai được trình bày ở Bảng 1. Mục tiêu điều trị cho BN ĐTĐ ở người trưởng thành, không có thai Mục tiêu Chỉ số HbA1c < 7% (53mmol/mol) Glucose huyết tương 80-130 mg/dL (4,4-7,2 mmol/L)* lúc đói, trước ăn Đỉnh glucose huyết <180 mg/dL (10,0 mmol/L)* tương sau ăn 1-2 giờ Huyết áp Tâm thu <140 mmHg, Tâm trương <90 mmHg Nếu đã có biến chứng thận, hoặc có yếu tố nguy cơ tim mạch do xơ vữa cao: Huyết áp <130/80 mmHg Lipid máu LDL cholesterol <100 mg/dL (2,6 mmol/L), nếu chưa có biến chứng tim mạch LDL cholesterol <70 mg/dL (1,8 mmol/L) nếu đã có bệnh tim mạch vữa xơ, hoặc có thể thấp hơn <50 mg/dL nếu có yếu tố nguy cơ xơ vữa cao Triglycerid <150 mg/dL (1,7 mmol/L) HDL cholesterol >40 mg/dL (1,0 mmol/L) ở nam và >50 mg/dL (1,3 mmol/L) ở nữ * Mục tiêu điều trị ở các cá nhân có thể khác nhau [1]: - Mục tiêu có thể thấp hơn (HbA1c <6,5%) ở BN trẻ, mới chẩn đoán, không có các bệnh lý tim mạch, nguy cơ hạ glucose máu thấp. 4 - Ngược lại, mục tiêu có thể cao hơn (HbA1c từ 7,5 – 8%) ở những BN lớn tuổi, mắc bệnh ĐTĐ đã lâu, có nhiều bệnh lý đi kèm, có tiền sử hạ glucose máu nặng trước đó.