Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học bảo toàn khả năng sống và hoạt tính probiotic của lactobacillus casei bằng sự kết hợp prebioticvi gói nhằm thử nghiệm tạo sữa bột synbiotic

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu bảo toàn khả năng sống và hoạt tính probiotic của Lactobacillus casei, ứng dụng tạo sữa bột synbiotic hiệu quả.

• Tác giả: Bùi Văn Hoài
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Bảo Toàn Khả Năng Sống Và Hoạt Tính Probiotic Của Lactobacillus Casei Bằng Sự Kết Hợp Prebiotic-Vi Gói Nhằm Thử Nghiệm Tạo Sữa Bột Synbiotic
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT ĐỀ TÀI
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 1.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Probiotic và vai trò của probiotic
• 2.1.1. Đặc điểm của hệ tiêu hóa
• 2.1.2. Vai trò của probiotic
• 2.1.2.1. Thủy phân lactose và tăng sự hấp thu lactose
• 2.1.2.2. Giảm viêm loét dạ dày
• 2.1.2.3. Giảm hàm lượng cholesterol
• 2.1.2.4. Tăng cường hệ thống miễn dịch
• 2.1.2.5. Ngăn ngừa ung thư
• 2.1.2.6. Chống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục
• 2.2. Prebiotic và vai trò của prebiotic
• 2.2.1. Vai trò của prebiotic
• 2.3. Synbiotic và vai trò của synbiotic
• 2.4. Giới thiệu đặc điểm sinh học của L.casei trong hệ tiêu hóa
• 2.5. Vật liệu vi gói
• 2.6. Các phương pháp vi gói
• 2.6.1. Phương pháp sấy phun (spray-drying)
• 2.6.2. Phương pháp nhũ hóa (emulsion)
• 2.6.3. Phương pháp nén đùn (extrusion)
• 2.7. Sữa bột synbiotic
• 2.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.8.1. Nghiên cứu trong nước
• 2.8.2. Nghiên cứu ngoài nước
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và môi trường
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 3.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.2.2.1. Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn L.casei
• 3.2.2.2. Khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính probiotic của vi khuẩn L.casei
• 3.2.2.3. Vi gói bằng phương pháp sấy phun
• 3.2.2.4. Theo dõi chế phẩm vi gói
• 3.2.2.5. Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa bột synbiotic
• 3.2.3. Các phương pháp phân tích
• 3.2.3.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể bằng phương pháp nhuộm Gram
• 3.2.3.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
• 3.2.3.3. Phương pháp xác định đường cong tăng trưởng của vi sinh vật
• 3.2.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng sống của probiotic trong môi trường dạ dày nhân tạo
• 3.2.3.5. Phương pháp kiểm tra khả năng sống của probiotic trong môi trường muối mật nhân tạo
• 3.2.3.6. Phương pháp kiểm tra hiệu suất vi gói
• 3.2.3.7. Xác định giá trị pH
• 3.2.3.8. Xác định hàm lượng cholesterol
• 3.2.3.9. Phương pháp đánh giá cảm quan
• 3.3. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4.1. Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Lactobacillus casei
• 4.1.1. Quan sát hình thái đại thể và vi thể
• 4.1.2. Khảo sát đường cong sinh trưởng của L.casei
• 4.2. Khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính probiotic của vi khuẩn L.casei
• 4.2.1. Khảo sát khả năng chịu pH thấp của L.casei trong môi trường SGJ
• 4.2.2. Khảo sát khả năng chịu muối mật của L.casei trong môi trường SIJ
• 4.2.3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
• 4.2.4. Khảo sát khả năng khử cholesterol
• 4.2.5. Khảo sát khả năng sử dụng GOS ở các nồng độ khác nhau của L.casei
• 4.3. Vi gói bằng phương pháp sấy phun
• 4.3.1. Lựa chọn vật liệu vi gói
• 4.3.2. Khảo sát đặc điểm cấu trúc hạt vi gói
• 4.4. Theo dõi chế phẩm vi gói
• 4.4.1. Khảo sát khả năng sống và ảnh hưởng của prebiotic đến mật độ L.casei trong chế phẩm vi gói theo thời gian bảo quản
• 4.4.2. Tái khảo sát một số đặc điểm và hoạt tính probiotic sau vi gói vi khuẩn L.casei
• 4.4.2.1. Tái khảo sát khả năng sống L.casei trong môi trường SGJ và SIJ
• 4.4.2.2. Tái khảo sát khả năng kháng khuẩn của L.casei
• 4.5. Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa bột synbiotic
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Lactobacillus Casei và Probiotic

Lactobacillus Casei là một chủng vi khuẩn probiotic quan trọng, được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm chức năng và dược phẩm. Probiotic đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ miễn dịch. Tuy nhiên, khả năng sống sót của Lactobacillus Casei trong điều kiện khắc nghiệt của hệ tiêu hóa, như pH thấp và muối mật, vẫn là thách thức lớn. Nghiên cứu này tập trung vào việc bảo toàn khả năng sống và hoạt tính probiotic của Lactobacillus Casei thông qua phương pháp vi gói kết hợp với prebiotic, nhằm ứng dụng trong sản xuất sữa bột synbiotic.

1.1. Vai trò của Probiotic trong sức khỏe con người

Probiotic giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng cường hấp thu dinh dưỡng, và hỗ trợ hệ miễn dịch. Lactobacillus Casei là một trong những chủng probiotic phổ biến, có khả năng kháng khuẩn, giảm cholesterol, và hỗ trợ tiêu hóa lactose. Tuy nhiên, để phát huy hiệu quả, probiotic cần duy trì số lượng sống sót đủ lớn trong suốt quá trình tiêu hóa.

1.2. Thách thức trong bảo toàn khả năng sống của Probiotic

Khoảng 90-95% probiotic bị tiêu diệt trong điều kiện pH thấp của dạ dày và muối mật ở ruột non. Điều này làm giảm hiệu quả của các sản phẩm chứa probiotic. Phương pháp vi gói được xem là giải pháp tiềm năng để bảo vệ Lactobacillus Casei khỏi các tác động bất lợi của môi trường tiêu hóa.

II. Phương pháp vi gói và prebiotic trong nghiên cứu

Phương pháp vi gói sử dụng chất liệu như whey protein và maltodextrin để bao bọc Lactobacillus Casei, giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện khắc nghiệt. Prebiotic, như galactooligosaccharide (GOS), được kết hợp để tăng cường hiệu quả của probiotic. Sự kết hợp này tạo ra synbiotic, một sản phẩm kết hợp cả probiotic và prebiotic, mang lại lợi ích kép cho sức khỏe.

2.1. Quy trình vi gói bằng phương pháp sấy phun

Phương pháp sấy phun được sử dụng để tạo hạt vi gói chứa Lactobacillus Casei. Quy trình này bao gồm việc phun hỗn hợp vi khuẩn và chất liệu bao bọc vào buồng sấy, tạo thành các hạt nhỏ có khả năng bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường axit và muối mật.

2.2. Vai trò của prebiotic trong synbiotic

Prebiotic là nguồn thức ăn cho probiotic, giúp tăng cường sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi. Trong nghiên cứu này, GOS được sử dụng để cải thiện khả năng sống sót của Lactobacillus Casei trong hệ tiêu hóa và tăng cường hiệu quả của sản phẩm synbiotic.

III. Ứng dụng trong sản xuất sữa bột synbiotic

Nghiên cứu này tập trung vào việc thử nghiệm tạo sữa bột synbiotic bằng cách bổ sung chế phẩm vi gói chứa Lactobacillus Casei và prebiotic vào sữa bột. Kết quả cho thấy, sản phẩm có mật độ vi khuẩn đạt 1.5x10^5 CFU/g, không ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sữa bột.

3.1. Kết quả thử nghiệm sữa bột synbiotic

Chế phẩm vi gói được bổ sung vào sữa bột với tỷ lệ 0.1%, tạo ra sản phẩm synbiotic có mật độ vi khuẩn đạt yêu cầu. Các thử nghiệm cảm quan cho thấy sản phẩm không làm thay đổi hương vị và kết cấu của sữa bột.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm synbiotic có khả năng bảo toàn hiệu quả của probiotic trong điều kiện thực tế. Sản phẩm sữa bột synbiotic có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm chức năng và dinh dưỡng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong công nghệ thực phẩm chức năng và dược phẩm hiện đại, việc duy trì mật độ vi sinh vật có ích khi đi qua đường tiêu hóa là một thách thức kỹ thuật lớn. Theo ước tính từ nhiều thử nghiệm sinh học, khoảng 90% đến 95% tế bào vi khuẩn probiotic dạng tự do bị tiêu diệt khi tiếp xúc với môi trường dịch vị dạ dày có độ pH thấp (từ 1.0 đến 2.0) và nồng độ muối mật khắc nghiệt tại ruột non (khoảng 0.3%). Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo lớp rào cản vật lý vững chắc nhằm bảo vệ tế bào vi khuẩn sống sót qua các khâu chế biến nhiệt, sấy khô, bảo quản dài ngày và chỉ giải phóng tại vị trí hấp thu mong muốn trong đường ruột.

Mục tiêu cốt lõi của nghiên cứu là bảo toàn khả năng sống và hoạt tính sinh học đặc trưng của chủng vi khuẩn probiotic Lactobacillus casei AS186 bằng kỹ thuật vi bao sấy phun kết hợp bổ sung prebiotic, từ đó thử nghiệm phát triển sản phẩm sữa bột synbiotic đạt tiêu chuẩn chất lượng. Đề tài được triển khai thực hiện trong khung thời gian từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 11 năm 2014 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM và Trung tâm Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM.

Ý nghĩa thực tiễn của công trình thể hiện rõ qua việc thiết lập quy trình tạo chế phẩm vi gói dạng bột đạt mật độ tế bào sống lên tới 1.5 x 10^8 CFU/g. Khi ứng dụng bổ sung vào sữa bột với tỷ lệ tối ưu 0.1%, sản phẩm tạo thành đạt mật độ probiotic tiêu chuẩn 1.5 x 10^5 CFU/g, duy trì ổn định hoạt tính kháng khuẩn và không làm biến đổi các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm sau 120 ngày bảo quản ở nhiệt độ 10°C.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết chủ đạo trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dinh dưỡng học:

Thứ nhất là lý thuyết về hệ vi sinh vật đường ruột và cơ chế tương tác synbiotic. Khái niệm probiotic do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và FAO xác định là các vi sinh vật sống đem lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ khi được bổ sung với số lượng đầy đủ. Kết hợp với đó là khái niệm prebiotic do Gibson và Roberfroid khởi xướng, chỉ các thành phần carbohydrate không bị tiêu hóa ở dạ dày nhưng kích thích chọn lọc sự phát triển của vi khuẩn có lợi tại ruột kết. Sự phối hợp giữa probiotic và prebiotic tạo nên hệ synbiotic mang lại hiệu quả hiệp đồng vượt trội trong việc cân bằng vi sinh đường ruột, tăng cường miễn dịch và ức chế mầm bệnh.

Thứ hai là lý thuyết vi bao sinh học (Microencapsulation Theory) bằng phương pháp sấy phun. Đây là quá trình bẫy tế bào vi sinh vật vào bên trong cấu trúc chất mang polyme sinh học nhằm hình thành các hạt vi cầu có kích thước micromet. Lớp vỏ bảo vệ này ngăn chặn sự tiếp xúc trực tiếp của vi khuẩn với nhiệt độ sấy cao, oxy hóa và môi trường acid cực đoan, đồng thời tan rã có kiểm soát khi gặp môi trường trung tính tại ruột non.

Các khái niệm chính được vận dụng xuyên suốt đề tài gồm: Chủng probiotic thuần khiết Lactobacillus casei AS186, prebiotic Galactooligosaccharide (GOS), chỉ số hiệu suất vi gói (Encapsulation Yield), dịch dạ dày nhân tạo (Simulated Gastric Juice - SGJ) và dịch ruột nhân tạo (Simulated Intestinal Juice - SIJ).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm bao gồm chủng vi khuẩn Lactobacillus casei AS186 được cung cấp từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa TP.HCM, cùng hai chủng vi sinh vật chỉ thị gây bệnh là Bacillus cereus (Gram dương) và Salmonella typhimurium (Gram âm).

Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu: Toàn bộ các thí nghiệm khảo sát in vitro được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn có đối chứng, với cỡ mẫu thực hiện lặp lại 3 lần độc lập (n = 3) cho từng nghiệm thức nhằm đảm bảo tính chính xác và loại trừ sai số ngẫu nhiên. Dữ liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng, kiểm định sai biệt bằng phân tích phương sai ANOVA ở mức ý nghĩa p < 0.05.

Các phương pháp phân tích cụ thể gồm:

• Phương pháp nuôi cấy và dựng đường cong tăng trưởng: Xác định mật độ tế bào log(CFU/ml) qua độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 600 nm sau 20 giờ nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng ở 37°C.
• Phương pháp thử nghiệm sức sống trong điều kiện cực đoan: Tế bào được ủ trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ (chứa NaCl 9 g/l, Pepsin 3 g/l, điều chỉnh các mức pH từ 2.0 đến 3.0) theo các mốc thời gian 0, 30, 60, 90, 120 phút; và môi trường ruột nhân tạo SIJ chứa 0.3% muối mật trong 4 giờ.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng kỹ thuật khuếch tán giếng thạch trên đĩa môi trường LB agar chứa vi khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10^8 CFU/ml để đo đường kính vòng vô khuẩn (mm).
• Phương pháp xác định khả năng khử cholesterol: Định lượng hàm lượng cholesterol dư bằng phương pháp so màu sau 20 giờ lên men trong môi trường bổ sung 100 µg/ml cholesterol và 0.3% muối mật.
• Kỹ thuật phân tích cấu trúc vi hạt: Quan sát hình thái vi thể bằng kính hiển vi điện tử quét bề mặt FE-SEM (Hitachi S4800) và đo phân bố kích thước hạt trên máy Laser Horiba LA-920.
• Phương pháp đánh giá cảm quan: Áp dụng phép thử tam giác (Triangle Test) trên hội đồng người thử đã qua huấn luyện nhằm so sánh sản phẩm sữa bột có và không bổ sung chế phẩm synbiotic.

Lý do lựa chọn phương pháp sấy phun mini (thiết bị Labplant SD-06AG) là nhờ khả năng tạo hạt bột đồng đều, tính khả thi cao khi nâng cấp quy mô công nghiệp, tiết kiệm chi phí vận hành hơn so với phương pháp sấy thăng hoa hoặc nén đùn giọt gel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện quan trọng có giá trị khoa học và ứng dụng cao:

Thứ nhất, chủng Lactobacillus casei AS186 thể hiện các đặc tính sinh học probiotic ưu việt ở dạng tự do. Sau 20 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đạt mật độ sinh khối cực đại. Dịch chiết tế bào sinh bacteriocin thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh đối với cả Bacillus cereus và Salmonella typhimurium. Đồng thời, chủng có khả năng đồng hóa và làm giảm hàm lượng cholesterol từ mức ban đầu 100 µg/ml trong môi trường chứa 0.3% muối mật. Vi khuẩn cũng sử dụng hiệu quả nguồn cơ chất prebiotic GOS ở các dải nồng độ từ 1.0% đến 2.0%.

Thứ hai, hệ vật liệu phối hợp Whey protein (10%) kết hợp Maltodextrin (5%) biến tính nhiệt tại 80°C trong 10 phút là cấu trúc mang lại hiệu quả vi bao cao nhất. So sánh với các hệ chất mang Alginate (0.5%) + Maltodextrin (5%) và Xanthan gum (0.5%) + Maltodextrin (5%), hệ Whey protein – Maltodextrin giúp tỷ lệ sống sót của tế bào sau quá trình sấy phun (nhiệt độ gió vào 110°C, gió ra 65-70°C, áp suất phun 2 kg/cm²) đạt mức bảo toàn tốt nhất.

Thứ ba, sự hiện diện của 1.5% Prebiotic GOS kết hợp vi bao đã tạo ra chế phẩm synbiotic dạng bột đạt mật độ 1.5 x 10^8 CFU/g với sức sống vượt bậc. Khi thử thách trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ (pH 2.0) suốt 120 phút và môi trường muối mật SIJ (0.3%) trong 4 giờ, mật độ tế bào vi gói chỉ suy giảm khoảng 0.5 đến 1.0 log(CFU/g). Ngược lại, tế bào dạng tự do bị suy giảm nghiêm trọng từ 4.0 đến hơn 5.0 log(CFU/g) hoặc hoàn toàn mất khả năng phục hồi.

Thứ tư, thử nghiệm tạo sữa bột synbiotic thành công khi phối trộn chế phẩm vi gói vào sữa bột gầy với tỷ lệ 0.1%. Mật độ lợi khuẩn trong sản phẩm hoàn thiện đạt 1.5 x 10^5 CFU/g. Qua các mốc thời gian theo dõi 1 ngày, 60 ngày và 120 ngày ở 10°C, mật độ L. casei AS186 và hoạt tính kháng khuẩn vẫn duy trì ổn định, đáp ứng tiêu chuẩn thực phẩm sinh học.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả bảo vệ vượt trội của hệ chất mang Whey protein – Maltodextrin được giải thích thông qua cơ chế tương tác nhiệt và hóa lý. Khi đun nóng whey protein ở 80°C, cấu trúc bậc ba của protein mở chuỗi, làm lộ các gốc acid amin kỵ nước và nhóm sulfhydryl (-SH), tạo điều kiện cho các chuỗi phân tử liên kết mạng lưới bền vững với maltodextrin. Lớp màng sinh học này bao bọc chặt chẽ màng tế bào vi khuẩn, đóng vai trò như một lớp đệm nhiệt trong suốt thời gian vài giây tiếp xúc với dòng khí nóng trong buồng sấy phun.

Đồng thời, prebiotic GOS với các liên kết phân tử ngắn đóng vai trò như chất bảo vệ thẩm thấu nội bào, ngăn chặn sự co rút tế bào và biến tính protein màng. Khi đi vào môi trường dạ dày nhân tạo pH 2.0, lớp vỏ whey protein hạn chế sự khuếch tán của ion hydro (H+) vào tế bào chất của vi khuẩn, duy trì pH nội bào ổn định. Khi chuyển tiếp xuống môi trường ruột non có pH trung tính và enzyme tiêu hóa, lớp màng protein được phân giải sinh học một cách tự nhiên, giải phóng hoàn toàn lượng lớn tế bào sống.

Toàn bộ dữ liệu theo dõi động thái sống sót của vi khuẩn được thể hiện qua các đồ thị đường tương quan mật độ tế bào theo thời gian ủ acid và bảng tổng hợp kết quả thử nghiệm cảm quan tam giác. Hình ảnh cấu trúc vi thể chụp dưới kính hiển vi điện tử quét SEM ở độ phóng đại cao cho thấy các hạt vi gói có dạng hình cầu đồng đều, bề mặt co lõm nhẹ đặc trưng của quá trình sấy phun mà không có vết nứt vỡ cơ học, kích thước hạt trung bình tập trung trong dải từ 5 đến 15 µm, giải thích lý do tại sao chế phẩm hòa tan phân tán tốt và không làm thay đổi độ mịn hay vị giác của sữa bột thành phẩm.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các bằng chứng thực nghiệm, đề tài đưa ra 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị hành động cụ thể:

Thứ nhất, chuẩn hóa và nâng cấp quy mô thiết bị sấy phun công nghiệp. Các viện nghiên cứu phối hợp với doanh nghiệp thực phẩm tiến hành thử nghiệm chuyển giao công nghệ trên hệ thống sấy phun tầng sôi quy mô pilot với công suất dòng nhập liệu từ 50 đến 100 lít/giờ. Duy trì kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ gió vào ở mức 110-115°C và gió ra 65-70°C nhằm đảm bảo tỷ lệ thu hồi tế bào sống đạt trên 85%, hoàn thành trong lộ trình 6 đến 12 tháng.

Thứ hai, tối ưu hóa công thức phối trộn đa prebiotic. Bộ phận nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các nhà máy chế biến sữa cần nghiên cứu bổ sung kết hợp chuỗi ngắn GOS (1.5%) cùng chuỗi dài Inulin hoặc FOS ở tỷ lệ 0.5% đến 1.0%. Mục tiêu là nâng cao khả năng chịu nhiệt trong quá trình dập viên nang hoặc đóng gói kín khí, hướng tới mục tiêu kéo dài hạn sử dụng của chế phẩm lên 18 đến 24 tháng ở điều kiện bảo quản nhiệt độ phòng (khoảng 25°C).

Thứ ba, tiến hành thử nghiệm lâm sàng và hoàn thiện hồ sơ chứng minh công dụng. Các đơn vị y tế dự phòng và viện dinh dưỡng phối hợp với doanh nghiệp thực hiện các nghiên cứu in vivo trên động vật thực nghiệm và thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có kiểm soát trong 12 tháng. Trọng tâm là định lượng chỉ số suy giảm cholesterol máu và mức độ bám dính của L. casei AS186 trên niêm mạc ruột, phấn đấu đạt tỷ lệ cải thiện các chỉ số tiêu hóa trên 30% ở nhóm can thiệp.

Thứ tư, mở rộng ứng dụng chế phẩm synbiotic vào đa dạng dòng sản phẩm tiêu dùng. Các kỹ sư công nghệ sinh học và thực phẩm đẩy mạnh việc tích hợp chế phẩm vi gói ở tỷ lệ 0.1% đến 0.2% vào các nền sản phẩm khác như bột dinh dưỡng ngũ cốc, cháo ăn liền, bột sữa chua hòa tan và thực phẩm bổ sung dạng cốm sinh học cho trẻ em trong vòng 18 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo chuyên sâu, mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng sau:

Thứ nhất, học viên cao học, sinh viên và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Kỹ thuật Hóa học. Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thực nghiệm chuẩn từ khâu phân lập giống, đánh giá hoạt tính probiotic, kỹ thuật vi bao sấy phun đến các phương pháp phân tích hóa lý và vi sinh in vitro.

Thứ hai, chuyên viên và nhà quản lý R&D tại các tập đoàn, doanh nghiệp sản xuất sữa và chế phẩm từ sữa. Cung cấp giải pháp kỹ thuật có sẵn về công thức chất mang Whey protein – Maltodextrin – GOS, giúp rút ngắn thời gian thử nghiệm và giảm thiểu chi phí phát triển các dòng sản phẩm sữa synbiotic cao cấp.

Thứ ba, kỹ sư vận hành công nghệ chế biến và sấy phun sinh học. Tài liệu cung cấp các thông số công nghệ cụ thể về nhiệt độ khí vào, khí ra, áp suất vòi phun và lưu lượng bơm mẫu, giúp giải quyết triệt để sự cố dính thành cyclone và suy giảm hoạt lực tế bào vi sinh vật trong sản xuất thực tế.

Thứ tư, bác sĩ, chuyên gia dinh dưỡng và cán bộ y tế cộng đồng. Luận văn cung cấp các cơ sở khoa học định lượng về tác dụng giảm cholesterol huyết thanh, khả năng kháng khuẩn chỉ thị nguy hiểm (B. cereus, S. typhimurium) nhằm ứng dụng trong tư vấn phác đồ dinh dưỡng hỗ trợ điều trị bệnh lý đường ruột và rối loạn chuyển hóa.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần phải vi gói bảo vệ vi khuẩn Lactobacillus casei thay vì bổ sung trực tiếp dạng tự do vào thực phẩm? Trong điều kiện tự nhiên, có khoảng 90% đến 95% lợi khuẩn tự do bị tiêu diệt khi đi qua môi trường acid dạ dày (pH 1.0 đến 2.0) và muối mật 0.3%. Kỹ thuật vi gói tạo lớp màng chắn bảo vệ cấu trúc tế bào, giúp bảo toàn tỷ lệ sống sót trên 90% và đảm bảo mật độ vi khuẩn giải phóng tại ruột non đạt ngưỡng phát huy tác dụng sinh học tối thiểu là 10^6 CFU/g.

2. Hệ chất mang nào mang lại hiệu quả bảo vệ vi khuẩn tối ưu nhất trong nghiên cứu? Hệ chất mang phối hợp Whey protein 10% và Maltodextrin 5% sau khi được xử lý biến tính nhiệt ở 80°C trong 10 phút đem lại hiệu quả bảo vệ tế bào cao nhất. Lớp vỏ polymer sinh học này vừa chịu nhiệt tốt trong buồng sấy 110°C, vừa ngăn chặn sự xâm nhập của ion H+ trong môi trường acid dạ dày nhân tạo.

3. Prebiotic Galactooligosaccharide (GOS) đóng vai trò gì trong chế phẩm vi gói synbiotic? Prebiotic GOS ở nồng độ 1.5% vừa là nguồn cơ chất dinh dưỡng chọn lọc thúc đẩy L. casei AS186 phát triển, vừa đóng vai trò như chất bảo vệ thẩm thấu nội bào. Sự kết hợp synbiotic này giúp ổn định mật độ tế bào đạt 1.5 x 10^8 CFU/g trong suốt 120 ngày bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ 10°C.

4. Bổ sung chế phẩm vi gói vào sữa bột có làm thay đổi chất lượng cảm quan hay mùi vị không? Không. Kết quả đánh giá cảm quan bằng phép thử tam giác cho thấy việc bổ sung 0.1% chế phẩm vi gói dạng bột (tạo mật độ 1.5 x 10^5 CFU/g trong sữa bột) không tạo ra bất kỳ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nào về màu sắc, mùi thơm, vị béo và độ mịn so với mẫu sữa bột đối chứng.

5. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng Lactobacillus casei AS186 được thể hiện cụ thể như thế nào? Dịch chiết nuôi cấy chứa bacteriocin của L. casei AS186 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh mẽ, tạo vòng vô khuẩn rõ rệt trên đĩa thạch đối với hai chủng vi khuẩn chỉ thị gây ngộ độc và nhiễm trùng đường ruột phổ biến là Bacillus cereus (Gram dương) và Salmonella typhimurium (Gram âm).

Kết luận

• Tuyển chọn và đánh giá thành công chủng Lactobacillus casei AS186 với các hoạt tính probiotic nổi bật: sinh bacteriocin kháng khuẩn, đồng hóa cholesterol trong môi trường chứa 0.3% muối mật và sử dụng hiệu quả nguồn prebiotic GOS.
• Thiết lập công thức hệ chất mang vi bao tối ưu gồm Whey protein 10% phối hợp Maltodextrin 5% qua xử lý nhiệt 80°C trong 10 phút, kết hợp bổ sung 1.5% Prebiotic GOS.
• Tối ưu hóa chế độ sấy phun tạo bột chế phẩm ở nhiệt độ đầu vào 110°C, đầu ra 65-70°C, áp suất 2 kg/cm², thu nhận chế phẩm vi gói synbiotic đạt mật độ 1.5 x 10^8 CFU/g.
• Chứng minh khả năng bảo toàn sức sống vượt trội của tế bào vi gói qua 120 phút trong dịch dạ dày nhân tạo SGJ (pH 2.0) và 4 giờ trong dịch ruột nhân tạo SIJ (muối mật 0.3%), với mật độ duy trì ổn định sau 120 ngày bảo quản ở 10°C.
• Ứng dụng thành công chế phẩm vi gói vào sữa bột với tỷ lệ bổ sung 0.1%, tạo sản phẩm sữa bột synbiotic đạt mật độ 1.5 x 10^5 CFU/g, giữ nguyên vẹn các chỉ tiêu cảm quan tiêu chuẩn.

Công trình nghiên cứu đã cung cấp giải pháp công nghệ toàn diện giải quyết triệt để bài toán suy giảm sức sống của probiotic trong chế biến và tiêu hóa, mở ra tiềm năng lớn cho việc sản xuất các dòng thực phẩm chức năng quy mô công nghiệp trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới. Các viện nghiên cứu, doanh nghiệp và nhà khoa học có thể tham khảo, ứng dụng dữ liệu của luận văn để mở rộng nghiên cứu và thúc đẩy thương mại hóa các dòng sản phẩm dinh dưỡng bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu probiotic vẫn còn hạn chế. Khoảng 90-95% probiotic chết trong điều kiện cực đoan của hệ tiêu hóa [1, 53, 24, 20]. Vì vậy, đề tài “Bảo toàn khả năng sống và hoạt tính probiotic của Lactobacillus casei bằng sự kết hợp prebiotic-vi gói nhằm thử nghiệm tạo sữa bột synbiotic” được thực hiện nhằm góp phần giải quyết hạn chế trên. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu của nghiên cứu là bảo toàn khả năng sống và hoạt tính của vi khuẩn probiotic L.casei bằng phương pháp vi gói sấy phun để tạo chế phẩm dạng bột.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát đặc tính sinh học của vi khuẩn - Khảo sát đặc điểm và hoạt tính probiotic của vi khuẩn - Vi gói bằng phương pháp sấy phun. - Theo dõi chế phẩm vi gói. - Thử nghiệm tạo sản phẩm sữa bột synbiotic. 3 Luận văn thạc sĩ Tổng quan CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.

Probiotic và vai trò của probiotic 2. Đặc điểm của hệ tiêu hóa Khi thiết kế một hệ thống bao gói probiotic nhằm cung cấp cho con người thì chúng ta phải quan tâm đến sinh lý phức tạp của hệ tiêu hóa (hình 2. Thông thường việc giải phóng vi sinh vật sẽ được kích hoạt khi có sự tan rã, phân hủy hoặc hòa tan của các chất vi bao [122]. Dọc theo hệ tiêu hóa của con người có các yếu tố khác nhau để thực hiện việc giải phóng vi sinh vật, ví dụ như dựa vào pH, thời gian, áp lực nhu động và quá trình lên men của vi khuẩn.

Sau khi ăn hoặc uống probiotic đã được bao gói, nó sẽ đi qua thực quản một cách nhanh chóng (10 – 14 giây) [68] và sau đó đi đến dạ dày, tại đây vi khuẩn sẽ chết nhiều nhất do dạ dày có môi trường axit. Độ pH và thời gian lưu của vi khuẩn ở dạ dày ảnh hưởng nhiều đến khả năng sống của vi khuẩn probiotic, ngoài ra nó còn phụ thuộc vào thời gian ăn và độ tuổi của người sử dụng, pH của dạ dày của người bình thường là khoảng 1 – 2. Hoạt động trong dạ dày là rất phức tạp [67], bình thường thì các hạt nhỏ sẽ được lưu lại trong thời gian ngắn hơn hạt lớn. Dạ dày bình thường có thể chứa đến 1.5 lít nhưng chỉ chứa 50 ml khi nhịn ăn [68].

Ngoài axit thì trong dạ dày còn có hệ enzym pepsin, đây là hệ enzym phân giải protein. Pepsin là sản phẩm của pepsinogen trong điều kiện pH thấp của dạ dày. Sau khi đi qua dạ dày thì các hạt bao gói sẽ đi xuống ruột non, thời gian lưu trong ruột non là khoảng 3.6 giờ [106], trong một số trường hợp là từ 0. Giá trị pH của ruột non nằm ở đoạn đầu trong khoảng 6.35, còn đối với ruột non nằm ở cuối là 6.

Sau khi đi qua ruột non thì viên bao gói sẽ đi đến ruột già, lúc này pH của ruột già là 5.02 và giảm dần khi đến ruột kết [59]. Thời gian để hạt bao gói di chuyển trong ruột già rất khác nhau, bình thường nằm trong khoảng 6 – 32 giờ nhưng thời gian lâu hơn cũng đã được ghi nhận [14, 57]. 4 Luận văn thạc sĩ Tổng quan O pH 2 A pH 5 D B E C pH 7 Kí hiệu Vùng pH Thời gian di chuyển O Thực quản ~ 7.0 10 – 14 giây A Dạ dày 1 – 2.5 phút khi ăn) B Cận ruột non 6.6 giờ C Ruột non 6.88 D Đại tràng lên 5.72 Có thể cao hơn, phụ E Đại tràng xuống 5.02 thuộc vào sự bài tiết ruột Hình 2. Đặc điểm của hệ đường ruột, pH tại các vị trí khác nhau [51].

Probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ “những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa thống nhất.

Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: Thứ nhất, theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống 5 Luận văn thạc sĩ Tổng quan vào thức ăn giúp cải thiện sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ”; Thứ hai, theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” [45]. Đa số vi sinh vật probiotic thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium. Tuy nhiên, một số vi khuẩn và nấm men có thể có những đặc tính probiotic [45]. Bifidobacterium tồn tại ở trẻ ngay từ những ngày đầu sau sinh, đặc biệt là trẻ được bú mẹ.

Bifidobacterium lần đầu tiên được phân lập từ phân của trẻ được bú mẹ, số lượng các vi khuẩn này là tương đối ổn định và giảm đi khi lớn tuổi. Quần thể vi khuẩn Bifidobacterium chịu ảnh hưởng của các yếu tố như khẩu phần ăn, thuốc kháng sinh và sự căng thẳng. Bifidobacterium là vi khuẩn kị khí Gram (+), không chuyển động, không tạo bào tử, catalase-âm tính, hình dạng của chúng khác nhau. Tên gọi của vi khuẩn này xuất phát từ việc chúng thường tồn tại ở dạng hình chữ Y hay dạng chẻ đôi.

Chúng cũng được phân loại là vi khuẩn tạo axit lactic. Hiện nay có khoảng 30 loài Bifidobacterium được phân lập. Bifidobacterium được sử dụng như probiotic là: Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis và Bifidobacterium lactis. Các chủng của Bifidobacteria được dùng như probiotic là Bifidobacterium breve, Bifidobacterium breve RO7O, Bifidobacterium lactis BB12, Bifidobacterium longum RO23, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis RO33, Bifidobacterium longum BB536 và Bifidobacterium longum SBT-2928.

Lactobacillus có mặt trong ruột và trong âm đạo là vi khuẩn kị khí tùy ý Gram (+), không tạo bào tử. Hiện nay có khoảng 56 loài Lactobacillus được phân lập. Lactobacillus được sử dụng như probiotic bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus GG (Lactobacillus rhamnosus hoặc Lactobacillus casei subspecies rhamnosus), Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus salivarus. Các chủng khác của 6 Luận văn thạc sĩ Tổng quan Lactobacillus là Lactobacillus acidophilus BG2FO4, Lactobacillus acidophilus INT- 9, Lactobacillus plantarum ST31, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus acidophilus NCFB 1748, Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus acidophilus DDS-1, Lactobacillus delbrueckii subspecies delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus 2038, Lactobacillus acidophilus SBT-2062, Lactobacillus brevis, Lactobacillus salivarius UCC 118 và Lactobacillus paracasei subsp paracasei F19 [9] 2.

Vai trò của probiotic 2. Thủy phân lactose và tăng sự hấp thu lactose Trong suốt quá trình lên men vi khuẩn lactic sinh lactase để thủy phân lactose thành glucose và galactose. Vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hóa hầu hết lượng đường lactose trong ruột non [72]. Giảm viêm loét dạ dày Helicobacter pylori là một vi khuẩn Gram (-) gây bệnh viêm loét và ung thư dạ dày, Helicobacter pylori có thể tồn tại ở niêm mạc dạ dày (FAO/WHO, 2001).

Nghiêm cứu in vitro cho thấy vi khuẩn sinh axit lactic có thể chống lại sự phát triển của Helicobacter pylori (Midolo và cộng sự, 1995) [45]. Trong sữa chua uống của Yakult đã sinh ra chất ức chế chống sự tăng trưởng của vi khuẩn gây loét dạ dày Helicobacter pylori [72]. Giảm hàm lượng cholesterol Chủng probiotic, đặc biệt là vi khuẩn sinh axit lactic có một vai trò quan trọng trong việc giảm mức cholesterol gián tiếp bởi sự chuyển hóa cholesterol để tạo ra axit mật. Do đó, làm giảm hàm lượng cholesterol tổng số của cơ thể.

Sữa chua có chứa hai loại vi khuẩn probiotic là Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium lactis có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu có mức cholesterol cao. Các bệnh nhân dùng thuốc cùng với Lactobacillus sporogenesover một khoảng thời gian 3 tháng cho thấy giảm 32% trong tổng số cholesterol [72]. Tăng cường hệ thống miễn dịch Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể sống chống lại các yếu tố gây bệnh khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể là các globulin trong máu của động 7 Luận văn thạc sĩ Tổng quan vật, có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó, hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu.

Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh. IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc ruột. Các vi khuẩn làm tăng hệ miễn dịch bằng cách: + Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch. + Tăng hoạt động của tế bào NK (natual killer) nhằm diệt trực tiếp tế bào nhiễm khuẩn bằng cách tiết những chất độc để phân giải chúng hoặc bằng cách tiết IFN – gamma (một loại cytokine).

+ Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào + Sinh nitric oxide, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệ thần kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn. + Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn. + Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated respones). + Gián tiếp chống lại hiện tượng radiantion-included depression in white blood cells: đây là hiện tượng các tế bào bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ.

Hiện tượng này thường xảy ra trong khi điều trị ung thư bằng chiếu xạ [72]. Ngăn ngừa ung thư Các chủng probiotic có khả năng: + Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư. + Giảm hoạt tính của các enzym ở phân, đây là nơi khơi nguồn của các mầm bệnh gây ung thư. + Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u.

Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.acidophilus và Bifidobacteria) sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất ung thư và chống gây đột biến. Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzym liên quan đến các tác nhân gây ung thư (β-gulucoronidase, azoreductase, nitrosuctase và β-glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và 8 Luận văn thạc sĩ Tổng quan non-enzymeatic. Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocylic amines (các chất gây ung thư trong quá trình nấu thịt) sau đó được bài tiết theo phân [72].