Tổng Hợp Các Hạt Nano Trên Cơ Sở β-Cyclodextrin Làm Chất Mang Thuốc Điều Trị Ung Thư

Tổng hợp hạt nano từ β cyclodextrin và β cyclodextrin biến tính trong điều trị ung thư, mang lại tiềm năng mới cho liệu pháp y tế.

• Tác giả: Nguyễn Cao Hiền
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Chí Hiền
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Tổng Hợp Hạt Nano Dựa Trên β-Cyclodextrin Để Điều Trị Ung Thư
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: HCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Tổng quan về β-cyclodextrin
• 0.1.1. Tính chất lý – hóa của β-cyclodextrin
• 0.1.2. Tính tạo phức
• 0.1.3. Dẫn xuất của β-Cyclodextrin
• 0.2. Vật liệu truyền dẫn thuốc trên cơ sở cyclodextrin
• 0.2.1. Sự phù hợp của cyclodextrin trong ứng dụng mang thuốc trị ung thư
• 0.2.2. Nanogel trên cơ sở cyclodextrin
• 0.2.3. Các hệ nano vàng lai ghép
• 0.3. Thuốc trị ung thư
• 0.3.1. Các phương pháp giải phóng thuốc
• 0.3.1.1. Phương pháp phân lập mẫu
• 0.3.1.2. Phương pháp dòng chảy liên tục
• 0.3.1.3. Phương pháp thẩm tách
• 0.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1. NGHIÊN CỨU – THỰC NGHIỆM
• 1.1. Nguyên liệu - Hóa chất
• 1.2. Dụng cụ - Thiết bị
• 1.3. Tổng hợp một số dẫn xuất amine của β-CD
• 1.3.1. Quy trình tổng hợp 1-(p-toluensulfonyl) imidazole (TsIm)
• 1.3.2. Tổng hợp mono-6-(p-toluenesulfonyl)-6-deoxy-β-cyclodextrin (Ts-CD)
• 1.3.3. Tổng hợp mono-6-azide-deoxy-6-β-cyclodextrin (CD-N3)
• 1.3.4. Tổng hợp mono-6-amino-deoxy-6-β-cyclodextrin (CD-NH2)
• 1.3.5. Quy trình tổng hợp TMACD và HMACD
• 1.4. Điều chế các vật liệu nano trên cơ sở β-CD và β-CD biến tính
• 1.5. Tổng hợp các vật liệu nano tải thuốc
• 1.6. Phân tích cấu trúc, hình thái và các đặc trưng của nanocomposite
• 1.7. Giải phóng thuốc in vitro
• 1.8. Đánh giá khả năng gây độc tế bào của nanocomposite
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của β-CD
• 2.1.1. Tổng hợp TsIm
• 2.1.2. Tổng hợp Ts-CD
• 2.1.3. Tổng hợp CD-N3
• 2.1.4. Tổng hợp các dẫn xuất amine của β-cyclodextrin
• 2.2. Tổng hợp các nanocomposite
• 2.2.1. Tổng hợp vật liệu không mang thuốc
• 2.2.2. Khả năng mang thuốc của các vật liệu
• 2.3. Đặc điểm hóa lý của nanocomposite
• 2.3.1. Các hệ nanogel trên cơ sở β-CD-x/alginate
• 2.3.2. Các vật liệu nano vàng lai ghép
• 2.4. Kết quả nghiên cứu giải phóng thuốc in vitro
• 2.4.1. Giải phóng 5-FU từ các vật liệu nanogel
• 2.4.2. Giải phóng 5-FU từ các vật liệu nano lai ghép AuNPs/CD-x
• 2.5. Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Hạt Nano Dựa Trên β Cyclodextrin Trong Điều Trị Ung Thư

Hạt nano dựa trên β-Cyclodextrin (β-CD) đang trở thành một trong những công nghệ tiên tiến trong lĩnh vực điều trị ung thư. Với khả năng tạo phức chất và tính tương thích sinh học cao, β-CD cho phép cải thiện hiệu quả của các loại thuốc chống ung thư. Việc sử dụng β-CD làm chất mang thuốc không chỉ giúp tăng cường khả năng hòa tan mà còn giảm thiểu tác dụng phụ của thuốc. Nghiên cứu cho thấy rằng các hạt nano này có thể cải thiện khả năng phân phối thuốc đến các tế bào ung thư, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

1.1. Tính Chất Của β Cyclodextrin Trong Ứng Dụng Y Học

β-CD có khả năng tạo phức với các phân tử thuốc, giúp cải thiện tính hòa tan và ổn định của thuốc trong môi trường sinh học. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc phát triển các hệ thống phân phối thuốc hiệu quả. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-CD có thể tạo ra các phức chất ổn định với nhiều loại thuốc khác nhau, từ đó nâng cao khả năng điều trị.

1.2. Lịch Sử Phát Triển Hạt Nano Dựa Trên β Cyclodextrin

Sự phát triển của hạt nano dựa trên β-CD bắt đầu từ những năm 1990, khi các nhà khoa học nhận ra tiềm năng của β-CD trong việc cải thiện hiệu quả của thuốc. Kể từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tối ưu hóa cấu trúc và tính chất của các hạt nano này, nhằm phục vụ cho việc điều trị ung thư hiệu quả hơn.

II. Vấn Đề Trong Việc Sử Dụng β Cyclodextrin Trong Điều Trị Ung Thư

Mặc dù β-CD có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc ứng dụng chúng trong điều trị ung thư. Một trong những vấn đề chính là khả năng hòa tan của β-CD trong nước, điều này có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của thuốc. Ngoài ra, việc tạo phức chất với các phân tử thuốc có kích thước lớn cũng gặp khó khăn. Những thách thức này cần được giải quyết để tối ưu hóa việc sử dụng β-CD trong y học.

2.1. Khó Khăn Trong Việc Tạo Phức Chất Với Thuốc

Việc tạo phức chất giữa β-CD và các thuốc chống ung thư có thể gặp khó khăn do kích thước và tính chất hóa học của thuốc. Điều này có thể dẫn đến việc giảm hiệu quả điều trị và tăng nguy cơ tác dụng phụ.

2.2. Độ Hòa Tan Thấp Của β Cyclodextrin

Độ hòa tan thấp của β-CD trong nước là một trong những vấn đề lớn nhất trong việc ứng dụng chúng. Điều này có thể làm giảm khả năng phân phối thuốc đến các tế bào ung thư, từ đó ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị.

III. Phương Pháp Tổng Hợp Hạt Nano Dựa Trên β Cyclodextrin

Có nhiều phương pháp khác nhau để tổng hợp hạt nano dựa trên β-CD. Các phương pháp này bao gồm việc sử dụng các dẫn xuất của β-CD để cải thiện tính chất của hạt nano. Việc tối ưu hóa quy trình tổng hợp là rất quan trọng để đạt được các hạt nano có kích thước và tính chất mong muốn.

3.1. Quy Trình Tổng Hợp Các Dẫn Xuất Amine Của β CD

Quy trình tổng hợp các dẫn xuất amine của β-CD bao gồm việc sử dụng các phản ứng hóa học để tạo ra các dẫn xuất mới. Những dẫn xuất này có thể cải thiện khả năng tạo phức và tính hòa tan của β-CD trong nước.

3.2. Kỹ Thuật Chiếu Xạ Trong Tổng Hợp Hạt Nano

Kỹ thuật chiếu xạ vi sóng đã được áp dụng để tổng hợp các hạt nano dựa trên β-CD. Phương pháp này giúp rút ngắn thời gian phản ứng và cải thiện hiệu suất tổng hợp, từ đó tạo ra các hạt nano có tính chất tốt hơn.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Hạt Nano Dựa Trên β Cyclodextrin Trong Điều Trị Ung Thư

Hạt nano dựa trên β-CD đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu lâm sàng để điều trị ung thư. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng hạt nano này có thể cải thiện khả năng phân phối thuốc và giảm thiểu tác dụng phụ. Điều này mở ra nhiều triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Về Hiệu Quả Điều Trị

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng hạt nano dựa trên β-CD có thể cải thiện hiệu quả điều trị ung thư. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy rằng việc sử dụng hạt nano này giúp tăng cường khả năng phân phối thuốc đến các tế bào ung thư.

4.2. Tính Tương Thích Sinh Học Của Hạt Nano

Tính tương thích sinh học cao của hạt nano dựa trên β-CD là một yếu tố quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư. Điều này giúp giảm thiểu tác dụng phụ và tăng cường hiệu quả điều trị.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của Hạt Nano Dựa Trên β Cyclodextrin Trong Y Học

Tương lai của hạt nano dựa trên β-CD trong y học rất hứa hẹn. Với những tiến bộ trong công nghệ tổng hợp và nghiên cứu, hạt nano này có thể trở thành một công cụ quan trọng trong điều trị ung thư. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả của các liệu pháp điều trị.

5.1. Triển Vọng Nghiên Cứu Trong Tương Lai

Nghiên cứu về hạt nano dựa trên β-CD sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu cải thiện hiệu quả điều trị ung thư. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc và tính chất của hạt nano.

5.2. Ứng Dụng Trong Các Lĩnh Vực Khác

Ngoài điều trị ung thư, hạt nano dựa trên β-CD còn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như dược phẩm, mỹ phẩm và công nghệ sinh học. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát triển các sản phẩm y tế hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Nguyễn Cao Hiền có tiêu đề: "Tổng hợp các hạt nano trên cơ sở $\beta$-cyclodextrin và $\beta$-cyclodextrin biến tính làm chất mang thuốc điều trị ung thư", chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số 9.14, được thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Đặng Chí Hiền và cố GS. Nguyễn Công Hào (năm 2023).

• Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu: $\beta$-cyclodextrin ($\beta$-CD) là oligosaccharide mạch vòng tự nhiên có cấu trúc nón cụt với khoang kỵ nước và bề mặt ngoài ưa nước, có khả năng tạo phức lồng chủ - khách (host - guest) giúp cải thiện độ bền và độ tan của các dược chất. Tuy nhiên, $\beta$-CD nguyên bản có độ hòa tan trong nước thấp, năng lượng mạng tinh thể cao do hệ thống liên kết hydro nội phân tử và kém hiệu quả khi tương tác với các phân tử tích điện hoặc có kích thước không tương thích. Dược chất 5-Fluorouracil (5-FU) là tác nhân hóa trị liệu phổ biến trong điều trị ung thư đại trực tràng, vú và tiêu hóa nhưng có thời gian bán hủy ngắn (8–20 phút), chuyển hóa nhanh bởi dihydropyrimidine dehydrogenase và gây độc tính toàn thân đối với tủy xương và đường tiêu hóa. Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là việc thiếu các quy trình tổng hợp xanh, nhanh để tạo dẫn xuất amine của $\beta$-CD và việc phát triển các hệ chất mang nano lai ghép mới (nanogel polysaccharide và nano vàng chức năng hóa) nhằm tăng dung lượng tải thuốc, hạn chế rò rỉ dược chất và kiểm soát giải phóng 5-FU theo pH môi trường.
• Mục tiêu nghiên cứu:
  1. Nghiên cứu tổng hợp các vật liệu nano trên cơ sở $\beta$-CD và $\beta$-CD biến tính.
  2. Ứng dụng thử nghiệm phân phối thuốc trị ung thư 5-Fluorouracil.
• Nội dung nghiên cứu (đánh số theo văn bản luận án):
  1. Tổng hợp một số dẫn xuất amine của $\beta$-cyclodextrin;
  2. Điều chế các vật liệu nano trên cơ sở $\beta$-CD và $\beta$-CD biến tính;
  3. Khảo sát điều kiện thích hợp cho quá trình tổng hợp các hệ nano mang thuốc trị ung thư 5-Fluorouracil;
  4. Xác định cấu trúc, hình thái và các đặc trưng của các hệ nano tổng hợp được;
  5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các dẫn xuất $\beta$-CD-x đến kích thước hạt, khả năng mang và giải phóng thuốc trị ung thư 5-Fluorouracil;
  6. Nghiên cứu khả năng gây độc tế bào của các hệ nano trước và sau khi mang thuốc.
• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu: $\beta$-cyclodextrin ($\beta$-CD), các dẫn xuất biến tính gồm mono-6-amino-deoxy-6-$\beta$-cyclodextrin ($\text{CD-NH}_2$), mono-(6-(1,3-trimethylenediamine)-6-deoxy)-$\beta$-cyclodextrin (TMACD), mono-(6-(1,6-hexamethylenediamine)-6-deoxy)-$\beta$-cyclodextrin (HMACD), (2-hydroxypropyl)-$\beta$-cyclodextrin (HPCD); polymer natri alginat; hạt nano vàng ($\text{AuNPs}$); thuốc trị ung thư 5-Fluorouracil (5-FU).
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm tổng hợp hữu cơ trong phòng thí nghiệm; biến tính chọn lọc vị trí C-6 bằng vi sóng; tạo phức đa ion nanogel với $\text{Ca}^{2+}$ và alginat; khử muối $\text{HAuCl}_4$ bằng $\beta$-CD-x dưới hỗ trợ siêu âm; đánh giá giải phóng in vitro ở hai môi trường đệm $\text{pH } 7{,}4$ và $\text{pH } 1{,}2$; thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên các dòng tế bào ung thư.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Văn bản luận án điểm lại quá trình phát triển của cyclodextrin và các hệ mang nano qua các mốc nghiên cứu trong và ngoài nước:

• Lịch sử nghiên cứu cyclodextrin và dẫn xuất: CD được Villiers mô tả lần đầu vào năm 1891 dưới các tên gọi cyclomylose hay Schardinger dextrin. Brown và cộng sự (thập niên 1990) thực hiện phản ứng giữa $\text{Ts-}\alpha\text{-CD}$ và amoniac đậm đặc tạo $\text{H}_2\text{N-}\alpha\text{-CD}$ (hiệu suất 70%) và $\text{H}_2\text{N-}\beta\text{-CD}$ (hiệu suất 54%). Keita Hamasaki và cộng sự (1993) tổng hợp dẫn xuất amine của CD ứng dụng làm cảm biến huỳnh quang. Weihua Tang (2008) tổng hợp hydrochlorid của mono-6-amino-6-deoxy-$\alpha$-, $\beta$-, $\gamma$-cyclodextrin để phân tách đối quang và phân phối thuốc. Timothy Tan và Siu-choon Ng (2011) cải tiến quy trình nhiệt tổng hợp mono-6-tosyl-$\beta$-cyclodextrin ($\text{Ts-CD}$).
• Ứng dụng CD trong phân phối thuốc ung thư: Dai và cộng sự phát triển hạt nano siêu phân tử permethyl-$\beta$-CD/camptothecin kết hợp porphyrin trên tế bào ung thư phổi A549. Guimarães và cộng sự tạo phức CD với chất ức chế LGK974 dùng đường uống. Vaidya và cộng sự bao bọc erlotinib bằng $\beta$-CD và PLGA trên tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Wang và đồng nghiệp tạo phức resveratrol với sulfobutylether-$\beta$-CD. Lin và cộng sự tổng hợp copolymer polycaprolactone-$\beta$-CD gắn acid folic mang metformin giải phóng nhanh ở $\text{pH } 6{,}4$. Altoom và cộng sự bao bọc oxaliplatin bằng phức $\beta\text{-CD/phillipsite}$ kháng dòng tế bào đại trực tràng HCT-116. Elamine và cộng sự tổng hợp methyl-$\beta$-CD gắn folate phối hợp acid hyaluronic mang dược chất trên tế bào HCT-116. Mousazadeh công bố hạt nano polyethylenimine-$\beta$-CD gắn folate đồng vận chuyển doxorubicin và hTERT-siRNA.
• Các hệ nanogel trên nền CD: Trotta et al. (2011), Daoud-Mahammed et al. (2009), Moya-Ortega et al. (2012), Liu et al. (2009), Kettel et al. phát triển các kỹ thuật liên kết ngang monomer CD hoặc tạo gel lắp ráp khóa - chìa (key - lock assembly).
• Hệ nano vàng lai ghép ($\text{AuNPs/CD}$): Liu và cộng sự (2000) khử $\text{AuCl}_4^-$ bằng $\text{NaBH}_4$ gắn thiol-cyclodextrin tạo ống nano 2–7 nm. Park C (2009) dùng $\text{AuNPs}$ 27 nm phủ CD mang thuốc $\beta$-lapachone. Huang T và cộng sự chỉ ra pH kiểm soát sự hình thành hạt phân tán hoặc dây nano 1D/3D. Zhu L và cộng sự tổng hợp lai ghép rotaxane trên $\text{AuNPs}$. Shi Y và cộng sự ghép adamantane-oxoplatin lên $\text{AuNPs}$ phủ CD. Sierpe R và cộng sự (2015) phún xạ từ $\text{AuNPs}$ lên tinh thể $\beta\text{-CD-PhEA}$, ghi nhận độ hấp thụ SPR ở 533 nm. Stiufiu G và cộng sự khử muối vàng bằng $\alpha$-, $\beta$-, $\gamma$-CD trong lò vi sóng dưới 10 phút. Silva N và cộng sự (2016, 2018) nghiên cứu phức bao $\text{AuNPs}$ mang methotrexate (MTX). Granet R và cộng sự bao bọc phức porphyrin bằng $\text{AuNP@PEI@CD}$ (30–45 nm) thử nghiệm trên dòng HT-29 và HCT-116. Slavgorodska (2021) mô phỏng động lực học phân tử (MD) quá trình chức năng hóa $\gamma$-CD lên $\text{AuNPs}$.
• Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam: Lê Thị Thu Cúc và cộng sự (2011) tổng hợp các dẫn chất heptakis của $\beta$-CD tách đồng phân quang học gồm Heptakis (2,3,6-tri-O-acetyl)-$\beta$-CD (hiệu suất 59,8%), Heptakis [2,3,6-tri-O-(2-morpholinyl isobutyryl)]-$\beta$-CD (74,8%) và Heptakis (2,3-di-O-acetyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl)-$\beta$-CD (81,5%). Phùng Đức Truyền và cộng sự (2014) tổng hợp 2-hydroxypropyl-$\beta$-CD (79,79%) và 2-hydroxybutyl-$\beta$-CD (77,89%) làm tá dược hòa tan itraconazol, rutin, meloxicam. Về nano vàng, Phan Hà Nữ Diễm và cộng sự (2019) tổng hợp $\text{AuNPs}$ 6–15 nm bằng dextran ở $\text{pH } 12$; Đỗ Thị Huế và cộng sự (2020) chế tạo $\text{AuNPs}$ 5 nm bằng $\text{NaBH}_4/\text{CTAB}$; Võ Quốc Khương và cộng sự (2020) tổng hợp nano vàng hình sao 55 nm bằng chitosan; Nguyễn Thị Lan Hương và cộng sự (2021) khử $\text{HAuCl}_4$ bằng dịch chiết vỏ dứa tạo hạt 5–15 nm xúc tác khử 4-nitrophenol ($k = 0{,}233\text{ phút}^{-1}$).
• Khoảng trống luận án giải quyết: Mặc dù các nghiên cứu về CD và nano vàng riêng lẻ phong phú, việc tổng hợp các dẫn xuất amine mạch thẳng của $\beta$-CD (TMACD, HMACD) bằng kỹ thuật vi sóng nhằm thay thế quy trình nhiệt kéo dài chưa được tối ưu hóa toàn diện. Đồng thời, việc ứng dụng đồng thời hai hệ mang: nanogel tĩnh điện $\beta\text{-CD-x/alginate}$ và hệ lai ghép $\text{AuNPs/CD-x}$ để kiểm soát động học giải phóng thuốc 5-FU theo các giá trị pH khác nhau vẫn chưa được công bố đầy đủ trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên lý thuyết hóa học siêu phân tử host - guest, hóa học các hợp chất thiên nhiên carbohydrate và công nghệ nano keo:

1. Khung lý thuyết: Phân tử $\beta$-CD gồm 7 đơn vị D-glucopyranose dạng ghế tạo cấu trúc nón cụt. Mặt đáy hẹp chứa 7 nhóm hydroxyl bậc một ở vị trí C-6; mặt đáy rộng chứa 14 nhóm hydroxyl bậc hai ở C-2 và C-3. Quá trình biến tính chọn lọc xảy ra chủ yếu ở nhóm OH bậc một do tính nucleophile cao hơn. Việc đưa nhóm amine vào khung phân tử tạo tâm tích điện dương, tăng cường tương tác tĩnh điện và tạo liên kết phối trí với bề mặt hạt kim loại. Hệ nanogel được hình thành dựa trên cơ chế tạo phức đa ion (polyelectrolyte complexes) giữa ion carboxylate ($\text{-COO}^-$) của alginat với $\text{Ca}^{2+}$ và các nhóm chức của $\beta$-CD biến tính. Hệ $\text{AuNPs/CD-x}$ tận dụng năng lực khử ion $\text{Au}^{3+}$ về $\text{Au}^0$ của dẫn xuất CD trong môi trường kiềm và lực đẩy tĩnh điện từ nhóm amine giúp hạt nano không bị kết tụ.
2. Hóa chất sử dụng:

STT	Tên hóa chất	Công thức hóa học / Độ tinh khiết	Hãng sản xuất
1	Sodium alginate	$\text{C}_6\text{H}_7\text{NaO}_6$ (99,5%)	Acros
2	$\beta$-cyclodextrin	$\text{C}{42}\text{H}{70}\text{O}_{35}$ (99,8%)	Acros
3	(2-Hydroxypropyl)-$\beta$-cyclodextrin	$\text{C}{63}\text{H}{112}\text{O}_{42}$ (99,5%)	Acros
4	Triacetyl-$\beta$-cyclodextrin	$\text{C}{84}\text{H}{112}\text{O}_{56}$ (99,5%)	Acros
5	p-Toluenesulfonylchloride (TsCl)	$\text{CH}_3\text{C}_6\text{H}_4\text{SO}_2\text{Cl}$ (99,8%)	Acros
6	Dichloromethane	$\text{CH}_2\text{Cl}_2$ (99,8%)	Macron
7	Silica gel 230–400 mesh	$\text{SiO}_2$ (99%)	HiMedia
8	Sodium hydroxide	$\text{NaOH}$ (99,8%)	Merck
9	5-Fluorouracil (5-FU)	$\text{C}_4\text{H}_3\text{FN}_2\text{O}_2$	Acros
10	Calcium chloride	$\text{CaCl}_2$ (99,8%)	Merck
11	Tetrachloroauric acid	$\text{HAuCl}_4$ (99,8%)	Merck / Acros
12	1,3-Diaminopropane	$\text{C}3\text{H}{10}\text{N}_2$ (99,5%)	Acros
13	1,6-Hexanediamine	$\text{C}6\text{H}{16}\text{N}_2$ (99,5%)	Acros
14	Màng thẩm tách	MWCO 3–5 kDa	Spectra/Por

3. Hệ thống thiết bị phân tích:
   • Cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker AVANCE 500 MHz ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$).
   • Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier: Tensor 27 FT-IR (Bruker).
   • Khối phổ: Agilent 6120 MS và X500R QTOF-MS.
   • Kính hiển vi điện tử: TEM JEM-1400 / S-4800, HR-TEM JEOL JEM 2100 và FESEM S-4800.
   • Nhiễu xạ tia X: Bruker D8 Advance (XRD).
   • Kích thước hạt và thế zeta: SZ-100 HORIBA (kỹ thuật DLS và tán xạ điện di).
   • Quang phổ tử ngoại - khả kiến: JASCO V-630 UV-Vis Spectrophotometer.
   • Phân tích nhiệt: Phân tích nhiệt vi sai và nhiệt trọng lượng LabSys Evo 1600 (TGA/DTA).
   • Sắc ký lỏng hiệu năng cao: Agilent 1100 series (HPLC).
   • Thiết bị phản ứng và xử lý mẫu: Lò vi sóng R-218L(S), bể siêu âm Skymen 200 W (40 kHz), máy sấy thăng hoa Micromodulyo Freeze Dryer.
4. Phương pháp đánh giá giải phóng in vitro và độc tính:
   • Phương pháp màng thẩm tách (dialysis membrane method, túi thẩm tách MWCO 3–5 kDa) được lựa chọn vì độ tin cậy và hạn chế thất thoát hạt nano so với phương pháp phân lập mẫu (SS) hay dòng chảy liên tục (CF). Môi trường thử nghiệm gồm dung dịch đệm ở $\text{pH } 7{,}4$ (mô phỏng dịch thể sinh lý) và $\text{pH } 1{,}2$ (mô phỏng dịch vị dạ dày) tại nhiệt độ $37^\circ\text{C}$.
   • Khảo sát độc tính tế bào in vitro trước và sau khi nạp dược chất 5-FU.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về cấu tạo $\beta$-cyclodextrin, tính chất hóa lý, khả năng tạo phức lồng host - guest và các phương pháp biến tính hóa học. $\beta$-CD gồm 7 đơn vị glucose liên kết qua liên kết $\alpha$-1,4-glycoside, có độ tan hạn chế trong nước do mạng liên kết hydro giữa các nhóm OH bậc hai ở rìa rộng. Quá trình tạo phức không làm đứt gãy hoặc hình thành liên kết cộng hóa trị mới mà do sự thế chỗ các phân tử nước có năng lượng enthalpy cao trong lỗ rỗng kỵ nước bằng phân tử khách, làm bền hóa hệ nhờ tương tác Van der Waals và liên kết hydro.

Phần tổng quan phân tích đặc điểm dược lý của thuốc 5-Fluorouracil (Adrucil, khối lượng phân tử 130,077 g/mol). Khi vào cơ thể, 5-FU chuyển hóa thành 5-fluoro-2-deoxyuridine 5'-monophosphate (5-FdUMP), ức chế thymidylate synthase gây cản trở tổng hợp ADN. Dược chất thải trừ 60% qua đường hô hấp, chuyển hóa qua gan và có thời gian bán thải ngắn (8–20 phút). Chương này cũng so sánh ưu nhược điểm của 3 kỹ thuật khảo sát giải phóng thuốc in vitro (phân lập mẫu SS, dòng chảy liên tục CF, màng thẩm tách DM), xác định phương pháp thẩm tách thuận là quy trình tối ưu cho các hệ phân tán nano polymer.

Chương 2. Nghiên cứu – Thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết quy trình tổng hợp hóa học, quy trình chế tạo vật liệu nano và các phương pháp phân tích:

• Tổng hợp dẫn xuất trung gian:
  • 1-(p-toluenesulfonyl) imidazole (TsIm): Phản ứng giữa 10 g (52,5 mmol) TsCl và 8 g (118 mmol) imidazole trong 500 mL $\text{CH}_2\text{Cl}_2$ khô ở $0^\circ\text{C}$ trong 4 giờ dưới khí $\text{N}_2$. Hỗn hợp được lọc qua phễu Buchner chứa silica gel, rửa bằng hỗn hợp ethyl acetate/hexane (1:1), cô quay và kết tinh lại trong ethyl acetate/hexane (1:10).
  • Mono-6-(p-toluenesulfonyl)-6-deoxy-$\beta$-cyclodextrin (Ts-CD): Phản ứng giữa 17,51 g (15,42 mmol) $\beta$-CD (sấy chân không $80^\circ\text{C}$, 24 giờ) và 4,45 g (20 mmol) TsIm trong 175 mL nước cất ở $0^\circ\text{C}$ trong 4 giờ. Sau đó thêm từ từ 25 mL dung dịch $\text{NaOH } 20%$, khuấy 10 phút, lọc bỏ phần không tan và trung hòa bằng $\text{NH}_4\text{Cl}$ về $\text{pH } 7$. Tủa rắn trắng được sấy chân không ở $60^\circ\text{C}$ (10 mmHg), $R_f = 0{,}6$ (hệ dung môi butanol : ethanol : nước = 5 : 4 : 3).
• Tổng hợp các dẫn xuất amine:
  • Mono-6-azide-deoxy-6-$\beta$-cyclodextrin ($\text{CD-N}_3$): Phản ứng giữa 0,5 g Ts-CD (0,39 mmol) và 0,5 g $\text{NaN}_3$ (7,69 mmol) trong 50 mL nước cất, đun hồi lưu ở $100^\circ\text{C}$ trong 12 giờ. Dung dịch được cô đặc loại $\ge 95%$ nước, khuấy với 1,1,2,2-tetrachloroethane trong 30 phút, bốc hơi dung môi và kết tinh lại trong nước nóng.
  • Mono-6-amino-deoxy-6-$\beta$-cyclodextrin ($\text{CD-NH}_2$): Khử 3,5 g $\text{CD-N}_3$ (3 mmol) bằng 0,9 g triphenylphosphine (3,4 mmol) trong 8 mL DMF ở nhiệt độ phòng 2 giờ, thêm 6 mL nước, nâng nhiệt lên $90^\circ\text{C}$ kết hợp chiếu xạ vi sóng 30 phút, kết tủa trong acetone, sấy khô ở $60^\circ\text{C}$.
  • TMACD và HMACD: Cho 0,5 g Ts-CD (0,42 mmol) phản ứng với 3,3 mL (38,67 mmol) 1,3-diaminopropane hoặc 1,5 g (38,67 mmol) 1,6-diaminohexane. Chiếu xạ vi sóng có hồi lưu ở công suất 300 W trong 12 phút. Kết tủa trong 600 mL ethanol tuyệt đối, lọc rửa 3 lần bằng ethanol tuyệt đối và sấy chân không ở $60^\circ\text{C}$. Sắc ký lớp mỏng ghi nhận: TMACD có $R_f = 0{,}49$ (butanol : ethanol : nước : ammoniac = 5 : 4 : 3 : 5); HMACD có $R_f = 0{,}49$ (butanol : ethanol : nước = 5 : 4 : 3).
• Quy trình chế tạo nanogel $\beta\text{-CD-x/alginate}$: Nhỏ từ từ dung dịch $\text{CaCl}_2$ (10 mg/mL) vào dung dịch natri alginat (10 mg/mL), khuấy từ tốc độ 1200 rpm trong 90 phút, siêu âm không gia nhiệt 60 phút, ổn định gel 24 giờ. Ly tâm tách gel ở 4000 rpm trong 15 phút, rửa 3 lần bằng nước khử ion. Phân tán lại gel, nhỏ từ từ dung dịch $\beta$-CD-x (2 mg/mL), khuấy 1200 rpm trong 90 phút, siêu âm 60 phút, ổn định gel 24 giờ, ly tâm rửa 2 lần và sấy thăng hoa ($-28^\circ\text{C}$, áp suất 25 Pa, thời gian 20 giờ).
• Quy trình chế tạo nano vàng lai ghép ($\text{AuNPs/CD-x}$): Khử 11,85 mL $\text{HAuCl}_4$ (0,16 mM) bằng 3 mL dung dịch $\beta$-CD-x (khảo sát nồng độ 5–20 mM, pH 8–12 điều chỉnh bằng $\text{NaOH } 1\text{ M}$, nhiệt độ $40–90^\circ\text{C}$, thời gian 0–50 phút) dưới sóng siêu âm công suất 200 W (tần số 40 kHz), sau đó sấy thăng hoa ở $-28^\circ\text{C}$, 25 Pa trong 20 giờ.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả phân tích cấu trúc, đặc trưng hóa lý, mô phỏng liên kết và thử nghiệm giải phóng thuốc:

• Xác nhận cấu trúc dẫn xuất amine: Cấu trúc TsIm, Ts-CD, $\text{CD-N}_3$, $\text{CD-NH}_2$, TMACD và HMACD được khẳng định qua phổ ESI-MS, FT-IR, $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$. Đối với tổng hợp TMACD, thực nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol tác chất và công suất vi sóng chỉ ra điều kiện tối ưu đạt hiệu suất cao tại công suất 300 W trong thời gian 12 phút, rút ngắn đáng kể so với phương pháp đun hồi lưu nhiệt truyền thống kéo dài hàng chục giờ.
• Đặc trưng hệ nanogel $\beta\text{-CD-x/alginate}$: Tỷ lệ thành phần $\text{CD-x : Alginate}$, tốc độ khuấy (1200 rpm) và thời gian phản ứng quyết định hiệu suất thu hồi và độ phân tán hạt. Phổ FT-IR của nanogel $\beta\text{-CD/Alg}$, $\text{HPCD/Alg}$, $\text{TMACD/Alg}$ và dạng nạp thuốc $\text{5-FU@CD-x/Alg}$ chứng minh sự hiện diện của các nhóm chức carboxylate, liên kết ete và tín hiệu đặc trưng của 5-FU. Kích thước hạt DLS và thế zeta của các hệ nanogel biến thiên tương ứng theo cấu trúc dẫn xuất CD sử dụng; ảnh TEM xác nhận dạng hình cầu đồng nhất.
• Đặc trưng hệ nano vàng lai ghép ($\text{AuNPs/CD-x}$): Quá trình hình thành keo nano vàng được theo dõi qua phổ UV-Vis với đỉnh cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) rõ rệt trong vùng 500–550 nm. Màu sắc dung dịch chuyển từ vàng nhạt sang đỏ rượu vang khi nồng độ CD-x tăng từ 0 đến 20 mM và pH tăng từ 8 đến 12. Phổ FT-IR xác nhận tương tác liên kết giữa nhóm amine/hydroxyl của CD-x với bề mặt AuNPs. Thế zeta của hệ mang điện tích âm hoặc dương tùy thuộc vào nhóm chức amine bề mặt, giúp hệ bền vững nhờ lực đẩy tĩnh điện. Giản đồ XRD chứng minh cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt của AuNPs. Ảnh HR-TEM và phân tích nhiễu xạ vùng chọn lọc SAED của $\text{AuNPs/CD}$ khẳng định các mặt mạng tinh thể kim loại. Đường cong phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) cho thấy độ bền nhiệt của hệ nanocomposite cao hơn so với 5-FU tự do.
• Khả năng mang thuốc và mô phỏng phân tử: Đánh giá hiệu suất nang hóa (EE) và dung lượng tải thuốc (DL) của các hệ vật liệu cho thấy dẫn xuất amine và nanogel alginat làm tăng tỷ lệ lưu giữ 5-FU. Kết quả mô phỏng docking phân tử xác định các liên kết hydro bền vững nhất giữa 5-FU với khung CD-x tại: cấu trạng pose 244 đối với $\beta$-CD, pose 71 đối với HPCD và pose 60 đối với TMACD.
• Kết quả giải phóng thuốc in vitro: Thử nghiệm giải phóng 5-FU qua màng thẩm tách ở $\text{pH } 7{,}4$ và $\text{pH } 1{,}2$ cho thấy:
  • Hệ $\text{5-FU@}\beta\text{-CD/Alg}$ kiểm soát tốc độ giải phóng chậm và kéo dài; ở $\text{pH } 1{,}2$ tốc độ giải phóng chậm hơn so với $\text{pH } 7{,}4$ do mạng lưới alginat co cụm trong môi trường acid. Ảnh TEM của hạt nano thu hồi sau 48 giờ giải phóng xác nhận khung cấu trúc hạt vẫn duy trì ổn định.
  • Các hệ nano vàng lai ghép $\text{5-FU@AuNPs/CD-x}$ phóng thích thuốc nhạy cảm với pH; ảnh TEM thu hồi sau 24 giờ giải phóng chứng minh hạt không bị kết tụ dị thể quy mô lớn.
• Kết quả thử nghiệm độc tính tế bào: Thử nghiệm in vitro cho thấy các mẫu nanocomposite không mang thuốc có độ tương thích sinh học cao và tỷ lệ gây chết tế bào thấp; ngược lại, các hệ nạp 5-FU duy trì hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư tương đương hoặc vượt trội so với thuốc tự do ở cùng nồng độ tiếp xúc.

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về phương pháp tổng hợp hữu cơ: Tác giả đã tổng hợp thành công các dẫn xuất amine của $\beta$-cyclodextrin bao gồm $\text{CD-NH}_2$, TMACD và HMACD bằng kỹ thuật chiếu xạ vi sóng. Phương pháp này nâng cao hiệu suất tổng hợp, hạn chế sử dụng lượng lớn dung môi độc hại tác động đến môi trường và rút ngắn thời gian phản ứng xuống còn 12–30 phút so với quy trình hồi lưu nhiệt thông thường.
2. Đóng góp về chế tạo vật liệu nano y sinh: Lần đầu tiên một nhóm vật liệu nano dựa trên cơ sở $\beta$-CD và $\beta$-CD biến tính (gồm hệ nanogel phức đa ion $\beta\text{-CD-x/alginate}$ và hệ nano vàng lai ghép $\text{AuNPs/}\beta\text{-CD-x}$) được chế tạo hoàn chỉnh và ứng dụng thử nghiệm phân phối thuốc trị ung thư 5-Fluorouracil. Các thông số tối ưu về nồng độ dẫn xuất (5–20 mM), pH môi trường (8–12), nhiệt độ và thời gian phản ứng trong quá trình tổng hợp $\text{AuNPs}$ bằng sóng siêu âm cung cấp dữ liệu thực nghiệm cho lĩnh vực vật liệu nano kim loại lai ghép y dược.
3. Kiến nghị và giải pháp đề xuất: Luận án kiến nghị mở rộng quy trình tổng hợp vi sóng cho các dẫn xuất cyclodextrin mang nhóm chức khác; ứng dụng mô hình phối hợp giữa khoang siêu phân tử CD và mạng lưới polymer tự nhiên để bào chế các hệ phân phối thuốc hướng đích đáp ứng kích thích pH.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các đánh giá động học giải phóng thuốc 5-Fluorouracil và hoạt tính ức chế tế bào ung thư trong luận án hoàn toàn thực hiện ở điều kiện in vitro trên mô hình phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm dược động học, khả năng phân bố sinh học và tính an toàn in vivo trên mô hình động vật sống. Các dẫn xuất amine mạch thẳng được khảo sát tập trung vào mạch carbon ngắn đến trung bình ($\text{C}_3$ và $\text{C}_6$).
• Hướng nghiên cứu tiếp: Nghiên cứu mở rộng thử nghiệm in vivo đánh giá khả năng hướng đích khối u của hệ vật liệu $\text{AuNPs/CD-x}$; gắn kết thêm các phối tử hướng đích chủ động (như acid folic hoặc kháng thể chuyên biệt) lên bề mặt dẫn xuất amine của $\beta$-CD; khảo sát độ ổn định dài hạn của hệ keo nanocomposite trong huyết tương mô phỏng.

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa dược: Luận án cung cấp chi tiết các quy trình tổng hợp chọn lọc vị trí C-6 trên khung $\beta$-cyclodextrin (Chương 2), đặc biệt là quy trình sử dụng tác chất tosylimidazole thay thế tosylchloride và kỹ thuật kích hoạt phản ứng bằng vi sóng kèm thông số sắc ký bản mỏng ($R_f$) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
• Đối với các nhà khoa học công nghệ nano y sinh: Luận án cung cấp các thông số thực nghiệm chế tạo nanogel đa ion và keo nano vàng chức năng hóa, cùng phương pháp luận đánh giá giải phóng dược chất qua màng thẩm tách kết hợp phân tích cấu trạng bằng mô phỏng docking phân tử (Chương 3).
• Đối với cơ sở đào tạo và giảng viên đại học: Tài liệu là nguồn tham khảo phục vụ giảng dạy các chuyên đề hóa học siêu phân tử, hóa học carbohydrate biến tính và kỹ thuật đặc trưng hóa lý vật liệu (FT-IR, DLS, SAED, HR-TEM, TGA).

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện kỹ thuật tối ưu để tổng hợp dẫn xuất TMACD bằng vi sóng là gì? Phản ứng được thực hiện giữa 0,5 g Ts-CD (0,42 mmol) và 3,3 mL 1,3-diaminopropane (38,67 mmol) trong điều kiện chiếu xạ vi sóng có hồi lưu ở công suất 300 W trong 12 phút. Sản phẩm được thu hồi bằng cách kết tủa trong 600 mL ethanol tuyệt đối, rửa 3 lần và sấy chân không ở $60^\circ\text{C}$ (10 mmHg), cho giá trị $R_f = 0{,}49$ trên bản mỏng silicagel (hệ butanol : ethanol : nước : ammoniac = 5 : 4 : 3 : 5).

2. Cơ chế tạo gel của hệ nanogel $\beta\text{-CD-x/alginate}$ diễn ra như thế nào? Hệ nanogel được hình thành theo cơ chế tạo phức đa ion (polyelectrolyte complexes). Dung dịch natri alginat (10 mg/mL) phản ứng tạo liên kết chéo với ion $\text{Ca}^{2+}$ từ dung dịch $\text{CaCl}_2$ (10 mg/mL) dưới tác động khuấy 1200 rpm và sóng siêu âm 40 kHz để tạo các vi hạt gel (gelispheres). Sau đó, các phân tử $\beta$-CD-x được đưa vào mạng lưới thông qua liên kết tĩnh điện và liên kết hydro, hoàn thiện cấu trúc bằng quá trình ổn định gel 24 giờ và sấy thăng hoa ở $-28^\circ\text{C}$, 25 Pa trong 20 giờ.

3. Vai trò của $\beta$-cyclodextrin biến tính trong quá trình chế tạo hạt nano vàng ($\text{AuNPs}$) là gì? $\beta$-CD biến tính đóng vai trò kép: vừa là chất khử ion $\text{Au}^{3+}$ ($\text{HAuCl}_4$) về $\text{Au}^0$ trong môi trường base ($\text{pH } 8–12$), vừa là chất ổn định bề mặt. Sự có mặt của các nhóm amine trên $\beta$-CD-x tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt vàng lân cận và các cặp electron tự do hỗ trợ liên kết phối trí lên bề mặt $\text{AuNPs}$, ngăn ngừa hiện tượng tụ đám hạt keo.

4. Mô phỏng docking phân tử cho kết quả cấu trạng liên kết bền nhất giữa 5-FU và các chủ thể cyclodextrin như thế nào? Kết quả tính toán docking xác định cấu trạng bền nhất thông qua hệ thống liên kết hydro hình thành giữa dược chất 5-FU với từng phân tử chủ thể tại các tư thế (poses): pose 244 đối với $\beta$-cyclodextrin nguyên bản ($\beta$-CD), pose 71 đối với (2-hydroxypropyl)-$\beta$-cyclodextrin (HPCD) và pose 60 đối với mono-(6-(1,3-trimethylenediamine)-6-deoxy)-$\beta$-cyclodextrin (TMACD).

5. Tại sao phương pháp màng thẩm tách (dialysis membrane) được chọn để thử nghiệm giải phóng thuốc in vitro thay vì phương pháp dòng chảy liên tục (CF) hay phân lập mẫu (SS)? Phương pháp phân lập mẫu (SS) gặp khó khăn trong việc tách hoàn toàn các hạt nano khỏi pha lỏng nếu không dùng ly tâm siêu tốc. Phương pháp dòng chảy liên tục (CF) đòi hỏi chi phí thiết bị cao, nguy cơ tắc nghẽn bộ lọc và thất thoát thuốc do hấp phụ lên màng lọc/ống dẫn. Phương pháp thẩm tách sử dụng túi màng MWCO 3–5 kDa cho phép cô lập vật lý hạt nano bên trong túi trong khi dược chất 5-FU tự do khuếch tán ra môi trường ngoài, giúp lấy mẫu định kỳ chính xác và thuận tiện trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Nguyễn Cao Hiền đã hoàn thành việc tổng hợp các dẫn xuất amine của $\beta$-cyclodextrin ($\text{CD-NH}_2$, TMACD, HMACD) bằng kỹ thuật chiếu xạ vi sóng nhanh với hiệu suất được cải thiện. Tác giả đã chế tạo thành công hai hệ chất mang nano: nanogel phức đa ion $\beta\text{-CD-x/alginate}$ và hệ nano vàng lai ghép $\text{AuNPs/}\beta\text{-CD-x}$ được đặc trưng hóa đầy đủ bằng các phương pháp phổ học và kính hiển vi điện tử. Hệ vật liệu chứng minh khả năng nạp thuốc 5-Fluorouracil, làm chậm tốc độ giải phóng dược chất theo pH môi trường và duy trì độc tính chọn lọc đối với tế bào ung thư in vitro, đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên và vật liệu dẫn truyền thuốc.