MỞ ĐẦU Ngày nay, chúng ta đƣợc sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh chóng. Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri thức y học và sự phát triển vƣợt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng. Điều này giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về cơ sở phân tử của bệnh. Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích.
Nền tảng về cơ sở học phân tử của bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngƣợc lại. Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen. Đáng chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát triển của phƣơng pháp lai ADN. Đây là một kỹ thuật kinh điển nhƣng vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến nhờ vào những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn và đặc biệt phù hợp với các nƣớc đang phát triển.
Ở nƣớc ta hiện nay kỹ thuật lai điểm đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chƣa đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN Dựa vào hình ảnh nhiễu xạ tia X (Franklin R., 1952) và thông tin bắt cặp các bazơ (Chargaff E., 1950), hai nhà khoa học Watson J. đã đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN (1953).
Trƣớc công bố này đã có một số nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của ADN. Đầu tiên phải kể đến công trình tách chiết ADN từ nhân tinh trùng cá hồi của Miescher F. Cùng thời điểm đó, Mendel G. phát hiện ra quy luật phân ly và tổ hợp của các "nhân tố di truyền" thông qua thí nghiệm lai ở cây đậu Hà Lan.
cung cấp bằng chứng cho thấy ADN mang thông tin di truyền trong thí nghiệm biến nạp ở vi khuẩn [1]. Đến nay, chúng ta đã biết rõ ADN là những phân tử axit nucleic đƣợc tìm thấy trong tế bào của phần lớn các loài sinh vật. Thông tin có mặt trong ADN "chỉ dẫn" tế bào tổng hợp các loại protein quyết định các đặc điểm sinh học và có khả năng di truyền cho thế hệ sau. "Chìa khóa" của tất cả các chức năng đó thể hiện trong cấu trúc của đại phân tử này.
ADN là những phân tử trùng phân (polymer) đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) deoxyribonucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần cơ bản: bazơ nitơ, đƣờng pentose và nhóm phosphate. Trong đó, bazơ nitơ là dẫn xuất của purine gồm adenine (A) và guanine (G), hoặc dẫn xuất của pirimidine gồm thymine (T), cytosine (C). Sự có mặt của nhóm phosphate làm cho các phân tử ADN thƣờng tích điện âm và có tính axit [41].
Bốn loại deoxyribonucleotide trong thành phần ADN khác nhau về loại bazơ nitơ (A, G, T, C), giống nhau về cấu trúc đƣờng pentose và nhóm phosphate. Vị trí các nguyên tử cacbon trên mạch vòng của đƣờng pentose đƣợc đánh số từ 1' đến 5'. Các nucleotide liên kết với nhau bởi cầu nối phosphodieste giữa nhóm hydroxyl ở vị trí 3' với nhóm phosphate ở vị trí 5' của hai phân tử đƣờng [41]. Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Hình 1: (A) Mô hình chuỗi xoắn kép, (B) liên kết hydro và phosphodieste trong phân tử ADN [77].
Trong phân tử ADN sợi đôi, hai mạch polynucleotide liên kết với nhau bởi liên kết hydro hình thành giữa các nucleotide đối diện trên hai mạch theo nguyên tắc bổ sung: giữa A và T có hai liên kết, giữa G và C có ba liên kết (Hình 1) [1]. Liên kết hydro là liên kết hóa học yếu xảy ra giữa nguyên tử hydro và nguyên tử tích điện âm nhiều hơn nhƣ oxy, nitơ và flo. Các nguyên tử tham gia có thể nằm trên cùng một phân tử hoặc trên các phân tử khác. Liên kết hydro có tính định hƣớng, trở nên mạnh nhất khi hai nguyên tử tham gia ở vị trí đối diện trực tiếp với nhau.
Nếu góc liên kết vƣợt quá 300 thì lực liên kết yếu đi nhiều [1]. Vì vậy, để có cấu trúc ADN sợi kép thì một mạch phải chạy theo chiều 5' → 3', còn mạch kia chạy theo chiều ngƣợc lại là 3' → 5'. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC Phân tử ADN sợi kép có thể tách thành hai mạch đơn dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính nhƣ kiềm, urê hoặc nhiệt độ cao [68]. Khi đó các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhƣng không ảnh hƣởng tới các liên kết phosphodieste của khung ADN.
Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện môi trƣờng thích hợp, hai mạch đơn có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính ADN) (Hình Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 2) [4]. Trong trƣờng hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tƣơng đồng, chúng có thể bắt cặp tạo nên phân tử lai. Hiện tƣợng tái bắt cặp nhƣ trên đƣợc gọi là quá trình lai phân tử [7]. Đến nay, nhiều kỹ thuật lai đã đƣợc phát triển nhằm phát hiện trình tự quan tâm nhờ tạo ra các phân tử axit nucleic có trình tự tƣơng đồng với nó.
Mức độ tƣơng đồng giữa hai trình tự thể hiện ở nhiệt độ cần thiết để gây biến tính 50% phân tử dạng sợi kép (nhiệt độ nóng chảy Tm - temperature melting) [71]. Giá trị Tm của mỗi phân tử ADN phụ thuộc vào thành phần, tỷ lệ, vị trí sắp xếp của các cặp nucleotide. Nếu có cùng số cặp bazơ, phân tử ADN có tỷ lệ GC càng cao thì Tm càng lớn và ngƣợc lại. Ngoài ra, phân tử ADN có số đoạn trình tự lặp lại càng nhiều thì nhiệt độ biến tính Tm càng giảm.
Nồng độ muối và sự có mặt của các chất gây biến tính nhƣ formamide cũng ảnh hƣởng đến giá trị Tm. Đối với hệ gen của động vật có vú (chứa khoảng 40% GC), ADN bị biến tính ở giá trị Tm xấp xỉ 870C trong điều kiện sinh lý [58]. Thông thƣờng, phản ứng tạo nên phân tử lai đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm 250C. Hình 2: Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép [41].
Hiê ̣n nay, kỹ thuật lai đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng để phát hiện sự có mặt , xác định vị trí hoặc định lƣợng đoạn axit nucleic quan tâm [13, 43]. Trình tự axit nucleic quan tâm đƣợc gọi là phân tử đích. Đoạn ADN hoặc ARN có độ tƣơng đồng cao với phân tử đích gọi là đầu dò. Đầu dò đƣợc đánh dấu Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học để phát hiện kết quả lai giữa đầu dò và phân tử đích.
Trong trƣờng hợp phân tử đích hoặc đầu dò ở dạng sợi kép, chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn trƣớc khi tiến hành phản ứng lai. Khi đó, ngoài sự bắt cặp giữa phân tử đích và đầu dò còn có sự tái bắt cặp của các phân tử sợi đôi cùng nguồn gốc (Hình 3). Các bƣớc cơ bản của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai. Nhƣ vậy, một trong các bƣớc đầu tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dò.
Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58]. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic Đầu dò là một phân tử axit nucleic có độ tƣơng đồng cao với trình tự đích (ADN hoă ̣c ARN) [5, 8]. Các ADN dùng làm đầu dò phổ biến có nguồn gốc từ ADNc (complementary DNA), ADN tƣơng đồng khác loài hoặc trình tự nucleotide suy diễn dựa vào trình tự axit amin đã biết [58, 65]. Thông thƣờng, trình tự ADN đƣợc nhân dòng trong tế bào chủ, từ đó sản xuất lƣợng lớn đầu dò [53, 65].
Đầu dò Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp nhƣ vậy gọi là đầu dò nhân dòng. Sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã hỗ trợ đắc lực cho viê ̣c sản xuất đầ u dò bởi có thể đồ ng thời khuế ch đaị và đánh dấ u nhờ sƣ̉ du ̣ng nucleotide đánh dấ u[31, 75]. Một phƣơng pháp khác để sản xuất đầu dò ADN là tổng hợp hóa học (đầu dò oligo) [7, 32]. Mặc dù phƣơng pháp này yêu cầu sự hiểu biết chi tiết về trình tự đích nhƣng đầu dò thu đƣợc ở dạng sợi đơn, không tự bắt cặp bổ sung nên chúng đƣợc sử dụng nhiều hơn đầu dò nhân dòng [11, 37].
Đầu dò oligo đƣợc thiết kế dựa vào các trình tự nằm trong gen hoặc những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của từng thí nghiệm và các thông tin đã có [51, 58].