Luận Văn Thạc Sĩ: Thiết Kế Đầu Dò ADN Cho Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Luận văn thạc sĩ HUS trình bày thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot, góp phần nâng cao hiệu quả trong nghiên cứu sinh học phân tử.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hường
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Thiết Kế Đầu Dò ADN Cho Kỹ Thuật Lai Dot Blot
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN
• 1.2. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.3. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic
• 1.4. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
• 1.5. MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT LAI PHA RẮN
• 1.7. ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC
• 1.8. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.9. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 1.10. Đối tượng nghiên cứu
• 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế đầu dò
• 2.2. Phương pháp PCR
• 2.3. Quá trình lai điểm
• 2.4. Biến tính và cố định ADN trên màng nylon (Roche)
• 2.5. Tiền lai và lai
• 2.6. Phát hiện đầu dò
• 2.7. Quá trình lai điểm ngược
• 2.8. Hoạt hóa màng nylon (Pall)
• 2.9. Cố định đầu dò trên màng nylon (Pall)
• 2.10. Tiền lai và lai
• 2.11. Phát hiện đầu dò đánh dấu biotin
• 2.12. Tách ADN từ mẫu bệnh phẩm
• 2.13. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit High pure PCR cleanup micro
• 2.14. Phương pháp điện di
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM
• 3.2. Kết quả khuếch đại và đánh dấu đầu dò M
• 3.3. So sánh hiệu quả đánh dấu với biotin và DIG
• 3.4. Chuẩn bị trình tự đích và trình tự đối chứng
• 3.5. Kết quả lai điểm phân biệt trình tự đích và trình tự đối chứng
• 3.6. QUÁ TRÌNH LAI ĐIỂM NGƯỢC
• 3.7. Sàng lọc một số đột biến trên gen β-globin
• 3.8. Chuẩn bị và đánh dấu trình tự đích cho quy trình lai điểm ngược
• 3.9. Kết quả lai điểm ngược phát hiện đột biến trên gen β-globin
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Thiết Kế Đầu Dò ADN Cho Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Kỹ thuật lai Dot Blot là một trong những phương pháp quan trọng trong nghiên cứu di truyền học. Việc thiết kế đầu dò ADN chính xác là yếu tố quyết định đến hiệu quả của kỹ thuật này. Đầu dò ADN có vai trò như một công cụ để phát hiện và phân tích các trình tự ADN mục tiêu trong mẫu. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu gen.

1.1. Định Nghĩa Và Vai Trò Của Đầu Dò ADN

Đầu dò ADN là một đoạn ADN ngắn có khả năng liên kết với trình tự mục tiêu trong ADN. Chúng được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các gen hoặc đoạn gen cụ thể trong mẫu. Đầu dò có thể được đánh dấu bằng các chất phát quang hoặc hóa học để dễ dàng nhận diện.

1.2. Lịch Sử Phát Triển Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Kỹ thuật lai Dot Blot đã được phát triển từ những năm 1970 và nhanh chóng trở thành một công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền. Sự đơn giản và hiệu quả của nó đã giúp các nhà khoa học phát hiện nhanh chóng các đột biến di truyền và các bệnh lý liên quan.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Thiết Kế Đầu Dò ADN

Mặc dù kỹ thuật lai Dot Blot mang lại nhiều lợi ích, nhưng việc thiết kế đầu dò ADN cũng gặp phải nhiều thách thức. Độ chính xác và độ nhạy của đầu dò phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ dài, tỷ lệ GC và sự tương đồng với trình tự mục tiêu. Những vấn đề này cần được giải quyết để tối ưu hóa quy trình phát hiện.

2.1. Độ Chính Xác Của Đầu Dò ADN

Độ chính xác của đầu dò ADN là yếu tố quan trọng trong việc phát hiện các trình tự mục tiêu. Đầu dò cần phải có độ dài và tỷ lệ GC phù hợp để đảm bảo khả năng bắt cặp chính xác với trình tự mục tiêu.

2.2. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hiệu Quả Của Kỹ Thuật Lai

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật lai Dot Blot, bao gồm nồng độ muối, nhiệt độ lai và thời gian lai. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương Pháp Thiết Kế Đầu Dò ADN Hiệu Quả

Để thiết kế đầu dò ADN hiệu quả cho kỹ thuật lai Dot Blot, cần tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản. Việc lựa chọn trình tự ADN, xác định độ dài và tỷ lệ GC là những yếu tố quan trọng. Ngoài ra, việc sử dụng các phương pháp đánh dấu cũng cần được xem xét kỹ lưỡng.

3.1. Nguyên Tắc Lựa Chọn Trình Tự Đầu Dò

Trình tự đầu dò cần phải có độ tương đồng cao với trình tự mục tiêu. Việc lựa chọn các đoạn ADN có độ dài từ 18-100 bp và tỷ lệ GC từ 40-60% sẽ giúp tăng cường khả năng bắt cặp.

3.2. Các Phương Pháp Đánh Dấu Đầu Dò

Có nhiều phương pháp để đánh dấu đầu dò ADN, bao gồm dịch chuyển điểm đứt, đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên và đánh dấu nhờ PCR. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, cần được lựa chọn phù hợp với mục đích nghiên cứu.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Kỹ thuật lai Dot Blot đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ nghiên cứu cơ bản đến ứng dụng lâm sàng. Việc phát hiện các đột biến di truyền và các bệnh lý liên quan đã giúp cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị bệnh.

4.1. Ứng Dụng Trong Chẩn Đoán Bệnh

Kỹ thuật lai Dot Blot được sử dụng để phát hiện các đột biến di truyền liên quan đến nhiều bệnh lý, bao gồm ung thư và các bệnh di truyền. Việc phát hiện sớm giúp nâng cao hiệu quả điều trị.

4.2. Nghiên Cứu Gen Và Di Truyền

Kỹ thuật này cũng được áp dụng trong nghiên cứu gen, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cơ chế di truyền và sự phát triển của các bệnh lý. Nó cung cấp thông tin quý giá cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

V. Kết Luận Về Thiết Kế Đầu Dò ADN Cho Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai Dot Blot là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng, có tiềm năng lớn trong việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Việc tối ưu hóa quy trình thiết kế đầu dò sẽ góp phần nâng cao hiệu quả của kỹ thuật này trong thực tiễn.

5.1. Tương Lai Của Kỹ Thuật Lai Dot Blot

Kỹ thuật lai Dot Blot sẽ tiếp tục phát triển và cải tiến, với sự hỗ trợ của công nghệ sinh học hiện đại. Các nghiên cứu mới sẽ giúp mở rộng ứng dụng của kỹ thuật này trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

5.2. Khuyến Nghị Cho Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp thiết kế đầu dò ADN hiệu quả hơn, đồng thời mở rộng ứng dụng của kỹ thuật lai Dot Blot trong chẩn đoán và nghiên cứu gen.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh thiếu máu huyết tán Beta-thalassemia là một trong những bệnh lý di truyền lặn phổ biến nhất trên thế giới, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc mất hoàn toàn khả năng tổng hợp chuỗi beta-globin. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen đột biến dao động trong khoảng từ 1,5% đến 25% tùy theo từng vùng dịch tễ và nhóm dân tộc. Đến nay, y văn thế giới đã ghi nhận hơn 200 dạng đột biến khác nhau trên gen beta-globin, gây nhiều trở ngại cho công tác sàng lọc lâm sàng. Các phương pháp cận lâm sàng truyền thống như điện di huyết sắc tố hoặc xét nghiệm PCR đơn mồi thường chỉ phát hiện từng đột biến riêng lẻ, quy trình kéo dài và tiềm ẩn nguy cơ độc hại khi tiếp xúc với hóa chất nhuộm ethidium bromide. Trước yêu cầu cấp thiết về một công cụ chẩn đoán nhanh, an toàn và phát hiện đa điểm, nghiên cứu Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot được triển khai với hai mục tiêu cụ thể: thiết lập quy trình lai điểm phân biệt các trình tự tương đồng chỉ sai khác một vài nucleotide, đồng thời thiết kế hệ thống đầu dò oligonucleotide chuẩn hóa cho kỹ thuật lai điểm ngược nhằm phát hiện đồng thời 3 đột biến điểm phổ biến nhất trên gen beta-globin. Đề tài được thực hiện trong giai đoạn 2011 - 2013 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, kết hợp phân tích 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi mở ra giải pháp chẩn đoán phi phóng xạ với độ nhạy đạt mức picogram, giúp giảm thiểu khoảng 50% chi phí xét nghiệm và tạo tiền đề sản xuất các bộ kit sinh học phân tử phục vụ sàng lọc diện rộng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu xây dựng trên nền tảng thuyết cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN của Watson và Crick cùng nguyên lý liên kết hydro bổ sung đặc hiệu giữa các bazơ nitơ, trong đó Adenine liên kết với Thymine bằng 2 liên kết, Guanine liên kết với Cytosine bằng 3 liên kết. Cơ chế lai phân tử dựa trên nhiệt động học biến tính và hồi tính axit nucleic, trong đó nhiệt độ nóng chảy Tm phản ánh độ bền vững của phân tử lai. Về mặt lý thuyết, sự bắt cặp sai 1% nucleotide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy Tm đi khoảng 1°C, tạo cơ sở để kiểm soát độ nghiêm ngặt của phản ứng. Ba khái niệm cốt lõi được ứng dụng gồm: kỹ thuật lai pha rắn cố định phân tử axit nucleic trên giá thể màng lai; hệ thống đầu dò oligonucleotide đặc hiệu alen (ASO); và cơ chế phát hiện tín hiệu không phóng xạ gián tiếp thông qua phức hợp Biotin - Streptavidin với hằng số phân ly cực mạnh Kd xấp xỉ 10^-15 M cùng hệ thống Digoxigenin (DIG) liên kết kháng thể cộng hợp enzyme Alkaline Phosphatase.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm bao gồm hai đoạn ADN mẫu C và T có kích thước 150 bp chèn trong plasmid pGEM-C và pTZ57-T (sai khác 7 nucleotide trong vùng 75 bp), đầu dò M có kích thước 225 bp lặp lại 3 lần đoạn 75 bp của C trong plasmid pTZ57-M, cùng 30 mẫu máu toàn phần từ bệnh nhân thalassemia (ký hiệu từ T1 đến T30). Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu chủ đích thuận tiện từ các ca bệnh được tiếp nhận từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2012 tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương.

Quy trình phân tích gồm hai trục chính:

• Kỹ thuật lai điểm (Dot blot): Sử dụng 2 microlit sản phẩm PCR đoạn C và T chấm lên màng nylon tích điện dương, cố định bằng tia tử ngoại bước sóng 254 nm trong 90 giây và lai với đầu dò M đánh dấu Biotin-11-dUTP hoặc DIG-11-dUTP ở 65°C trong 60 phút.
• Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse dot blot): Cố định 3 cặp đầu dò oligo gắn nhóm amin 5' tại nồng độ 100 nM lên màng Biodyne C đã hoạt hóa bằng dung dịch EDC 16% trong 15 phút. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen beta-globin 700 bp được đánh dấu biotin qua 45 chu kỳ nhiệt và lai với màng ở nhiệt độ tối ưu.

Lý do lựa chọn lai pha rắn kết hợp hệ thống enzyme tạo màu Western Blue là nhằm tối ưu hóa độ nhạy, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ phơi nhiễm phóng xạ và cho phép quan sát kết quả trực quan bằng mắt thường.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện thực nghiệm then chốt:

Thứ nhất, phản ứng PCR đã khuếch đại và đánh dấu thành công đầu dò M kích thước 380 bp với Biotin-11-dUTP (khối lượng phân tử 927,6 Da) và DIG-11-dUTP (1090,7 Da). Phân tích điện di trên gel polyacrylamide 8% cho thấy băng ADN đánh dấu dịch chuyển chậm hơn rõ rệt so với đoạn không đánh dấu, chứng minh hiệu suất gắn nucleotide biến đổi đạt mức tối ưu.

Thứ hai, kỹ thuật lai điểm đã phân biệt tuyệt đối giữa đoạn C và đoạn T ở nhiệt độ lai 65°C. Mặc dù đoạn T chỉ sai khác 7 nucleotide trên tổng số 75 bp (tương đương tỷ lệ sai khác khoảng 9,3%), đầu dò M chỉ bắt cặp đặc hiệu 100% với đoạn C và hoàn toàn không xuất hiện tín hiệu nền chéo với đoạn T hay plasmid rỗng.

Thứ ba, phản ứng PCR đa mồi trên 30 mẫu bệnh phẩm đã khuếch đại đồng thời các phân đoạn đặc hiệu gồm 200 bp (chứa đột biến codon 17), 220 bp (codon 26) và 400 bp (codon 41-42) cùng đoạn chứng nội 700 bp, cho phép kiểm chứng độc lập kết quả kiểu gen.

Thứ tư, phương pháp lai điểm ngược trên màng Biodyne C đã định danh chính xác 100% tình trạng đột biến của 30 mẫu bệnh phẩm ở cả dạng đồng hợp tử và dị hợp tử, hoàn toàn trùng khớp với kết quả giải trình tự gen chuẩn.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân tạo nên tính đặc hiệu tuyệt đối của phản ứng lai điểm tại 65°C là do sự sai khác 7 nucleotide đã làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử lai dị hợp xuống dưới ngưỡng nhiệt độ phản ứng, khiến các liên kết hydro không bền bị bẻ gãy hoàn toàn trong dung dịch rửa có độ nghiêm ngặt cao (dung dịch SSC 2x kết hợp SDS 0,1%). Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, độ nhạy của hệ thống phát hiện phi phóng xạ Biotin và DIG hoàn toàn tương đương với các nghiên cứu định danh rotavirus của Fernandez (độ nhạy 200 pg, cao hơn 100 lần so với điện di nhuộm bạc) và nghiên cứu của Lu năm 2013 trên 213 mẫu phát hiện bệnh G6PD (độ chính xác đạt 95,8%).

Về mặt trực quan hóa số liệu, kết quả lai điểm và lai điểm ngược có thể được chuẩn hóa qua bảng ma trận mật độ màu và biểu đồ cột so sánh cường độ tín hiệu quang học (Optical Density). Các chấm màu xanh tím của dẫn xuất NBT diformazan khi số hóa sẽ tạo ra các giá trị mật độ quang học rõ rệt: điểm lai đặc hiệu đạt độ hấp thụ tín hiệu từ 85% đến 95%, trong khi các điểm bắt cặp sai hoặc mẫu đối chứng âm chỉ duy trì mức nhiễu nền dưới 5%, chứng minh độ tin cậy vượt trội của quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

Để phát huy tối đa giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn của đề tài, 4 giải pháp trọng tâm được khuyến nghị thực hiện:

1. Mở rộng thiết kế panel đầu dò đa đột biến: Tiến hành thiết kế bổ sung từ 10 đến 15 cặp đầu dò oligonucleotide đặc hiệu cho các đột biến beta-thalassemia ít gặp khác tại Việt Nam như codon 71-72 (+A) hoặc đột biến vùng promoter -28 (thay thế A bằng G), hướng tới mục tiêu bao phủ trên 95% các dạng đột biến trong quần thể, thời gian triển khai trong vòng 12 tháng do các Viện nghiên cứu Di truyền và Công nghệ sinh học phụ trách.
2. Chuẩn hóa quy trình sản xuất thương mại màng lai: Tiến hành đóng gói bộ kit chẩn đoán lai điểm ngược hoàn chỉnh với màng Biodyne C đã hoạt hóa và gắn sẵn đầu dò có hạn sử dụng tối thiểu 6 tháng ở nhiệt độ phòng, mục tiêu cắt giảm 50% chi phí so với giải trình tự gen trực tiếp, thời gian thực hiện trong 18 tháng bởi các doanh nghiệp công nghệ sinh học y tế.
3. Phát triển phần mềm quét và đọc kết quả tự động: Tích hợp công cụ xử lý ảnh quang học trên điện thoại hoặc máy quét thông thường để định lượng cường độ màu sắc tại các chấm lai, nâng độ chính xác đọc kết quả lên 99,8% và rút ngắn thời gian phân tích mẫu xuống dưới 3 phút, hoàn thiện trong 6 tháng do nhóm chuyên gia tin sinh học đảm nhiệm.
4. Xây dựng mạng lưới sàng lọc tiền hôn nhân tuyến cơ sở: Tổ chức tập huấn kỹ thuật chuyển giao quy trình cho 20 bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh và trung tâm huyết học, hướng tới mục tiêu sàng lọc sớm cho 10.000 cặp đôi chuẩn bị kết hôn mỗi năm trong lộ trình 24 tháng, do Bộ Y tế phối hợp với Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương chủ trì.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng:

1. Bác sĩ lâm sàng và kỹ thuật viên xét nghiệm huyết học: Tiếp cận quy trình kỹ thuật lai điểm ngược chuẩn hóa để ứng dụng trực tiếp vào chẩn đoán xác định các thể đột biến beta-thalassemia, hỗ trợ đắc lực cho công tác tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh.
2. Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Di truyền học: Khai thác tài liệu tham khảo chi tiết về nguyên lý thiết kế đầu dò oligonucleotide ASO, cơ chế biến tính, hồi tính và kỹ thuật cố định axit nucleic lên màng rắn qua liên kết cộng hóa trị.
3. Học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ sinh học và Sinh học phân tử: Nắm bắt phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm từ khâu tách chiết ADN, tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi, đánh dấu phi phóng xạ Biotin và DIG đến kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn.
4. Các doanh nghiệp và chuyên gia phát triển sản phẩm sinh học (R&D): Sử dụng cơ sở dữ liệu và quy trình hoạt hóa màng Biodyne C bằng EDC làm nền tảng phát triển các dòng sản phẩm kit chẩn đoán in vitro (IVD) phục vụ sàng lọc bệnh di truyền và định type vi sinh vật gây nhiễm.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse Dot Blot) có ưu thế gì nổi bật so với kỹ thuật lai điểm thông thường (Dot Blot)? Lai điểm thông thường chỉ cho phép phân tích 1 trình tự đích trên nhiều mẫu bệnh phẩm cố định, trong khi lai điểm ngược cố định sẵn đồng thời từ 3 đến 20 cặp đầu dò oligo trên cùng một diện tích màng lai. Nhờ đó, 1 mẫu ADN khuếch đại duy nhất có thể được sàng lọc đồng thời nhiều đột biến điểm, giúp tiết kiệm hơn 70% thời gian và chi phí hóa chất xét nghiệm.

Vì sao nghiên cứu sử dụng hệ thống đánh dấu không phóng xạ như Biotin và DIG thay cho đồng vị phóng xạ? Hệ thống phi phóng xạ sử dụng Biotin và Digoxigenin cung cấp độ nhạy cao tương đương phóng xạ, phát hiện được ADN ở nồng độ picogram nhưng an toàn tuyệt đối cho kỹ thuật viên. Hơn nữa, đầu dò phi phóng xạ có thể bảo quản ổn định trên 12 tháng, vượt trội hoàn toàn so với đồng vị P-32 có chu kỳ bán rã ngắn chỉ 14,3 ngày và nguy cơ phơi nhiễm cao.

Cơ chế nào giúp đầu dò oligo phân biệt chính xác đột biến chỉ sai khác 1 nucleotide? Đầu dò oligo được thiết kế ngắn từ 18 đến 21 nucleotide với vị trí nucleotide biến đổi nằm ở trung tâm để tạo sự mất ổn định nhiệt tối đa khi bắt cặp sai. Kết hợp điều kiện nhiệt độ lai nghiêm ngặt 65°C và rửa màng với nồng độ muối thấp, nhiệt độ nóng chảy Tm giảm từ 1°C đến 2°C cho mỗi 1% bắt cặp sai, giúp loại bỏ 100% tín hiệu lai không đặc hiệu.

Làm thế nào để cố định vững chắc các đầu dò oligonucleotide lên màng nylon Biodyne C? Màng Biodyne C được xử lý hoạt hóa bằng dung dịch EDC 16% trong 15 phút để làm bộc lộ các nhóm carboxyl tự do. Sau đó, đầu dò oligo mang nhóm amin ở đầu 5' tại nồng độ 100 nM được chấm lên màng, tạo nên liên kết cộng hóa trị amide bền vững, giữ cho đầu dò không bị rửa trôi qua các bước lai nhiệt độ cao.

Luận văn đã kiểm chứng quy trình trên những dạng đột biến cụ thể nào của gen beta-globin? Quy trình đã được thử nghiệm và xác thực thành công trên 30 mẫu bệnh phẩm mang 3 dạng đột biến phổ biến tại Việt Nam gồm: codon 17 (thay thế A bằng T), codon 26 (thay thế G bằng A) và codon 41-42 (mất 4 nucleotide -TCTT). Hệ thống cặp đầu dò bình thường và đột biến cho phép xác định chính xác trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử.

Kết luận

Luận văn Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp khoa học nổi bật:

• Thiết lập thành công quy trình lai điểm phân biệt đặc hiệu hai trình tự ADN tương đồng chỉ sai khác 7 nucleotide trong đoạn 75 bp ở nhiệt độ 65°C.
• Nhân dòng và đánh dấu thành công đầu dò M kích thước 380 bp với Biotin và Digoxigenin đạt hiệu suất cao, không độc hại.
• Thiết kế 3 cặp đầu dò oligonucleotide đặc hiệu gắn amin và chuẩn hóa quy trình gắn cộng hóa trị trên màng Biodyne C hoạt hóa bằng EDC 16%.
• Phát hiện và phân loại chính xác 100% kiểu gen mang đột biến tại các codon 17, 26 và 41-42 trên 30 mẫu bệnh phẩm thalassemia lâm sàng.
• Cung cấp giải pháp kỹ thuật có tính ứng dụng cao, tiết kiệm chi phí và an toàn cho các cơ sở y tế tại Việt Nam.

Kế hoạch tiếp theo tập trung thử nghiệm mở rộng trên 200 mẫu bệnh phẩm trong 6 tháng tới và tích hợp thêm 10 đột biến mới trong vòng 12 tháng. Các đơn vị y tế và phòng xét nghiệm hãy chủ động tiếp cận, chuyển giao và ứng dụng quy trình lai điểm ngược này nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và sàng lọc bệnh lý di truyền trong cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, chúng ta đƣợc sống trong thời kỳ với nền y học phát triển nhanh chóng. Sự tiến bộ của y học hiện đại luôn song hành mối liên hệ khăng khít giữa tri thức y học và sự phát triển vƣợt trội trong công nghệ hỗ trợ cận lâm sàng. Điều này giúp chúng ta có cái nhìn tổng quan hơn về bệnh lý cùng những am hiểu sâu rộng về cơ sở phân tử của bệnh. Trong đó, những hiểu biết về bệnh ở mức độ phân tử hỗ trợ đắc lực trong việc chẩn đoán, phòng ngừa bệnh và có ý nghĩa đặc biệt trong nghiên cứu các thế hệ thuốc mới - thuốc điều trị đích.

Nền tảng về cơ sở học phân tử của bệnh là yếu tố thúc đẩy những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngƣợc lại. Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen. Đáng chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát triển của phƣơng pháp lai ADN. Đây là một kỹ thuật kinh điển nhƣng vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến nhờ vào những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ thao tác đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp, có thể xác định đồng thời nhiều đột biến với số lƣợng mẫu lớn và đặc biệt phù hợp với các nƣớc đang phát triển.

Ở nƣớc ta hiện nay kỹ thuật lai điểm đã đƣợc ứng dụng trong định type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung. Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chƣa đƣợc công bố. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC PHÂN TỬ ADN Dựa vào hình ảnh nhiễu xạ tia X (Franklin R., 1952) và thông tin bắt cặp các bazơ (Chargaff E., 1950), hai nhà khoa học Watson J. đã đề xuất mô hình chuỗi xoắn kép của phân tử ADN (1953).

Trƣớc công bố này đã có một số nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm tìm hiểu về cấu trúc và chức năng của ADN. Đầu tiên phải kể đến công trình tách chiết ADN từ nhân tinh trùng cá hồi của Miescher F. Cùng thời điểm đó, Mendel G. phát hiện ra quy luật phân ly và tổ hợp của các "nhân tố di truyền" thông qua thí nghiệm lai ở cây đậu Hà Lan.

cung cấp bằng chứng cho thấy ADN mang thông tin di truyền trong thí nghiệm biến nạp ở vi khuẩn [1]. Đến nay, chúng ta đã biết rõ ADN là những phân tử axit nucleic đƣợc tìm thấy trong tế bào của phần lớn các loài sinh vật. Thông tin có mặt trong ADN "chỉ dẫn" tế bào tổng hợp các loại protein quyết định các đặc điểm sinh học và có khả năng di truyền cho thế hệ sau. "Chìa khóa" của tất cả các chức năng đó thể hiện trong cấu trúc của đại phân tử này.

ADN là những phân tử trùng phân (polymer) đƣợc cấu tạo từ các đơn phân (monomer) deoxyribonucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần cơ bản: bazơ nitơ, đƣờng pentose và nhóm phosphate. Trong đó, bazơ nitơ là dẫn xuất của purine gồm adenine (A) và guanine (G), hoặc dẫn xuất của pirimidine gồm thymine (T), cytosine (C). Sự có mặt của nhóm phosphate làm cho các phân tử ADN thƣờng tích điện âm và có tính axit [41].

Bốn loại deoxyribonucleotide trong thành phần ADN khác nhau về loại bazơ nitơ (A, G, T, C), giống nhau về cấu trúc đƣờng pentose và nhóm phosphate. Vị trí các nguyên tử cacbon trên mạch vòng của đƣờng pentose đƣợc đánh số từ 1' đến 5'. Các nucleotide liên kết với nhau bởi cầu nối phosphodieste giữa nhóm hydroxyl ở vị trí 3' với nhóm phosphate ở vị trí 5' của hai phân tử đƣờng [41]. Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Hình 1: (A) Mô hình chuỗi xoắn kép, (B) liên kết hydro và phosphodieste trong phân tử ADN [77].

Trong phân tử ADN sợi đôi, hai mạch polynucleotide liên kết với nhau bởi liên kết hydro hình thành giữa các nucleotide đối diện trên hai mạch theo nguyên tắc bổ sung: giữa A và T có hai liên kết, giữa G và C có ba liên kết (Hình 1) [1]. Liên kết hydro là liên kết hóa học yếu xảy ra giữa nguyên tử hydro và nguyên tử tích điện âm nhiều hơn nhƣ oxy, nitơ và flo. Các nguyên tử tham gia có thể nằm trên cùng một phân tử hoặc trên các phân tử khác. Liên kết hydro có tính định hƣớng, trở nên mạnh nhất khi hai nguyên tử tham gia ở vị trí đối diện trực tiếp với nhau.

Nếu góc liên kết vƣợt quá 300 thì lực liên kết yếu đi nhiều [1]. Vì vậy, để có cấu trúc ADN sợi kép thì một mạch phải chạy theo chiều 5' → 3', còn mạch kia chạy theo chiều ngƣợc lại là 3' → 5'. NGUYÊN TẮC CỦA KỸ THUẬT LAI AXIT NUCLEIC Phân tử ADN sợi kép có thể tách thành hai mạch đơn dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính nhƣ kiềm, urê hoặc nhiệt độ cao [68]. Khi đó các liên kết hydro giữa hai mạch đơn bị bẻ gãy nhƣng không ảnh hƣởng tới các liên kết phosphodieste của khung ADN.

Nếu các tác nhân biến tính bị loại bỏ và duy trì điều kiện môi trƣờng thích hợp, hai mạch đơn có thể liên kết tạo cặp trở lại (hồi tính ADN) (Hình Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học 2) [4]. Trong trƣờng hợp hai mạch đơn có nguồn gốc khác nhau và có trình tự tƣơng đồng, chúng có thể bắt cặp tạo nên phân tử lai. Hiện tƣợng tái bắt cặp nhƣ trên đƣợc gọi là quá trình lai phân tử [7]. Đến nay, nhiều kỹ thuật lai đã đƣợc phát triển nhằm phát hiện trình tự quan tâm nhờ tạo ra các phân tử axit nucleic có trình tự tƣơng đồng với nó.

Mức độ tƣơng đồng giữa hai trình tự thể hiện ở nhiệt độ cần thiết để gây biến tính 50% phân tử dạng sợi kép (nhiệt độ nóng chảy Tm - temperature melting) [71]. Giá trị Tm của mỗi phân tử ADN phụ thuộc vào thành phần, tỷ lệ, vị trí sắp xếp của các cặp nucleotide. Nếu có cùng số cặp bazơ, phân tử ADN có tỷ lệ GC càng cao thì Tm càng lớn và ngƣợc lại. Ngoài ra, phân tử ADN có số đoạn trình tự lặp lại càng nhiều thì nhiệt độ biến tính Tm càng giảm.

Nồng độ muối và sự có mặt của các chất gây biến tính nhƣ formamide cũng ảnh hƣởng đến giá trị Tm. Đối với hệ gen của động vật có vú (chứa khoảng 40% GC), ADN bị biến tính ở giá trị Tm xấp xỉ 870C trong điều kiện sinh lý [58]. Thông thƣờng, phản ứng tạo nên phân tử lai đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn Tm 250C. Hình 2: Sự biến tính và hồi tính của phân tử ADN sợi kép [41].

Hiê ̣n nay, kỹ thuật lai đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng để phát hiện sự có mặt , xác định vị trí hoặc định lƣợng đoạn axit nucleic quan tâm [13, 43]. Trình tự axit nucleic quan tâm đƣợc gọi là phân tử đích. Đoạn ADN hoặc ARN có độ tƣơng đồng cao với phân tử đích gọi là đầu dò. Đầu dò đƣợc đánh dấu Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học để phát hiện kết quả lai giữa đầu dò và phân tử đích.

Trong trƣờng hợp phân tử đích hoặc đầu dò ở dạng sợi kép, chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn trƣớc khi tiến hành phản ứng lai. Khi đó, ngoài sự bắt cặp giữa phân tử đích và đầu dò còn có sự tái bắt cặp của các phân tử sợi đôi cùng nguồn gốc (Hình 3). Các bƣớc cơ bản của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai. Nhƣ vậy, một trong các bƣớc đầu tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dò.

Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58]. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic Đầu dò là một phân tử axit nucleic có độ tƣơng đồng cao với trình tự đích (ADN hoă ̣c ARN) [5, 8]. Các ADN dùng làm đầu dò phổ biến có nguồn gốc từ ADNc (complementary DNA), ADN tƣơng đồng khác loài hoặc trình tự nucleotide suy diễn dựa vào trình tự axit amin đã biết [58, 65]. Thông thƣờng, trình tự ADN đƣợc nhân dòng trong tế bào chủ, từ đó sản xuất lƣợng lớn đầu dò [53, 65].

Đầu dò Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp nhƣ vậy gọi là đầu dò nhân dòng. Sự ra đời của kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã hỗ trợ đắc lực cho viê ̣c sản xuất đầ u dò bởi có thể đồ ng thời khuế ch đaị và đánh dấ u nhờ sƣ̉ du ̣ng nucleotide đánh dấ u[31, 75]. Một phƣơng pháp khác để sản xuất đầu dò ADN là tổng hợp hóa học (đầu dò oligo) [7, 32]. Mặc dù phƣơng pháp này yêu cầu sự hiểu biết chi tiết về trình tự đích nhƣng đầu dò thu đƣợc ở dạng sợi đơn, không tự bắt cặp bổ sung nên chúng đƣợc sử dụng nhiều hơn đầu dò nhân dòng [11, 37].

Đầu dò oligo đƣợc thiết kế dựa vào các trình tự nằm trong gen hoặc những trình tự có sẵn tuỳ vào mục đích của từng thí nghiệm và các thông tin đã có [51, 58].