Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan hemophilia A Hemophilia, hay bệnh ưa chảy máu, là bệnh rối loạn đông máu di truyền biểu hiện lâm sàng chủ yếu là máu chảy khó cầm ở các vết thương như đứt tay, nhổ răng và các khối máu tụ ở khớp, cơ thường xuất hiện nhiều lần ở một khớp (hình 1). Người mắc bệnh này phải truyền máu thường xuyên, sống nhờ máu người khác với dung tích lớn, không được hoạt động mạnh.
Cơ chế di truyền của bệnh liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên NST X, không có allele tương ứng trên NST Y, gây thiếu hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu. Bệnh gồm 3 thể: hemophilia A (80-85%) thiếu yếu tố VIII, hemophilia B (15-20%) thiếu yếu tố IX, hemophilia C (chủ yếu ở người Do Thái với tỷ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ) thiếu yếu tố XI [34]. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp [15, 83] Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới, cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc các nước châu Á [49, 74]. Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử.
Người 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A. Triệu chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy máu là đặc trưng của bệnh. Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng. Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm.
Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn chuyển động của các khớp. Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn thương nhỏ. Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy máu đến chết sau chấn thương. Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm dưới 30%.
Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ. Ở thể nặng, hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong tháng. Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ. Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5].
Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86] Nồng độ % yếu tố Thể bệnh Biểu hiện chảy máu VIII (đơn vị/ml) Nặng Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn 1% (<0,01) (chiếm 70%) thương, thường chảy máu ở khớp và cơ. Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn Trung bình 1–5% thương nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn (chiếm 15%) (0,01 – 0,05) thương, phẫu thuật. Nhẹ 5 – 40% Chảy máu sau chấn thương lớn/phẫu thuật.
(chiếm 15%) (0,04 – 0,4) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành thể nhẹ của bệnh. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động của FVIII [48]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp dụng [33]. Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình mang gen bệnh.
Cơ sở phân tử của bệnh Gen F8 nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X (chrX: 154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser, GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm 26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD. Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII gây nên bệnh hemophilia A [18]. Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố. Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25].
Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%. Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%. Chiếm tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotide với tỷ lệ 9,8%. Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1].
Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1]. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1] Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia [65]. Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50% bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16, 53]. Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41].
Hiện tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp. Đảo đoạn intron 1 xảy ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí 140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41]. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25] Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70]. Dạng đột biến này là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77].
Đột biến chèn đoạn lớn làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68]. Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức năng. Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố. Nhiều đột 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân, ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị trí 2147 tạo thành stop codon) [39].
Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide. Phổ biến nhất là mất hoặc chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25] Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân. Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân.
Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ [25]. Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự nhau. Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh [19]. Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với “kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59].
Không phải tất cả 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Kim Ngân – K26 CH những bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên chảy máu tự phát, thậm chí trong số những người bị chảy máu, mức độ nặng của bệnh cũng khác biệt đáng kể. Cơ sở cho sự khác biệt này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn [36, 71]. Gần đây đã có báo cáo chứng minh được tần số một số loại đột biến là khác nhau ở hai giới: tỷ lệ đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần ở tế bào mầm sinh dục nữ.