Luận văn thạc sĩ: Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi

Luận văn thạc sĩ HUS thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Kim Ngân
• Người hướng dẫn: TS. Đặng Tiến Trường
• Trường học: Trường đại học khoa học tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan hemophilia A
• 1.2. Cơ sở phân tử của bệnh
• 1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A
• 1.4. Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A
• 1.5. Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi
• 1.6. Phân tích di truyền liên kết
• 1.7. Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết
• 1.8. Chỉ thị phân tử STR
• 1.9. Các chỉ số đa hình di truyền
• 1.10. Kỹ thuật PCR đa mồi
• 1.11. Kỹ thuật điện di mao quản
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen
• 2.5. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Các kỹ thuật được sử dụng
• 2.6. Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình
• 2.7. Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi
• 2.8. Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh
• 2.9. Các chỉ tiêu nghiên cứu
• 2.10. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.11. Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A tại Việt Nam
• 3.2. Các STR nằm cách gen F8 1Mb
• 3.3. Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR
• 3.4. Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR
• 3.5. Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi
• 3.6. Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A
• 3.7. Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân
• 3.8. Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về thiết kế bộ chỉ thị STR cho hemophilia A

Thiết kế bộ chỉ thị STR (Short Tandem Repeat) cho chẩn đoán hemophilia A là một bước quan trọng trong việc phát hiện và quản lý bệnh. Hemophilia A là một bệnh di truyền liên kết với nhiễm sắc thể X, gây ra bởi đột biến gen F8, dẫn đến thiếu hụt yếu tố đông máu VIII. Việc sử dụng bộ chỉ thị STR giúp xác định các cá thể mang gen bệnh, từ đó có thể thực hiện các biện pháp can thiệp kịp thời. Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán mà còn giảm thiểu rủi ro cho các thế hệ sau.

1.1. Chẩn đoán hemophilia A và vai trò của bộ chỉ thị STR

Chẩn đoán hemophilia A thường dựa vào các xét nghiệm di truyền để xác định sự hiện diện của đột biến gen F8. Bộ chỉ thị STR được thiết kế nhằm tăng cường độ chính xác trong việc phát hiện các cá thể mang gen bệnh. STR là những đoạn DNA lặp lại ngắn, có tính đa hình cao, giúp phân biệt giữa các cá thể khác nhau. Việc sử dụng STR trong chẩn đoán giúp kiểm soát hiện tượng Allele DropOut (ADO) và giảm thiểu sai sót trong chẩn đoán.

1.2. Tại sao cần thiết kế bộ chỉ thị STR cho người Việt Nam

Việt Nam có đặc điểm di truyền riêng biệt, do đó việc thiết kế bộ chỉ thị STR phù hợp với quần thể người Việt là rất cần thiết. Các nghiên cứu trước đây cho thấy tính đa hình của các STR phục vụ PGT (Preimplantation Genetic Testing) chưa được đánh giá đầy đủ trên quần thể người Việt. Việc thiết kế bộ chỉ thị STR không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phôi không mang gen bệnh trong quá trình chuyển phôi.

II. Vấn đề và thách thức trong chẩn đoán hemophilia A

Chẩn đoán hemophilia A gặp nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc phát hiện các đột biến gen F8. Các yếu tố như hiện tượng ADO và ngoại nhiễm có thể dẫn đến chẩn đoán sai. Hơn nữa, việc áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán hiện tại còn hạn chế về độ chính xác và độ nhạy. Do đó, việc phát triển các phương pháp mới, như sử dụng bộ chỉ thị STR, là cần thiết để cải thiện kết quả chẩn đoán.

2.1. Hiện tượng Allele DropOut ADO trong chẩn đoán

ADO là hiện tượng mất một hoặc cả hai allele trong quá trình khuếch đại DNA, dẫn đến chẩn đoán sai. Theo nghiên cứu, ADO xảy ra ở khoảng 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi. Điều này đặt ra thách thức lớn trong việc xác định chính xác các cá thể mang gen bệnh, đặc biệt là trong các trường hợp phức tạp như hemophilia A.

2.2. Tác động của ngoại nhiễm đến kết quả chẩn đoán

Ngoại nhiễm là một trong những nguyên nhân phổ biến gây ra sai sót trong chẩn đoán di truyền. Các yếu tố môi trường và kỹ thuật có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của các xét nghiệm. Việc sử dụng bộ chỉ thị STR có thể giúp giảm thiểu tác động của ngoại nhiễm, từ đó nâng cao độ tin cậy của kết quả chẩn đoán.

III. Phương pháp thiết kế bộ chỉ thị STR cho hemophilia A

Phương pháp thiết kế bộ chỉ thị STR bao gồm nhiều bước quan trọng, từ việc xác định các STR có tính đa hình cao đến việc tối ưu hóa quy trình PCR. Các STR được lựa chọn phải nằm gần gen F8 để đảm bảo tính liên kết và độ chính xác trong chẩn đoán. Quy trình này không chỉ giúp phát hiện các cá thể mang gen bệnh mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phôi không mang gen bệnh trong quá trình chuyển phôi.

3.1. Lựa chọn các STR có tính đa hình cao

Việc lựa chọn các STR có tính đa hình cao là rất quan trọng trong thiết kế bộ chỉ thị. Tính đa hình của STR được đánh giá thông qua tỷ lệ dị hợp tử quan sát. Các STR có tỷ lệ dị hợp tử cao sẽ cung cấp thông tin chính xác hơn về sự hiện diện của gen bệnh, từ đó nâng cao hiệu quả chẩn đoán.

3.2. Tối ưu hóa quy trình PCR cho bộ chỉ thị STR

Quy trình PCR cần được tối ưu hóa để đảm bảo khuếch đại hiệu quả các STR. Các yếu tố như nồng độ mồi, nhiệt độ phản ứng và thời gian khuếch đại cần được điều chỉnh để đạt được kết quả tốt nhất. Việc tối ưu hóa quy trình không chỉ giúp tăng cường độ nhạy mà còn giảm thiểu sai sót trong quá trình chẩn đoán.

IV. Ứng dụng thực tiễn của bộ chỉ thị STR trong chẩn đoán hemophilia A

Bộ chỉ thị STR được thiết kế không chỉ có giá trị trong việc chẩn đoán hemophilia A mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phôi trong quá trình chuyển phôi. Việc áp dụng bộ chỉ thị này giúp các gia đình mang gen bệnh có cơ hội sinh con khỏe mạnh, không mang gen bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ chỉ thị STR có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ thành công trong chẩn đoán và điều trị hemophilia A.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng bộ chỉ thị STR

Nghiên cứu cho thấy bộ chỉ thị STR thiết kế có khả năng phát hiện chính xác các cá thể mang gen bệnh. Tỷ lệ thành công trong việc lựa chọn phôi không mang gen bệnh đạt mức cao, giúp giảm thiểu rủi ro cho thế hệ sau. Kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc quản lý và điều trị hemophilia A tại Việt Nam.

4.2. Tác động đến sức khỏe cộng đồng

Việc áp dụng bộ chỉ thị STR trong chẩn đoán hemophilia A không chỉ mang lại lợi ích cho các gia đình mà còn có tác động tích cực đến sức khỏe cộng đồng. Giảm thiểu số lượng trẻ em sinh ra mang gen bệnh sẽ góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống và giảm gánh nặng cho hệ thống y tế.

V. Kết luận và tương lai của bộ chỉ thị STR trong chẩn đoán hemophilia A

Bộ chỉ thị STR thiết kế cho chẩn đoán hemophilia A là một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực di truyền học. Việc áp dụng bộ chỉ thị này không chỉ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phôi không mang gen bệnh. Tương lai của bộ chỉ thị STR hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc quản lý và điều trị hemophilia A, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho các bệnh nhân.

5.1. Triển vọng nghiên cứu và phát triển bộ chỉ thị STR

Nghiên cứu và phát triển bộ chỉ thị STR cần tiếp tục được thực hiện để cải thiện độ chính xác và hiệu quả trong chẩn đoán hemophilia A. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc mở rộng bộ chỉ thị để bao quát nhiều dạng đột biến gen F8 khác nhau, từ đó nâng cao khả năng phát hiện.

5.2. Tác động đến chính sách y tế

Việc áp dụng bộ chỉ thị STR trong chẩn đoán hemophilia A có thể ảnh hưởng đến chính sách y tế tại Việt Nam. Cần có sự hỗ trợ từ các cơ quan chức năng để đưa bộ chỉ thị vào ứng dụng rộng rãi, từ đó nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân hemophilia A.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hemophilia A là bệnh lý rối loạn đông máu di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X, gây ra bởi các đột biến trên gen F8 dẫn đến suy giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của yếu tố đông máu VIII. Trên quy mô toàn cầu, tỷ lệ mắc bệnh ước tính khoảng 1 trên 5.000 trẻ nam mới sinh. Tại Việt Nam, số liệu thống kê từ Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương ghi nhận khoảng 30.000 người mang gen F8 đột biến và hàng nghìn bệnh nhân đang phải điều trị định kỳ. Bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên đối mặt với nguy cơ chảy máu tự phát tái phát trung bình 40 lần mỗi năm tại các khớp và khối cơ, gây biến dạng khớp vĩnh viễn, tàn phế hoặc tử vong do xuất huyết nội tạng. Kinh phí điều trị thay thế bằng các chế phẩm máu đông lạnh hoặc yếu tố VIII tái tổ hợp vô cùng tốn kém, dao động từ 1 đến 2 tỷ đồng mỗi năm cho một bệnh nhân thể nặng mà không thể chữa khỏi căn nguyên di truyền.

Gen F8 có cấu trúc phức tạp với kích thước lớn lên tới 186 kb gồm 26 exon, mã hóa chuỗi protein 2.332 axit amin. Phổ đột biến gen F8 rất rộng và đa dạng, trong đó đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tới 38,1% đến 50% các trường hợp thể nặng, cùng nhiều dạng đột biến điểm, mất đoạn hoặc chèn đoạn rải rác. Do cấu trúc cồng kềnh và hiện tượng khảm tế bào, việc xét nghiệm trực tiếp các đột biến điểm trên mẫu sinh thiết phôi đơn bào gặp rất nhiều thách thức kỹ thuật. Phương pháp chẩn đoán trước sinh truyền thống qua chọc ối ở tuần thai thứ 16 buộc các cặp vợ chồng phải đối mặt với quyết định đình chỉ thai kỳ đầy đau đớn khi thai nhi mang bệnh.

Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi bệnh đơn gen (PGT-M) kết hợp kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF/ICSI) là giải pháp can thiệp sớm tối ưu, giúp lựa chọn các phôi chuyển không mang gen bệnh. Tuy nhiên, phân tích di truyền trên tế bào phôi thường đối mặt với hiện tượng khuếch đại hỏng allele (Allele Drop-Out - ADO) xảy ra trên 40% các ca xét nghiệm và nguy cơ ngoại nhiễm DNA. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm giải quyết triệt để hai mục tiêu chính: thiết kế bộ chỉ thị trình tự lặp kế tiếp ngắn (Short Tandem Repeat - STR) liên kết chặt với gen F8 có tính đa hình cao trong quần thể người Việt Nam; đồng thời chuẩn hóa và áp dụng thành công bộ chỉ thị này trong quy trình PGT-M cho gia đình bệnh nhân hemophilia A, mở ra giải pháp dự phòng chủ động và an toàn cho cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng thuyết di truyền liên kết nhiễm sắc thể và hiện tượng tái tổ hợp di truyền. Theo các nghiên cứu kinh điển về bản đồ di truyền người, khoảng cách di truyền 1 centimorgan (cM) tương ứng với 1% tần số tái tổ hợp và tương đương khoảng 7,5x10^5 cặp bazơ nitơ (xấp xỉ 1 Mbp) trên khoảng cách vật lý thực tế. Khuyến cáo từ Hội Di truyền Sinh sản Châu Âu chỉ rõ các chỉ thị di truyền phục vụ chẩn đoán gián tiếp cần nằm trong phạm vi từ 1 đến 3 Mbp quanh locus gen bệnh để giảm thiểu tối đa xác suất trao đổi chéo giữa chỉ thị và đột biến mục tiêu.

Cơ sở phân tử của phương pháp dựa trên tính đa hình của các chỉ thị STR. Mỗi STR là tập hợp các đoạn lặp nucleotide ngắn từ 2 đến 6 cặp bazơ với số lần lặp biến thiên cao giữa các cá thể trong quần thể nhưng được di truyền ổn định qua các thế hệ. Mức độ hữu dụng của một chỉ thị STR trong chẩn đoán liên kết được xác định qua ba chỉ số toán học quần thể cốt lõi: tần số dị hợp tử quan sát (Ho), tần số dị hợp tử lý thuyết (He), và hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC). Một chỉ thị được đánh giá có giá trị chẩn đoán cao khi đạt hệ số PIC và Ho lớn hơn 0,5 (tương đương trên 50%), đảm bảo khả năng phân biệt rõ ràng giữa các haplotype mang allele bệnh và allele lành của người mẹ.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng thiết kế mô tả cắt ngang có phân tích, tiến hành qua hai giai đoạn liên tục từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 7 năm 2019 tại Phòng Phân tích DNA thuộc Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y. Cỡ mẫu nghiên cứu xác định tính đa hình được tính toán theo công thức chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) với độ tin cậy 95% (hệ số Z = 1,96), tỷ lệ mẫu không có thông tin kỳ vọng p = 0,45 và sai số biên 10%, cho cỡ mẫu tối thiểu là 95 đối tượng. Trong thực nghiệm, nghiên cứu đã thu thập và phân tích tổng cộng 153 mẫu máu ngoại vi, bao gồm 103 phụ nữ mang gen bệnh hemophilia A tại Trung tâm Hemophilia thuộc Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương và 50 phụ nữ đối chứng khỏe mạnh.

Phương pháp sinh học phân tử được thực hiện qua các bước nghiêm ngặt:

• Sàng lọc chỉ thị: Sử dụng phần mềm Tandem Repeat Finder và cơ sở dữ liệu hệ gen tham chiếu người GRCh38/hg38 để quét các STR nằm trong và cách gen F8 dưới 1 Mbp về hai đầu 5' và 3'.
• Khuếch đại toàn hệ gen (WGA): Áp dụng kỹ thuật khuếch đại đa điểm thay thế (MDA) với bộ hóa chất REPLI-g Single Cell Kit trên mẫu 05 phôi dư thử nghiệm và mẫu 3 đến 5 tế bào sinh thiết phôi ngày thứ 5. Phương pháp MDA được lựa chọn nhờ khả năng tạo các đoạn DNA dài có độ bao phủ đồng đều, khắc phục triệt để hiện tượng phân mảnh thường gặp ở các kỹ thuật dựa trên PCR thoái hóa.
• Phân tích di truyền: Tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi (Multiplex PCR) gắn huỳnh quang (FAM, HEX, NED) với dải nhiệt độ gắn mồi 55 đến 65 độ C. Sản phẩm nhân bản được phân tích kích thước chính xác đến 1 nucleotide bằng hệ thống điện di mao quản tự động ABI 3130/3130XL kết hợp phần mềm GeneMapper phiên bản 4.0.
• Kiểm định lâm sàng: Ứng dụng quy trình PGT-M cho cặp vợ chồng làm thụ tinh trong ống nghiệm có 4 phôi nang. Kết quả chẩn đoán phôi sau đó được đối chứng độc lập bằng phương pháp Long-range PCR (LD-PCR) và phân tích liên kết STR trên mẫu dịch ối 10 ml thu nhận tại tuần thai thứ 16.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã thiết kế và hoàn thiện bộ công cụ gồm 14 chỉ thị STR đa hình cao phân bố đồng đều ở cả vùng nội gen và hai vùng ngoại gen sườn cách gen F8 dưới 1 Mbp trên nhiễm sắc thể Xq28. Qua các bước tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ở 60 độ C và hiệu chỉnh nồng độ các cặp mồi theo từng bước nhảy 0,05 µM, toàn bộ 14 locus STR đã được khuếch đại đồng thời trong một phản ứng Multiplex PCR duy nhất, cho tín hiệu huỳnh quang đồng đều và không xuất hiện sản phẩm phụ hay dimer mồi.

Khảo sát trên 153 mẫu phụ nữ Việt Nam cho thấy các chỉ thị STR được lựa chọn sở hữu tính đa hình vượt trội. Đa số các chỉ thị đạt chỉ số PIC và tần số dị hợp tử quan sát Ho trên 60%, trong đó một số locus ghi nhận độ dị hợp tử rất cao như HA472 đạt 94%, DXS15 đạt 88%, DXS9901 đạt 82% và DXS9897 đạt 68%. Tỷ lệ phụ nữ mang ít nhất một chỉ thị dị hợp tử ở cả hai phía sườn của gen F8 đạt trên 98%, đảm bảo khả năng cung cấp đầy đủ thông tin di truyền để truy vết chính xác nguồn gốc nhiễm sắc thể X mang đột biến.

Trên mô hình thử nghiệm 05 mẫu phôi đơn bào, quy trình MDA và Multiplex PCR đã khuếch đại thành công 100% các locus mục tiêu, nồng độ DNA sau khuếch đại đạt tiêu chuẩn phân tích, tỷ lệ ADO được kiểm soát hoàn toàn. Áp dụng thực tế trên 4 mẫu phôi nang ngày thứ 5 (ký hiệu từ Q1 đến Q4) của gia đình bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22, phân tích phân ly haplotype cho thấy: phôi Q1 và Q4 nhận nhiễm sắc thể X mang allele bệnh từ mẹ, phôi Q2 là phôi nam mang allele lành từ mẹ và phôi Q3 là phôi nữ nhận allele lành từ cả bố và mẹ. Phôi Q2 và Q3 được chỉ định đủ điều kiện chuyển phôi. Kết quả chuyển phôi thành công giúp người mẹ mang thai đơn khỏe mạnh.

Thảo luận kết quả

Các kết quả định lượng về chỉ số Ho, He và PIC trong nghiên cứu có thể được trực quan hóa sinh động thông qua biểu đồ cột so sánh giữa các quần thể di truyền học khác nhau trên thế giới. Dữ liệu thực nghiệm cho thấy tính đa hình của bộ STR trên quần thể người Việt Nam tương đương với các nghiên cứu tại Trung Quốc và Brazil, nhưng vượt trội hơn hẳn so với các bộ chỉ thị từng được áp dụng trước đây tại Việt Nam vốn có nhiều locus chỉ đạt tỷ lệ dị hợp tử thấp khoảng 1,5% đến 20%.

Biểu đồ mô phỏng tần số dị hợp tử quan sát (Ho) của các locus STR tiêu biểu:
Locus HA472:   |==============================================| 94%
Locus DXS15:   |==========================================| 88%
Locus DXS9901: |=======================================| 82%
Locus DXS9897: |================================| 68%
Locus F8Int13: |======================| 46%
Locus F8Int1:  |================| 34%

Việc bố trí các chỉ thị STR nằm xen kẽ nội gen và bao bọc hai đầu ngoại gen với khoảng cách vật lý chặt chẽ dưới 1 Mbp có ý nghĩa quyết định về mặt khoa học. Khoảng cách này giới hạn xác suất trao đổi chéo xuống mức dưới 0,1%, loại trừ nguy cơ chẩn đoán sai lệch do tái tổ hợp di truyền. Đồng thời, cấu trúc đa locus cho phép các chỉ thị bổ trợ thông tin cho nhau, loại bỏ hoàn toàn rủi ro mất dấu vết di truyền khi có hiện tượng ADO cục bộ tại một vị trí bất kỳ.

Hình ảnh điện di mao quản phân giải cao 1 nucleotide đã minh chứng rõ ràng sự phân tách giữa các đỉnh tín hiệu huỳnh quang của từng allele. Ở tuần thứ 16 của thai kỳ, xét nghiệm chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp chọc ối đối chứng song song qua kỹ thuật Long-range PCR và phân tích liên kết STR đã xác nhận 100% độ chính xác: thai nhi mang bộ gen hoàn toàn khỏe mạnh, không mang đột biến đảo đoạn intron 22, trùng khớp tuyệt đối với chẩn đoán phôi trước đó.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên những phát hiện khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài, các khuyến nghị cụ thể được đề xuất nhằm mở rộng ứng dụng kỹ thuật trong y học sinh sản:

• Chuẩn hóa và chuyển giao quy trình kỹ thuật: Bộ Y tế và các cơ sở y tế chuyên ngành cần ban hành hướng dẫn chuẩn quốc gia về quy trình xét nghiệm PGT-M cho bệnh hemophilia A dựa trên kỹ thuật Multiplex PCR và điện di mao quản 14 STR. Đặt mục tiêu rút ngắn thời gian trả kết quả chẩn đoán phôi xuống dưới 48 giờ để phục vụ chuyển phôi tươi hoặc hỗ trợ kế hoạch trữ đông phôi hiệu quả tại hơn 30 trung tâm hỗ trợ sinh sản trên cả nước.
• Xây dựng ngân hàng dữ liệu di truyền quần thể: Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương phối hợp cùng Học viện Quân Y triển khai thu thập và số hóa dữ liệu đa hình STR trên 1.000 gia đình mang gen hemophilia A tại các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam trước năm 2028, tạo nguồn tham chiếu chuẩn cho các xét nghiệm di truyền liên kết.
• Mở rộng chính sách bảo hiểm và hỗ trợ chi phí: Đề xuất các cơ quan quản lý bảo hiểm y tế xây dựng lộ trình chi trả từ 30% đến 50% chi phí xét nghiệm di truyền PGT-M cho các cặp vợ chồng có tiền sử sinh con mắc bệnh hiểm nghèo, giúp giảm gánh nặng tài chính lâu dài cho ngân sách nhà nước trong việc điều trị các ca bệnh hemophilia thể nặng.
• Đào tạo nguồn nhân lực chất lượng cao: Các trường đại học y dược và viện nghiên cứu cần tổ chức ít nhất 10 khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật sinh thiết phôi ngày 5, kỹ thuật khuếch đại đơn tế bào MDA và phân tích dữ liệu GeneMapper cho khoảng 200 kỹ thuật viên và bác sĩ phôi học trong giai đoạn từ nay đến năm 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả của luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn to lớn cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Bác sĩ và chuyên viên phôi học tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản (IVF): Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thực nghiệm chi tiết từ khâu xử lý tế bào sinh thiết phôi, kỹ thuật khuếch đại WGA bằng enzyme MDA đến các thông số chu trình nhiệt PCR đa mồi phục vụ chẩn đoán PGT-M chính xác.
• Nhà nghiên cứu và học viên cao học ngành Di truyền học, Sinh học phân tử: Nguồn tài liệu tham khảo giá trị về phương pháp sàng lọc in-silico, nguyên lý thiết kế mồi gắn huỳnh quang, các công thức toán sinh thống kê tính toán chỉ số đa hình quần thể (Ho, He, PIC) và kỹ thuật phân tích liên kết gen.
• Bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Huyết học và Nhi khoa: Cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc về cơ sở phân tử của gen F8 và các thể lâm sàng hemophilia A, hỗ trợ đắc lực cho công tác tư vấn di truyền tiền hôn nhân và định hướng điều trị dự phòng cho các gia đình có tiền sử bệnh.
• Các nhà quản lý y tế và chuyên gia hoạch định chính sách dân số: Tài liệu thực chứng quan trọng minh chứng cho hiệu quả chi phí - lợi ích của việc ứng dụng công nghệ sinh học phân tử hiện đại vào sàng lọc trước chuyển phôi nhằm nâng cao chất lượng dân số và giảm thiểu gánh nặng y tế cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chẩn đoán trước chuyển phôi (PGT-M) lại ưu việt hơn chẩn đoán trước sinh truyền thống ở bệnh hemophilia A? Chẩn đoán trước sinh truyền thống qua chọc ối thực hiện khi thai đã đạt 16 tuần tuổi, khiến thai phụ phải đối mặt với nguy cơ sảy thai và áp lực tâm lý nặng nề khi phải đình chỉ thai kỳ nếu thai mang bệnh. PGT-M can thiệp ngay ở giai đoạn phôi 5 ngày tuổi trong ống nghiệm, cho phép chủ động lựa chọn chuyển các phôi hoàn toàn khỏe mạnh, loại bỏ triệt để nguy cơ mang thai bệnh lý.

2. Hiện tượng Allele Drop-Out (ADO) ảnh hưởng như thế nào đến độ chính xác của PGT-M và giải pháp khắc phục là gì? Hiện tượng ADO xảy ra khi một trong hai allele ở tế bào dị hợp tử bị khuếch đại thất bại, xuất hiện ở hơn 40% các ca chẩn đoán đơn tế bào, dễ dẫn đến kết luận sai lệch phôi mang bệnh thành phôi lành hoặc ngược lại. Nghiên cứu khắc phục triệt để vấn đề này bằng cách kết hợp kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt MDA cùng hệ thống 14 chỉ thị STR đa hình cao bao quanh gen, giúp kiểm chứng chéo thông tin giữa các locus.

3. Vì sao các chỉ thị STR bắt buộc phải nằm trong phạm vi cách gen F8 dưới 1 Mbp? Khoảng cách vật lý 1 Mbp tương đương khoảng 1 cM về mặt di truyền, với xác suất xảy ra hiện tượng trao đổi chéo trong giảm phân dưới 1%. Bố trí các STR trong phạm vi này ở cả hai đầu 5' và 3' của gen F8 đảm bảo các chỉ thị luôn di truyền liên kết cùng allele bệnh, triệt tiêu nguy cơ chẩn đoán sai do tái tổ hợp nhiễm sắc thể.

4. Bộ chỉ thị 14 STR này có thể áp dụng phổ quát cho mọi gia đình bệnh nhân tại Việt Nam hay không? Bộ chỉ thị đạt độ dị hợp tử tích lũy trên 98% trong quần thể phụ nữ Việt Nam. Do đó, gần như 100% các gia đình mang gen bệnh khi tiến hành xét nghiệm sàng lọc đều tìm thấy từ 2 đến nhiều chỉ thị STR dị hợp tử mang đầy đủ thông tin di truyền ở hai bên sườn gen F8, đủ điều kiện để thực hiện PGT-M chính xác.

5. Vai trò của kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen MDA trong quy trình xét nghiệm phôi là gì? Lượng DNA ban đầu từ 3 đến 5 tế bào sinh thiết phôi vô cùng nhỏ, chỉ khoảng vài picogram. Kỹ thuật MDA sử dụng enzyme phi29 polymerase giúp khuếch đại đồng đều toàn bộ hệ gen lên hàng triệu lần mà không làm đứt gãy DNA, cung cấp lượng khuôn dồi dào và chất lượng cao cho các phản ứng PCR đa mồi tiếp theo.

Kết luận

• Thiết kế thành công bộ công cụ gồm 14 chỉ thị STR đa hình cao liên kết chặt chẽ với gen F8 trong phạm vi 1 Mbp, tối ưu hóa cho hệ gen người Việt Nam.
• Khảo sát và xác lập dữ liệu đa hình di truyền trên 153 phụ nữ Việt Nam, ghi nhận nhiều locus có độ dị hợp tử quan sát vượt trội trên 80% như HA472, DXS15, DXS9901, nâng tỷ lệ gia đình có đủ thông tin chẩn đoán lên trên 98%.
• Chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật tích hợp giữa khuếch đại toàn hệ gen MDA, phản ứng Multiplex PCR gắn huỳnh quang và điện di mao quản, kiểm soát hoàn toàn hiện tượng ADO và ngoại nhiễm trên mẫu tế bào phôi.
• Áp dụng thành công vào thực tiễn lâm sàng cho 4 phôi thụ tinh trong ống nghiệm, giúp cặp vợ chồng mang gen bệnh sinh con khỏe mạnh, kết quả được đối chứng chính xác tuyệt đối qua chẩn đoán dịch ối ở tuần thai thứ 16.
• Mở ra hướng tiếp cận y học sinh sản chính xác, tạo tiền đề vững chắc cho việc mở rộng chuyển giao công nghệ PGT-M hemophilia A tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên toàn quốc trong giai đoạn 2025-2030.

Nghiên cứu khẳng định bước tiến làm chủ công nghệ di truyền phân tử cao cấp tại Việt Nam, mang lại hy vọng to lớn cho hàng chục nghìn gia đình mang gen bệnh hemophilia A trong hành trình sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Để nhận thêm thông tin chuyển giao kỹ thuật hoặc tư vấn chi tiết về quy trình PGT-M, các cơ sở y tế và độc giả có thể liên hệ trực tiếp với nhóm tác giả tại Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan hemophilia A Hemophilia, hay bệnh ưa chảy máu, là bệnh rối loạn đông máu di truyền biểu hiện lâm sàng chủ yếu là máu chảy khó cầm ở các vết thương như đứt tay, nhổ răng và các khối máu tụ ở khớp, cơ thường xuất hiện nhiều lần ở một khớp (hình 1). Người mắc bệnh này phải truyền máu thường xuyên, sống nhờ máu người khác với dung tích lớn, không được hoạt động mạnh.

Cơ chế di truyền của bệnh liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên NST X, không có allele tương ứng trên NST Y, gây thiếu hụt hay bất thường chức năng của các yếu tố đông máu. Bệnh gồm 3 thể: hemophilia A (80-85%) thiếu yếu tố VIII, hemophilia B (15-20%) thiếu yếu tố IX, hemophilia C (chủ yếu ở người Do Thái với tỷ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ) thiếu yếu tố XI [34]. Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp [15, 83] Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới, cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc các nước châu Á [49, 74]. Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử.

Người 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A. Triệu chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy máu là đặc trưng của bệnh. Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng. Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm.

Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn chuyển động của các khớp. Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn thương nhỏ. Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy máu đến chết sau chấn thương. Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm dưới 30%.

Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ. Ở thể nặng, hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong tháng. Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ. Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5].

Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86] Nồng độ % yếu tố Thể bệnh Biểu hiện chảy máu VIII (đơn vị/ml) Nặng Chảy máu tự nhiên không liên quan đến chấn 1% (<0,01) (chiếm 70%) thương, thường chảy máu ở khớp và cơ. Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn Trung bình 1–5% thương nhỏ. Chảy máu nặng sau chấn (chiếm 15%) (0,01 – 0,05) thương, phẫu thuật. Nhẹ 5 – 40% Chảy máu sau chấn thương lớn/phẫu thuật.

(chiếm 15%) (0,04 – 0,4) 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành thể nhẹ của bệnh. Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động của FVIII [48]. Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp dụng [33]. Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình mang gen bệnh.

Cơ sở phân tử của bệnh Gen F8 nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X (chrX: 154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser, GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm 26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD. Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII gây nên bệnh hemophilia A [18]. Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố. Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25].

Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1%. Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%. Chiếm tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotide với tỷ lệ 9,8%. Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1].

Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1]. Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1] Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia [65]. Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50% bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16, 53]. Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41].

Hiện tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp. Đảo đoạn intron 1 xảy ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí 140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41]. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25] Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70]. Dạng đột biến này là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77].

Đột biến chèn đoạn lớn làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68]. Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức năng. Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố. Nhiều đột 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân, ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị trí 2147 tạo thành stop codon) [39].

Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide. Phổ biến nhất là mất hoặc chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c. Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25] Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân. Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân.

Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ [25]. Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự nhau. Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh [19]. Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với “kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59].

Không phải tất cả 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Kim Ngân – K26 CH những bệnh nhân hemophilia A thể nặng thường xuyên chảy máu tự phát, thậm chí trong số những người bị chảy máu, mức độ nặng của bệnh cũng khác biệt đáng kể. Cơ sở cho sự khác biệt này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn [36, 71]. Gần đây đã có báo cáo chứng minh được tần số một số loại đột biến là khác nhau ở hai giới: tỷ lệ đảo đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần ở tế bào mầm sinh dục nữ.