Luận văn thạc sĩ: Đánh giá khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF 4α trong tế bào gốc cuống rốn người, góp phần vào hiểu biết về sinh học tế bào.

• Tác giả: Phùng Minh Tuấn
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hữu Đức
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. TẾ BÀO GỐC
• 3.1.1. Định nghĩa tế bào gốc
• 3.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc
• 3.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc
• 3.2. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 3.2.1. Cấu tạo, chức năng của dây rốn
• 3.2.2. Tế bào gốc dây rốn
• 3.2.3. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs
• 3.3. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS
• 3.3.1. Đặc điểm gen HNF - 4α
• 3.3.2. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc
• 4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 4.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 4.3. Mẫu xét nghiệm
• 4.4. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất
• 4.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn
• 4.5.2. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn
• 4.5.3. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR)
• 4.5.4. Điện di trên gel agarose
• 4.5.5. Phân lập gen HNF - 4α
• 4.5.6. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO
• 5.1.1. Phân lập tế bào
• 5.1.2. Cấy chuyển tế bào. Đông lạnh tế bào
• 5.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 5.2.1. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM
• 5.2.2. Tách chiết RNA tổng số
• 5.2.3. Định lượng RNA tổng số
• 5.2.4. Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa
• 5.2.5. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa
• 5.3. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α
• 5.3.1. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α
• 5.3.2. Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng biểu hiện HNF 4α trong tế bào gốc cuống rốn người

Khả năng biểu hiện của gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người là một chủ đề nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. HNF-4α là một yếu tố phiên mã quan trọng, có vai trò trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế biệt hóa mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý gan.

1.1. Định nghĩa và vai trò của HNF 4α trong tế bào gốc

HNF-4α (Human hepatocyte nuclear factor 4 alpha) là một yếu tố phiên mã quan trọng trong sự phát triển và chức năng của tế bào gan. Nó điều chỉnh nhiều gen liên quan đến chức năng gan và có vai trò trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan. Nghiên cứu cho thấy HNF-4α có thể ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa của tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan.

1.2. Tầm quan trọng của tế bào gốc cuống rốn trong nghiên cứu

Tế bào gốc cuống rốn (hWJSCs) là nguồn tế bào gốc phong phú và dễ thu thập. Chúng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào gan. Việc nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh gan.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu HNF 4α

Mặc dù HNF-4α có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những vấn đề chính là sự thiếu hiểu biết về cơ chế điều chỉnh biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn.

2.1. Những khó khăn trong việc thu thập và nuôi cấy tế bào gốc

Việc thu thập tế bào gốc cuống rốn gặp nhiều khó khăn do quy trình phức tạp và yêu cầu kỹ thuật cao. Ngoài ra, việc nuôi cấy tế bào gốc cũng cần điều kiện môi trường tối ưu để duy trì khả năng sống sót và khả năng biệt hóa của tế bào.

2.2. Thiếu thông tin về cơ chế điều chỉnh HNF 4α

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về HNF-4α, nhưng cơ chế điều chỉnh biểu hiện của nó trong tế bào gốc cuống rốn vẫn chưa được làm rõ. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả dựa trên HNF-4α.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF 4α

Để đánh giá khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn, nhiều phương pháp nghiên cứu đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào và phân tích biểu hiện gen.

3.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc cuống rốn

Quá trình phân lập tế bào gốc cuống rốn bao gồm việc thu thập mẫu dây rốn, xử lý và nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Các tế bào gốc được phân lập sẽ được nuôi cấy để đánh giá khả năng sống sót và khả năng biệt hóa.

3.2. Phân tích biểu hiện gen HNF 4α

Phân tích biểu hiện gen HNF-4α được thực hiện thông qua các phương pháp như RT-PCR và điện di gel. Những phương pháp này giúp xác định mức độ biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn trước và sau khi xử lý biệt hóa.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn có thể được kích thích thông qua các phương pháp biệt hóa. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho bệnh gan.

4.1. Kết quả biểu hiện HNF 4α sau xử lý biệt hóa

Nghiên cứu cho thấy rằng sau khi xử lý biệt hóa với DMSO, biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn tăng lên đáng kể. Điều này cho thấy HNF-4α có thể là một chỉ thị quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh gan

Khả năng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý gan như viêm gan và xơ gan. Việc sử dụng tế bào gốc cuống rốn có thể mang lại hy vọng cho hàng triệu bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu HNF 4α

Nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực y học tái sinh. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế biểu hiện của HNF-4α có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh gan.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tế bào gốc cuống rốn

Nghiên cứu về tế bào gốc cuống rốn sẽ tiếp tục phát triển, với hy vọng tìm ra các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý khác nhau. HNF-4α sẽ là một trong những yếu tố quan trọng trong các nghiên cứu này.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để làm rõ cơ chế điều chỉnh biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa các phương pháp điều trị dựa trên tế bào gốc và HNF-4α.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG MINH TUẤN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn theo sát, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga và các anh chị cán bộ phòng Công nghệ phôi, viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào chức năng gan từ tế bào gốc người và chuột”, Mã số: VAST.03/16-17, đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. V DANH MỤC HÌNH ẢNH. VI DANH MỤC BẢNG BIỂU. VII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .VIII THESIS ABSTRACT.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TẾ BÀO GỐC.

Định nghĩa tế bào gốc. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc. Ứng dụng của tế bào gốc. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN.

Cấu tạo, chức năng của dây rốn. Tế bào gốc dây rốn. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS.

Đặc điểm gen HNF - 4α. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

NGUYÊN VẬT LIỆU. 22 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mẫu xét nghiệm. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR).

Điện di trên gel agarose. Phân lập gen HNF - 4α. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO. Phân lập tế bào. Cấy chuyển tế bào. Đông lạnh tế bào.

ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM. Tách chiết RNA tổng số. Định lượng RNA tổng số.

Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α.

Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 53 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HNF - 4α Human hepatocyte nuclear factor - 4 MSC Mesenchymal Stem Cell iPS cell Induced pluripotent stem cell ES Embryonic stem cells EG Embryonic germ cells DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complement deoxyribonucleic acid Bp Base pair Kb Kilo base bFGF Basic fibroblast growth factor CHT Collagenase / hyaluronidase trypsin CT Collagenase/ trypsin DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum HSC Hemapoietic stem cell hWJSCs (human umbilical cord Wharton’s jelly Stem Cell) Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người ICM Inner cell mass IVF In vitro fertilization ITS Insulin – transferin – selenium ICSI Intracytop plasmide sperm injecti TBGTM Tế bào gốc trung mô RT – PCR Reverse-transcription Polymerase chain reaction TBG Tế bào gốc WJ Wharton’s jelly E.coli Escherichia coli Taq Thermus aquaticus UV Ultra violet (tia cực tím) CDS Coding sequence (trình tự mã hóa) TAE Tris-axit axetic-EDTA v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. Chức năng của tế bào gốc.

Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải). Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc. Cấu tạo của dây rốn. Mẫu dây rốn trước khi xử lý.

Sử dụng dao và panh để chọn lọc phần mô cần sử dụng. Mẫu dây rốn trước khi xử lý. Tủ nuôi cấy tế bào 37oC, 5% CO2. Quy trình tách RNA tổng số bằng kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN).

Nguyên lý RT-PCR. Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô. Tế bào trước khi cấy chuyển (trái) và ở lần cấy chuyển thứ 4 (phải). Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau.

Tế bào mọc kín đĩa nuôi. Tế bào sau khi được ủ với trypsin 0. Tế bào soi trên kính hiển vi sau khi nhuộm Trypan Blue. Nhiễm sắc thể (NST) ở lần cấy chuyển thứ 2.

Điện di đồ tách chiết RNA tổng số. Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập. Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau xử lý biệt hóa. Điện di đồ PCR khuếch đại CDS của gen HNF - 4α.

Kết quả kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank. 52 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3. Trang thiết bị và dụng cụ. Hóa chất thí nghiệm.

Thành phần phản ứng PCR. Trình tự các cặp mồi sử dụng đánh giá chỉ thị TBGTM. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α. Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết.

Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng. Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc. Trình tự được đọc bằng mồi vector (PacI–HNF-4α và PacI–HNF-4α). 51 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể.

Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa. TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn.

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa. Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A. Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả: nghiên cứu đã phân lập được tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: dương tính CD90, CD73, CD105, âm tính với các chỉ thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P. Kết quả nghiên cứu cho thấy biểu hiện của gen HNF - 4α âm tính ở tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa.

Sau xử lý biệt hóa với DMSO, chỉ thị gen HNF - 4α đã biểu hiện sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiên cứu đã phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen được kiểm tra trên genbank. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Stem cells are the potential cells in the body. The cell's ability to differentiate into other specialized cell types.

The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009). Recently a series of studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells, giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai et al., 2007; Cantz et al. However, the exact mechanism of the differentiation from umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified. We conducted a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation.

In this thesis, we have used the following research methods: Cellular isolation (Applied by A.