Luận văn thạc sĩ: Đánh giá khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người

Luận văn thạc sĩ vnua nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF 4α trong tế bào gốc cuống rốn người, góp phần vào hiểu biết về sinh học tế bào.

• Tác giả: Phùng Minh Tuấn
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hữu Đức
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU
• 3. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 3.1. TẾ BÀO GỐC
• 3.1.1. Định nghĩa tế bào gốc
• 3.1.2. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc
• 3.1.3. Ứng dụng của tế bào gốc
• 3.2. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 3.2.1. Cấu tạo, chức năng của dây rốn
• 3.2.2. Tế bào gốc dây rốn
• 3.2.3. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs
• 3.3. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS
• 3.3.1. Đặc điểm gen HNF - 4α
• 3.3.2. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc
• 4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 4.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
• 4.3. Mẫu xét nghiệm
• 4.4. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất
• 4.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.5.1. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn
• 4.5.2. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn
• 4.5.3. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR)
• 4.5.4. Điện di trên gel agarose
• 4.5.5. Phân lập gen HNF - 4α
• 4.5.6. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO
• 5.1.1. Phân lập tế bào
• 5.1.2. Cấy chuyển tế bào. Đông lạnh tế bào
• 5.2. ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN
• 5.2.1. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM
• 5.2.2. Tách chiết RNA tổng số
• 5.2.3. Định lượng RNA tổng số
• 5.2.4. Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa
• 5.2.5. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa
• 5.3. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α
• 5.3.1. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α
• 5.3.2. Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng biểu hiện HNF 4α trong tế bào gốc cuống rốn người

Khả năng biểu hiện của gen HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người là một chủ đề nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học. HNF-4α là một yếu tố phiên mã quan trọng, có vai trò trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế biệt hóa mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý gan.

1.1. Định nghĩa và vai trò của HNF 4α trong tế bào gốc

HNF-4α (Human hepatocyte nuclear factor 4 alpha) là một yếu tố phiên mã quan trọng trong sự phát triển và chức năng của tế bào gan. Nó điều chỉnh nhiều gen liên quan đến chức năng gan và có vai trò trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan. Nghiên cứu cho thấy HNF-4α có thể ảnh hưởng đến khả năng biệt hóa của tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan.

1.2. Tầm quan trọng của tế bào gốc cuống rốn trong nghiên cứu

Tế bào gốc cuống rốn (hWJSCs) là nguồn tế bào gốc phong phú và dễ thu thập. Chúng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm tế bào gan. Việc nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh gan.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu HNF 4α

Mặc dù HNF-4α có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những vấn đề chính là sự thiếu hiểu biết về cơ chế điều chỉnh biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn.

2.1. Những khó khăn trong việc thu thập và nuôi cấy tế bào gốc

Việc thu thập tế bào gốc cuống rốn gặp nhiều khó khăn do quy trình phức tạp và yêu cầu kỹ thuật cao. Ngoài ra, việc nuôi cấy tế bào gốc cũng cần điều kiện môi trường tối ưu để duy trì khả năng sống sót và khả năng biệt hóa của tế bào.

2.2. Thiếu thông tin về cơ chế điều chỉnh HNF 4α

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về HNF-4α, nhưng cơ chế điều chỉnh biểu hiện của nó trong tế bào gốc cuống rốn vẫn chưa được làm rõ. Điều này gây khó khăn trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả dựa trên HNF-4α.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF 4α

Để đánh giá khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn, nhiều phương pháp nghiên cứu đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào và phân tích biểu hiện gen.

3.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc cuống rốn

Quá trình phân lập tế bào gốc cuống rốn bao gồm việc thu thập mẫu dây rốn, xử lý và nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Các tế bào gốc được phân lập sẽ được nuôi cấy để đánh giá khả năng sống sót và khả năng biệt hóa.

3.2. Phân tích biểu hiện gen HNF 4α

Phân tích biểu hiện gen HNF-4α được thực hiện thông qua các phương pháp như RT-PCR và điện di gel. Những phương pháp này giúp xác định mức độ biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn trước và sau khi xử lý biệt hóa.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn có thể được kích thích thông qua các phương pháp biệt hóa. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho bệnh gan.

4.1. Kết quả biểu hiện HNF 4α sau xử lý biệt hóa

Nghiên cứu cho thấy rằng sau khi xử lý biệt hóa với DMSO, biểu hiện của HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn tăng lên đáng kể. Điều này cho thấy HNF-4α có thể là một chỉ thị quan trọng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gan.

4.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh gan

Khả năng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan có thể được ứng dụng trong điều trị các bệnh lý gan như viêm gan và xơ gan. Việc sử dụng tế bào gốc cuống rốn có thể mang lại hy vọng cho hàng triệu bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu HNF 4α

Nghiên cứu khả năng biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn người mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực y học tái sinh. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế biểu hiện của HNF-4α có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh gan.

5.1. Tương lai của nghiên cứu tế bào gốc cuống rốn

Nghiên cứu về tế bào gốc cuống rốn sẽ tiếp tục phát triển, với hy vọng tìm ra các phương pháp điều trị mới cho nhiều bệnh lý khác nhau. HNF-4α sẽ là một trong những yếu tố quan trọng trong các nghiên cứu này.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để làm rõ cơ chế điều chỉnh biểu hiện HNF-4α trong tế bào gốc cuống rốn. Điều này sẽ giúp tối ưu hóa các phương pháp điều trị dựa trên tế bào gốc và HNF-4α.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo thống kê y tế toàn cầu, các bệnh lý mãn tính về gan như xơ gan và ung thư gan đang đe dọa sức khỏe của hơn 350 triệu bệnh nhân, với tỷ lệ tử vong do suy gan giai đoạn cuối chiếm khoảng 3,5% tổng số ca tử vong hằng năm. Trong bối cảnh nguồn tạng hiến ghép khan hiếm nghiêm trọng, việc ứng dụng công nghệ tế bào gốc nhằm tái tạo tế bào chức năng gan mở ra triển vọng điều trị mang tính đột phá. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học của tác giả Phùng Minh Tuấn tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam tập trung vào đề tài: "Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người". Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập thành công tế bào gốc trung mô từ lớp thạch Wharton của dây rốn người (hWJSCs), đánh giá sự biểu hiện của yếu tố phiên mã then chốt HNF - 4α trước và sau khi xử lý biệt hóa bằng chất cảm ứng hóa học DMSO, đồng thời nhân dòng và phân lập đoạn gen mã hóa CDS của HNF - 4α phục vụ công tác tạo dòng tế bào chức năng. Đề tài được triển khai trong thời gian 9 tháng, từ tháng 8/2016 đến tháng 4/2017, tại Phòng Công nghệ phôi thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả nghiên cứu xác lập độ tương thích trình tự gen đạt 100% so với cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank và cung cấp nền tảng chuẩn hóa quy trình biệt hóa tế bào gan với hiệu suất biểu hiện gen mục tiêu sau 4 tuần nuôi cấy.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên 2 nền tảng lý thuyết cốt lõi trong sinh học phát triển và công nghệ tế bào gốc:

Thứ nhất, lý thuyết về tính đa năng và khả năng tự làm mới của tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs). Tế bào gốc phân lập từ lớp thạch Wharton của cuống rốn người (hWJSCs) sở hữu tiềm năng phân chia mạnh mẽ thành các tế bào thuộc cả 3 lá phôi mà không vướng phải các rào cản đạo đức sinh học như tế bào gốc phôi. Về mặt dấu ấn sinh học bề mặt, quần thể hWJSCs chuẩn phải biểu hiện dương tính với các thụ thể CD73, CD90, CD105 và âm tính hoàn toàn với các chỉ thị dòng tạo máu gồm CD14, CD34, CD45.

Thứ hai, mô hình mạng lưới phiên mã điều hòa biệt hóa tế bào gan với nhân tố trung tâm là HNF - 4α (Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha). HNF - 4α là một thụ thể nhân tế bào thuộc siêu họ NR2A1, có cấu trúc gồm 10 exon và 9 intron với kích thước gen lên đến 70 kb, trong đó trình tự mã hóa CDS dài 1339 cặp base mã hóa cho 442 axit amin. Yếu tố phiên mã này giữ vai trò điều phối mạng lưới hơn 100 gen chức năng gan, thúc đẩy sự hình thành tế bào nhu mô gan trưởng thành thông qua các dấu ấn sinh học như Albumin (ALB) và Glucose-6-Phosphatase (G6P).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập mẫu dây rốn có chiều dài tối thiểu trên 7 cm từ các sản phụ sinh thường hoặc sinh mổ tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội. Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 5 mẫu mô cuống rốn đạt chuẩn sau khi đã qua quy trình sàng lọc lâm sàng nghiêm ngặt, bảo đảm 100% âm tính với các tác nhân virus truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV và HPV. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu có chủ đích dựa trên tiêu chuẩn sinh học kiểm định nghiêm ngặt.

Quy trình phân lập tế bào áp dụng phương pháp nuôi cấy mảnh mô nhỏ (Explant method) cải tiến: mẫu mô được cắt nhỏ thành các khối 2 - 3 mm2, cố định bám dính trên đĩa nuôi 4 giếng trong môi trường DMEM/F12 bổ sung 15% huyết thanh thai bò (FBS), nuôi ở điều kiện 37°C và 5% CO2. Lý do lựa chọn phương pháp mảnh mô thay vì phân hủy enzyme là nhằm hạn chế tổn thương cấu trúc màng tế bào, duy trì khả năng tăng sinh bền vững lên đến 80 ngày.

Quy trình phân tích biểu hiện gen sử dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu kết hợp tách chiết RNA bằng cột lọc silica, kiểm tra chất lượng qua điện di trên gel agarose 0,8% dưới ánh sáng tia cực tím UV ở bước sóng 302 nm. Quá trình nhân dòng CDS gen HNF - 4α sử dụng cặp mồi PacI-HNF4α và NsiI-HNF4α trải qua 30 chu kỳ nhiệt PCR và giải trình tự gen đối chiếu trực tiếp trên hệ thống GenBank.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Luận văn đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có giá trị khoa học vượt bậc:

1. Hiệu quả phân lập và động học tăng sinh: Sau khoảng 20 ngày nuôi cấy sơ cấp, tế bào gốc trung mô bắt đầu di cư rõ rệt từ rìa mảnh mô ra bề mặt đĩa nuôi cấy. Khi đạt mật độ bao phủ bề mặt từ 70% đến 80%, tế bào được cấy chuyển ổn định. Tốc độ tăng sinh đạt cực đại ở các lần cấy chuyển từ P3 đến P4 (gấp 3 đến 4 lần lượng tế bào ban đầu), sau đó giảm dần ở P10 - P12 và dừng tăng sinh hoàn toàn sau lần cấy chuyển thứ 13 (P13).

2. Tỷ lệ sống sót và tính ổn định sau bảo quản lạnh: Tế bào sau khi thu nhận ở lần cấy chuyển P4 được bảo quản đông sâu trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196°C. Thử nghiệm nhuộm Trypan Blue 0,4% trên buồng đếm hồng cầu Thoma cho thấy tỷ lệ sống trước đông lạnh đạt 100%, và sau khi giải đông tỷ lệ sống sót hồi phục đạt trên 88%, tế bào nhanh chóng bám dính và tái lập hình thái nguyên bào sợi kéo dài.

3. Xác thực kiểu hình miễn dịch phân tử: Điện di sản phẩm RT-PCR khẳng định các tế bào gốc phân lập được dương tính mạnh với các marker trung mô CD73, CD90, CD105, đồng thời âm tính 100% với các chỉ thị dòng tạo máu CD34, CD86. Trước khi biệt hóa, tế bào không có bất kỳ biểu hiện nào của các gen chuyên biệt gan gồm HNF - 4α, ALB và G6P.

4. Cảm ứng biểu hiện gen HNF - 4α thành công: Sau khi xử lý biệt hóa tế bào gốc bằng hóa chất DMSO trong thời gian 4 tuần nuôi cấy liên tục, kết quả phân tích RT-PCR ghi nhận sự xuất hiện rõ nét của băng vạch phiên mã gen HNF - 4α. Trình tự CDS phân lập dài 1339 bp đạt độ tương đồng 100% với trình tự chuẩn đã công bố của người trên GenBank.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân tế bào gốc cuống rốn ban đầu hoàn toàn âm tính với HNF - 4α là do chúng duy trì trạng thái trung mô nguyên thủy chưa biệt hóa. Dưới tác động cảm ứng của DMSO qua 4 tuần, cơ chế tái lập trình biểu sinh đã kích hoạt promoter của gen HNF - 4α, khởi động quá trình phiên mã. Kết quả này tương đồng chặt chẽ với các công bố quốc tế của một nghiên cứu gần đây khi sử dụng HGF và FGF-4 để tạo tế bào giống gan đạt tỷ lệ bắt màu PAS 82,9%, cũng như nghiên cứu của nhóm tác giả Chen về vai trò của HNF - 4α trong định hướng tế bào gốc tủy xương.

Về mặt hiển thị dữ liệu, các kết quả tăng sinh tế bào theo số lần cấy chuyển có thể được trực quan hóa tối ưu bằng biểu đồ đường (line chart) thể hiện động học phát triển qua các thế hệ từ P1 đến P13, trong đó đồ thị đạt đỉnh hình chuông ở P3 - P4. Đồng thời, biểu đồ cột so sánh (bar chart) hoặc bảng tổng hợp ma trận đối chiếu biểu hiện marker trước và sau 4 tuần biệt hóa (dương tính CD90/CD73/CD105 chuyển dịch sang dương tính HNF-4α/ALB) sẽ giúp người đọc dễ dàng định lượng mức độ biệt hóa thành công của tế bào. Việc phân lập thành công đoạn gen 1339 bp với độ chính xác 100% khẳng định khả năng ứng dụng trực tiếp đoạn gen này làm vector chuyển gen tái tổ hợp để chủ động cưỡng bức biệt hóa tế bào gốc mà không phụ thuộc hoàn toàn vào các yếu tố sinh trưởng đắt đỏ.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả thực nghiệm, luận văn đề xuất 4 giải pháp khoa học và ứng dụng cụ thể:

1. Thiết kế và tạo dòng vector biểu hiện tái tổ hợp mang CDS HNF - 4α: Đội ngũ nghiên cứu phòng thí nghiệm cần tiến hành gắn đoạn gen 1339 bp đã phân lập vào vector chuyển gen động vật nhằm nâng cao hiệu suất chuyển nạp gen vào tế bào gốc lên trên 75% trong vòng 6 tháng tới.

2. Chuẩn hóa môi trường nuôi cấy không huyết thanh (serum-free medium): Các viện nghiên cứu y sinh học cần thay thế hoàn toàn huyết thanh thai bò (FBS 15%) bằng các chất bổ sung tái tổ hợp như ITS kết hợp EGF (30 µl) và bFGF (60 µl) để loại trừ 100% nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh động vật trước năm 2028, phục vụ mục tiêu thử nghiệm lâm sàng.

3. Mở rộng thử nghiệm chức năng chuyển hóa của tế bào sau biệt hóa: Các nhóm nghiên cứu chuyên sâu cần triển khai đánh giá khả năng tích lũy glycogen và hấp thu hạt mỡ LDL trong lộ trình 12 tháng, hướng tới mục tiêu tế bào đạt trên 80% chức năng tương đương tế bào gan thật.

4. Thành lập quy trình liên kết thu nhận mẫu với các ngân hàng mô cuống rốn: Các cơ sở y tế và bệnh viện phụ sản cần ban hành quy chuẩn tiếp nhận mẫu dây rốn dài trên 7 cm trong vòng 12 đến 24 giờ sau sinh, bảo đảm duy trì tỷ lệ tế bào sống sót đạt trên 90% khi lưu trữ dài hạn tại nhiệt độ -196°C.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm sau:

1. Nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Công nghệ sinh học và Y sinh học: Nắm vững quy trình chuẩn phân lập tế bào gốc trung mô theo phương pháp nuôi cấy mảnh mô, kỹ thuật RT-PCR và giải trình tự gen mục tiêu với độ chính xác 100%.

2. Bác sĩ và chuyên gia điều trị bệnh lý gan mật: Khảo sát mô hình biệt hóa tế bào gan in vitro làm cơ sở xây dựng liệu pháp tế bào thay thế cho bệnh nhân suy gan, xơ gan giai đoạn cuối đang chiếm khoảng 3,5% tỷ lệ tử vong toàn cầu.

3. Đơn vị vận hành ngân hàng tế bào gốc và mô dây rốn: Ứng dụng quy trình bảo quản tế bào ở -196°C và đánh giá chất lượng tế bào gốc qua hệ thống marker CD73, CD90, CD105 nhằm chuẩn hóa tiêu chuẩn lưu trữ mẫu cuống rốn đạt chuẩn quốc tế.

4. Các công ty dược phẩm và công nghệ y tế tái tạo: Sử dụng nguồn tế bào gốc và dòng tế bào gan cảm ứng có kiểm soát HNF - 4α để xây dựng mô hình sàng lọc độc tính thuốc, giảm thiểu 50% chi phí thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao tế bào gốc cuống rốn (hWJSCs) lại được ưu tiên hơn tế bào gốc phôi và tế bào gốc tủy xương?
Tế bào gốc cuống rốn được thu nhận từ mô dây rốn sau sinh vốn là sinh phẩm y tế bị thải bỏ, giúp loại bỏ 100% các rào cản về mặt đạo đức sinh học so với tế bào gốc phôi. Đồng thời, nguồn mẫu này có năng lực tăng sinh cao hơn và quy trình thu nhận không gây đau đớn hay xâm lấn như tủy xương, mang lại mật độ tế bào đạt từ 10 đến 15 vạn tế bào trên 1 cm dây rốn.

Tại sao gen HNF - 4α lại đóng vai trò quyết định trong quá trình tạo tế bào gan?
HNF - 4α là yếu tố phiên mã chủ chốt kiểm soát hơn 100 gen chức năng của gan như Albumin và men chuyển hóa. Các nghiên cứu thực nghiệm chứng minh rằng việc kích hoạt hoặc biểu hiện gen HNF - 4α có kích thước 1339 bp giúp tế bào gốc trung mô chuyển đổi kiểu hình, kích thích tế bào hình sao hoặc tế bào trung mô tái tạo chức năng nhu mô gan ổn định.

Phương pháp phân lập bằng nuôi cấy mảnh mô nhỏ có ưu điểm gì so với phân hủy enzyme?
Mặc dù phương pháp mảnh mô mất khoảng 20 ngày để tế bào bắt đầu mọc, nhưng bảo vệ tế bào khỏi sự phá hủy cấu trúc protein màng do enzyme trypsin gây ra. Phương pháp này tạo ra quần thể tế bào có độ đồng nhất cao dạng nguyên bào sợi và duy trì khả năng tăng sinh bền bỉ lên đến 80 ngày so với chỉ 30 ngày ở phương pháp enzyme.

Làm thế nào để xác nhận độ an toàn di truyền của tế bào gốc sau nhiều lần cấy chuyển?
Nghiên cứu áp dụng phương pháp kiểm tra khả năng ức chế tiếp xúc bề mặt khi tế bào ngừng phân chia ở mật độ 80%, kết hợp nhuộm băng Giemsa quan sát bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n dưới kính hiển vi quang học. Tế bào gốc lành tính duy trì tính ổn định bộ gen từ lần cấy chuyển thứ 3 đến thứ 10 mà không xuất hiện các dị bội hay biến dị ác tính.

Ý nghĩa thực tiễn của việc tinh sạch đoạn gen HNF - 4α với độ tương đồng 100% là gì?
Đoạn gen CDS hoàn chỉnh 1339 bp sau khi được khuếch đại bằng mồi PacI/NsiI và tinh sạch qua cột lọc GeneJET đạt độ tinh sạch cao và tương thích tuyệt đối với GenBank. Đây là nguyên liệu chuẩn xác để gắn vào vector chuyển gen nhằm tiến hành các thử nghiệm biệt hóa tế bào gốc chủ động trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

Kết luận

• Đề tài đã phân lập và duy trì thành công dòng tế bào gốc trung mô cuống rốn (hWJSCs) đạt độ thuần khiết cao với các marker dương tính CD73, CD90, CD105 và âm tính với CD34, CD86.
• Xác định được động học tăng sinh tối ưu ở thế hệ P3 - P4 và xây dựng quy trình đông lạnh tại -196°C với tỷ lệ sống sót sau giải đông đạt trên 88%.
• Chứng minh gen HNF - 4α ban đầu âm tính ở tế bào gốc trung mô và được kích hoạt biểu hiện thành công sau 4 tuần xử lý với tác nhân cảm ứng DMSO.
• Nhân dòng và tinh sạch thành công trình tự mã hóa CDS gen HNF - 4α kích thước 1339 bp với độ chính xác 100% theo chuẩn GenBank.
• Đóng góp nguồn vật liệu di truyền và quy trình chuẩn phục vụ định hướng tạo tế bào gan chức năng cho nghiên cứu y sinh học tại Việt Nam.

Lộ trình nghiên cứu tiếp theo trong giai đoạn 2026 - 2028 sẽ tập trung gắn gen vào hệ vector virus và thử nghiệm cấy ghép tiền lâm sàng. Các nhà khoa học, bác sĩ và đơn vị nghiên cứu quan tâm hãy kết nối với Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật hoặc Phòng Công nghệ phôi để cùng hợp tác triển khai các giải pháp điều trị tế bào gan tiên tiến.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHÙNG MINH TUẤN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN HNF - 4α TRONG TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN NGƯỜI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc TS. Nguyễn Văn Hạnh – Quyền trưởng phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS.Nguyễn Hữu Đức – Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã luôn theo sát, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Đỗ Trung Kiên, em Nguyễn Thị Nga và các anh chị cán bộ phòng Công nghệ phôi, viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ đề tài: “Nghiên cứu biệt hóa tế bào chức năng gan từ tế bào gốc người và chuột”, Mã số: VAST.03/16-17, đề tài trọng điểm cấp viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Phùng Minh Tuấn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.

II DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. V DANH MỤC HÌNH ẢNH. VI DANH MỤC BẢNG BIỂU. VII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .VIII THESIS ABSTRACT.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TẾ BÀO GỐC.

Định nghĩa tế bào gốc. Phân loại, đặc tính của tế bào gốc. Ứng dụng của tế bào gốc. TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN.

Cấu tạo, chức năng của dây rốn. Tế bào gốc dây rốn. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi hWJSCs. NGHIÊN CỨU VỀ BIỆT HÓA HWJSCS.

Đặc điểm gen HNF - 4α. Nghiên cứu về biểu hiện gen HNF - 4α trong quá trình biệt hóa tế bào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

NGUYÊN VẬT LIỆU. 22 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Mẫu xét nghiệm. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thu nhận và xử lí dây cuống rốn. Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn. Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT – PCR).

Điện di trên gel agarose. Phân lập gen HNF - 4α. Phương pháp tách gel sử dụng kit Gene Jet gel extraction kit. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

PHÂN LẬP VÀ NHÂN NUÔI TẾ BÀO. Phân lập tế bào. Cấy chuyển tế bào. Đông lạnh tế bào.

ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN. Đánh giá tính ổn định di truyền của TBGTM. Tách chiết RNA tổng số. Định lượng RNA tổng số.

Đánh giá đặc tính TBGTM và biểu hiện gen HNF – 4a trước khi biệt hóa. Đánh giá biểu hiện gen HNF - 4α sau khi xử lý biệt hóa. PHÂN LẬP GEN HNF - 4Α. Khuếch đại trình tự mã hóa của gen HNF - 4α.

Tinh sạch đoạn DNA sau khi khuếch đại. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 53 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HNF - 4α Human hepatocyte nuclear factor - 4 MSC Mesenchymal Stem Cell iPS cell Induced pluripotent stem cell ES Embryonic stem cells EG Embryonic germ cells DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complement deoxyribonucleic acid Bp Base pair Kb Kilo base bFGF Basic fibroblast growth factor CHT Collagenase / hyaluronidase trypsin CT Collagenase/ trypsin DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum HSC Hemapoietic stem cell hWJSCs (human umbilical cord Wharton’s jelly Stem Cell) Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người ICM Inner cell mass IVF In vitro fertilization ITS Insulin – transferin – selenium ICSI Intracytop plasmide sperm injecti TBGTM Tế bào gốc trung mô RT – PCR Reverse-transcription Polymerase chain reaction TBG Tế bào gốc WJ Wharton’s jelly E.coli Escherichia coli Taq Thermus aquaticus UV Ultra violet (tia cực tím) CDS Coding sequence (trình tự mã hóa) TAE Tris-axit axetic-EDTA v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2. Chức năng của tế bào gốc.

Cấy ghép tế bào gốc tự thân (bên trái), cấy ghép đồng loại (bên phải). Sử dụng iPS cell trong thử nghiệm thuốc. Cấu tạo của dây rốn. Mẫu dây rốn trước khi xử lý.

Sử dụng dao và panh để chọn lọc phần mô cần sử dụng. Mẫu dây rốn trước khi xử lý. Tủ nuôi cấy tế bào 37oC, 5% CO2. Quy trình tách RNA tổng số bằng kit RNeasy Mini Kit (QUIAGEN).

Nguyên lý RT-PCR. Tế bào bắt đầu mọc ra từ rìa mảnh mô. Tế bào trước khi cấy chuyển (trái) và ở lần cấy chuyển thứ 4 (phải). Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau.

Tế bào mọc kín đĩa nuôi. Tế bào sau khi được ủ với trypsin 0. Tế bào soi trên kính hiển vi sau khi nhuộm Trypan Blue. Nhiễm sắc thể (NST) ở lần cấy chuyển thứ 2.

Điện di đồ tách chiết RNA tổng số. Điện di đồ RT – PCR mẫu TBGTM sau phân lập. Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau xử lý biệt hóa. Điện di đồ PCR khuếch đại CDS của gen HNF - 4α.

Kết quả kiểm tra đối chiếu trình tự gen từ genbank. 52 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3. Trang thiết bị và dụng cụ. Hóa chất thí nghiệm.

Thành phần phản ứng PCR. Trình tự các cặp mồi sử dụng đánh giá chỉ thị TBGTM. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại CDS gen HNF - 4α. Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết.

Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng. Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc. Trình tự được đọc bằng mồi vector (PacI–HNF-4α và PacI–HNF-4α). 51 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể.

Khả năng biệt hóa cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên hóa. TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) (Phan Kim Ngọc, 2009). Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan và ung thư gan (Cai et al, 2007; Cantz et al, 2008). Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa từ TBG cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn.

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng biểu hiện HNF - 4α trong tế bào gốc cuống rốn người” để phục vụ cho các nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan theo định hướng vừa là yếu tố chỉ thị biệt hóa vừa là tác nhân gây biệt hóa. Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau: Phương pháp phân lập tế bào (Được áp dụng theo A. Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu được kết quả: nghiên cứu đã phân lập được tế bào gốc cuống rốn có đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: dương tính CD90, CD73, CD105, âm tính với các chỉ thị đặc trưng cho tế bào gan là: ALB, HNF - 4α, G6P. Kết quả nghiên cứu cho thấy biểu hiện của gen HNF - 4α âm tính ở tế bào gốc cuống rốn trước xử lý biệt hóa.

Sau xử lý biệt hóa với DMSO, chỉ thị gen HNF - 4α đã biểu hiện sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiên cứu đã phân lập thành công gen HNF - 4α với mức độ tương thích 100% với trình tự gen được kiểm tra trên genbank. viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] THESIS ABSTRACT Stem cells are the potential cells in the body. The cell's ability to differentiate into other specialized cell types.

The umbilical cord stem cells are capable of having all characteristics of pluripotent stem cells such as bone marrow stem cells (Phan Kim Ngoc, 2009). Recently a series of studies have demonstrated to differentiate the umbilical cord stem cells into liver cells, giving hope for the hundreds of millions of patients with hepatitis and liver cancer (Cai et al., 2007; Cantz et al. However, the exact mechanism of the differentiation from umbilical cord blood stem cells into hepatocytes still need to be clarified. We conducted a study on the topic of "Evaluating the ability of expression HNF - 4α in the umbilical cord stem cells" to serve the study of differentiation from the umbilical cord stem cells into hepatocytes oriented as both an indicator and differentiation.

In this thesis, we have used the following research methods: Cellular isolation (Applied by A.