MỞ ĐẦU Trong vài thập kỷ qua, chất ức chế tyrosinase là mối quan tâm của các nhà khoa học, vì tác động của tyrosinase trong việc hình thành sắc tố nâu melanin ở động vật có vú và phản ứng hóa nâu enzyme trong trái cây. Melanin đƣợc hình thành bởi sự kết hợp các phản ứng hóa học và enzyme xúc tác. Giai đoạn đầu tiên của quá trình hình thành melanin là sự oxy hóa tyrosine để tạo thành dopaquinol dƣới sự xúc tác của tyrosinase. Đây là giai đoạn giới hạn tốc độ trong quá trình tổng hợp melanin bởi vì các phản ứng tiếp theo có thể xảy ra một cách tự động tại một giá trị pH thích hợp.
Sau đó, dopaquinol đƣợc biến đổi thành dopachrome thông qua quá trình oxy hóa tự động. Dopa cũng là một cơ chất của tyrosinase và đƣợc oxy hóa thành dopaquinol nhờ xúc tác của enzyme một lần nữa. Cuối cùng, eumelanin đƣợc hình thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ dihydroxyindole (DHI) và axit dihydroxyindole-2-cacboxylic (DHICA), đó là các sản phẩm phản ứng từ dopachrome. Dƣới tác dụng của cysteine hoặc glutathione, dopaquinone đƣợc chuyển đổi thành cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa.
Tiếp đó, pheomelanin đƣợc hình thành. Ngoài eumelanin và pheomelanin, thì melanin còn đƣợc hình thành bởi các monome phenolic khác nhau từ tyrosine đƣợc gọi là allomelanin. Hiện tƣợng màu nâu ở trái cây cũng liên quan đến sự trùng hợp oxy hóa, tƣơng tự nhƣ quá trình hình thành melanin. Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ da con ngƣời tránh những tác hại của tia cực tím từ mặt trời.
Mặc dù melanin có chức năng chủ yếu là bảo vệ lớp da của con ngƣời, nhƣng sự tích tụ bất thƣờng của melanin ở các bộ phận khác nhau trên da, dẫn đến tăng sắc tố sạm trên da, và trở thành vấn đề về thẩm mỹ của làn da. Ngoài ra, sự nâu hóa ở rau quả sau khi thu hoạch là một hiện tƣợng phổ biến, làm giảm giá trị thƣơng mại của các sản phẩm. Do đó, việc nghiên cứu các chất có nguồn gốc sinh học kìm hãm tyrosinase có ý nghĩa tạo sản phẩm mỹ phẩm và chế phẩm chống biến màu nông sản, thực phẩm. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 2 Trƣớc thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu nhận, xác định đặc tính và khả năng ứng dụng chất kìm hãm tyrosinase”.
Mục tiêu của đề tài: - Thu nhận chất kìm hãm tyrosinase. - Xác định đặc tính của chất kìm hãm tyrosinase. Nội dung nghiên cứu: - Lựa chọn nguồn nguyên liệu thu nhận chất kìm hãm tyrosinase. - Tối ƣu điều kiện tạo chất kìm hãm tyrosinase.
- Tách và làm sạch chất kìm hãm tyrosinase. - Xác định đặc tính của chất kìm hãm tyrosinase. - Thăm dò khả năng ứng dụng của chất kìm hãm tyrosinse trong công nghệ thực phẩm/ mỹ phẩm. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 3 PHẦN I.
TYROSINASE Tyrosinase ( EC 1.1) là một polyphenol oxidase có chứa nguyên tử đồng +2 (Cu ) trong phân tử. Enzym này xúc tác oxy hóa chất phenol thành quinon khi có mặt phân tử oxy. Enzym này phân bố khá phổ biến trong tự nhiên và nó liên quan chủ yếu đến quá trình hình thành sắc tố nhƣ melanin và một số hợp chất polyphenol [32]. Cu to Tyrosinase ở các loài khác nhau thì có đặc điểm cấu trúc khác nhau.
Các enzyme này từ mô thực vật động vật , và nấm thƣờng khác nhau ở cấu trúc bậc một, kích thƣớc [7]. Tuy nhiên , tất cả các tyrosinase đều có hai ion đồng loại III trong trung tâm hoạt động. Vùng chứa ion đồng này gọi là ion Cu A và CuB và mỗi ion này đƣợc bao phủ bởi ba histidine (Hình 1. Cấu tạo trung tâm hoạt động của tyrosinase (Màu xanh dương: Histidine (His); Màu xanh lá cây: Nguyên tử Cu; Màu đỏ: Bề mặt ngoài của tyrosinase).
Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 4 CuA: Trung tâm CuA có chứa hai hạt nhân, hai nguyên tử Cu đƣợc nối với nhau bởi hai nguyên tử S từ hai cystein. Mỗi nguyên tử Cu còn nối với nguyên tử N tử His. Chức năng của trung tâm CuA là ở trong chuỗi vận chuyển electron và có thể tìm thấy trung tâm này trong cytochrome oxidase và nitrous oxide reductase. Nó có phổ cộng hƣởng điện từ rất điển hình và có màu tía.
Ở dạng oxi hóa, mỗi nguyên tử Cu đều ở trạng thái hóa trị hỗn hợp Cu(1. CuB: Trung tâm Cu B rất giống với nhóm ngoại Hem ch ứa Fe trong trung tâm phản ứng của cytocrom xúc tác phản ứng khử oxi thành nƣớc. Năng lƣợng giải phóng ra đƣợc sử dụng để chuyển proton qua màng nơi gắn cytochrome. Trung tâm này đƣợc đặt xuyên qua trục của His trong tâm nhóm ngoại Hem a3 và liên kết với ba histidine dƣới dạng hình chóp tam giác với vị trí liên kết mở của nhóm Cu hƣớng tới vị trí liên kết mở của nguyên tử Fe trong nhóm Hem [48].
Mỗi nguyên tử Cu bao quanh bởi 3 histidine ứng với 3 trạng thái (hình 1.1) [12]: Deoxy Tyrosinase – Ered( Edeoxy) (với trung tâm hoạt động Cu 1+- Cu1+) với khoảng cách giữa 2 nguyên t ử Cu là 4. Đây là vị trí mà khi tƣơng tác với phân tử oxy sẽ tạo hắc tố hemocyanin. Phản ứng tạo Hemocyanin từ Deoxy Tyrosinase Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 5 Met Tyrosinase – E met (với trung tâm hoạt động của Cu2+ - OH- - Cu2+) khoảng cách giữ Cu-Cu là 2. Oxy Tyrosinase – Eoxy (với trung tâm hoạt động là Cu2+ - O2- - Cu 2+) khoảng cách giữa Cu-Cu là 3.
Ngoài ra còn có dạng Half- met tyrosinase (trung tâm hoạt động là Cu2+- Cu1+). Trƣờng hợp này ít xuất hiện trong cấu trúc tyrosinase. Ngƣời ta xác định đƣợc rằng trong enzym tinh khiết tồn tại hỗn hợp: Emet > 85% và Eoxy< 15%. Thực tế, các hợp chất monophenol chỉ phản ứng với oxytyrosinase, trong khi các hợp chất diphenol còn phản ứng với Met Tyrosinase.
Nhƣng khi có mặt của chất khử trong môi trƣờng phản ứng, kết quả tạo ra là deoxytyrosinase, chất liên kết trực tiếp với 2 nguyên tử oxy. Tuy nhiên sự tồn tại dạng trạng thái trên còn phụ thuộc vào nguồn thu tyrosinase [36]. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 6 Hình 1. Chu trình tyrosinase giữa các trạng thái của đồng 1.
Tyrosinase có cả hoạt tính cresolase và catecholoxidase. Khi có mặt oxy, tyrosinase xúc tác phản ứng hydroxyl hóa monophenol (L- tyrosine) tạo o-diphenol (L-DOPA (L-3,4-dihyroxyphenylalanine)) (phản ứng thể hiện hoạt tính cresolase): Tyrosinase O2 L-Tyrosine L-DOPA Tyrosinase cũng xúc tác phản ứng oxy hóa o-diphenol tạo o-quinone (phản ứng thể hiện hoạt tính catecholoxidase): Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 7 Tyrosinase O2 L-DOPA Dopaquinone Đa số các nhà nghiên cứu cho rằng cơ sở tác dụng của tyrosinase là sự oxy hóa thuận nghịch nguyên tử đồng hóa trị một ( Cu+) thành đồng hóa trị hai (Cu2+ ). (Ar: Argon) Trung tâm hoạt động chứa hai ion đồng xúc tác phản ứng oxy hóa catechol bằng cách khử 4 electron của phân tử O2 thành hai phân tử H2O: 4Cu+ + 4H+ + O 2 4Cu2+ + 2H2O Catechol không liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động, mà phản ứng với phân tử O2 tạo thành 2 nguyên tử Oxy liên kết với 2 ion đồng ở trung tâm hoạt động [40]: 4Cu2+ + 2 catechol 4Cu + + 2 o-quinon + 2H2O Cũng có ý kiến cho rằng ion đồng liên kết bền vững với protein của enzyme và không thay đổi hóa trị phản ứng (hình 1. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 8 Hình 1.
Phản ứng oxy hóa pirocatechol dƣới tác dụng của catecholase 1. Tính chất Tyrosinase thu từ các nguồn khác nhau thì có tính chất khác nhau. Tyrosinase từ vi sinh vật Tính chất của tyrosinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermomicrobium roseum - pI =4.5, enzym mất 50% hoạt tính khi 7.5 - Nhiệt độ tối ƣu = 70oC, bền ở nhiệt độ dƣới 75oC , trên 90oC enzym mất hoạt tính hoàn toàn. - Cơ chất đặc hiệu là catechol, axit chlorogenic dihyroxyphenylalanine (L- DOPA) và progallol.
Tính chất của tyrosinase sinh tổng hợp bởi Streptomyces sp [29] - pH tối ƣu =7.0, enzym bền ở pH =7. - Nhiệt độ tối ƣu =35oC, enzym bền ở nhiệt độ dƣới 55oC. - Cơ chất đặc hiệu là L- DOPA. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 9 Tyrosinase từ động vật Tyrosinase từ Illex argentius (sinh vật thân mềm) [21] - M=140.0 , hoạt tính còn trên 90% ở dải pH= 6.
- Nhiệt độ ổn định hoạt tính ở 4-40 oC , trên 45oC enzym mất hoạt tính. - Cơ chất tối ƣu là L- DOPA. Tyrosinase từ con mực xà (Symplectoteuthis Oualaniensis) [2] - pH tối ƣu = 6. - Nhiệt độ ổn định hoạt tính < 40oC, trên 50oC hoạt tính enzyme bị giảm mạnh.
Ở nhiệt độ 80 oC hoạt tính còn 30%, ở 100oC thì hoạt tính mất hoàn toàn Tyrosinase từ thực vật Tyrosinase từ nấm mỡ Agaricus bisporus [38] - pH tối ƣu 7. Tyrosinase từ cây thuốc lá Nicotiana tabacum [24] - pH tối ƣu 7. Hà Ngọc Linh Luận văn thạc sĩ khoa học 10 - Km = 6. - Cơ chất là catechol ở pH =6.5 trong đệm H 3PO4 - NaOH 0,05M.
Cht kìm hãm tyrosinase Chất kìm hãm tyrosinase có tác d ụng ức chế sự hình thành melanin, ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc, mỹ phẩm cũng nhƣ nông nghiệp [27]. Tác nhân chống lại sự hình thành mầu nâu có thể hoạt động ở các mức độ khác nhau trong con đƣờng hình thành h ắc tố - kìm hãm trực tiếp hoạt động của polyphenol oxidase (PPO) là hiệu quả nhất. Ức chế hoạt động của PPO có thể đƣợc thực hiện bằng cách giảm các tác nhân gây ra phản ứng tạo các tiền sắc tố, ví dụ để giảm pH của axit citric xuống giá trị thấp hơn pH tối thiểu đòi hỏi hoạt động của catalytic, chất tạo phức - mà có thể liên kết với các nguyên tử đồng trong trung tâm hoạt động hoặc làm giảm sự có mặt của các nguyên tử đồng trong tổ chức của haloenzyme, hoặc là chất kìm hãm PPO đặc trƣng, ví dụ nhƣ hoạt động trên vị trí liên kết của cơ chất. Tyrosinase (TYR) là PPO đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất, một số chất ức chất thu đƣợc từ cả nguồn tự nhiên và tổng hợp có khả năng kìm hãm monophenolase, hay diphenolase, hoặc có khả năng kìm hãm cả hai loại.
Giá trị IC50 đƣợc công bố ở một số tài liệu phụ thuộc điều kiện thí nghiệm đƣợc áp dụng [14]. Nghiên cứu về chất ức chế tyrosinase chuyên sâu nhất là axit kojic, một loại chất chuyển hóa ở nấm mốc hiện tại đƣợc ứng dụng nhƣ một thành phần của mỹ phẩm làm trắng da và chất phụ gia thực phẩm để kháng lại hoạt động enzyme gây màu nâu [10].