MỞ ĐẦU Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Các kỹ thuật mới nhƣ tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thƣ. Sự phát hiện ung thƣ là một bệnh di truyền đƣợc coi là một thắng lợi của sinh y học hiện đại. Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã giúp xác định chi tiết các biến đổi di truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thƣ, bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự tăng sinh và lan rộng của chúng.
Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ có xu hƣớng gia tăng ở phần lớn các nƣớc trên thế giới. Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu ngƣời đang sống chung với bệnh ung thƣ. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trƣờng hợp mới mắc ung thƣ. Các ung thƣ hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thƣ phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thƣ vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi.
Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu ngƣời chết do ung thƣ. Tỷ lệ chết do ung thƣ chiếm 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở ngƣời [28]. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 ngƣời và khoảng 75.000 ngƣời chết vì bệnh ung thƣ [47]. Trong số các bệnh ung thƣ thƣờng gặp ở ngƣời, ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ tƣơng đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trƣờng hợp ung thƣ và chiếm tới 15,2% tổng số các trƣờng hợp tử vong vì ung thƣ.
Loại ung thƣ này thƣờng gặp nhiều hơn ở các nƣớc phát triển và có xu hƣớng tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Nguy cơ ung thƣ đại trực tràng tăng cao hơn ở những Lê Thị Lan Anh 1 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 ngƣời có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có ngƣời bị ung thƣ đại trực tràng [3]. Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn đƣợc gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng. Đây là hội chứng di truyền trội do gen trên nhiễm sắc thể thƣờng gây ra.
Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định đƣợc ở các gen MMR [2, 5]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 đƣợc thực hiện ở rất nhiều quần thể ngƣời khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thƣ nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện.
Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thƣ đại trực tràng có khuynh hƣớng di truyền, nhằm đƣa ra những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hƣớng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thƣ ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. Lê Thị Lan Anh 2 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Di truyền ung thƣ 1. Khái niệm ung thư Ung thƣ không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trƣởng không kiểm soát đƣợc, có đƣợc sự bất tử, xâm lấn và khả năng di căn. Thuật ngữ “ung thƣ” theo nghĩa hẹp đƣợc dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thƣờng [17].
Khối u là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau và có khả năng phân chia một cách không kiểm soát. Sự phân biệt giữa các khối u lành và u ác tính đơn thuần dựa trên khả năng xâm lấn của chúng. Nếu một khối u ác tính sau khi xâm lấn tiếp cận đƣợc với mạch máu hoặc mạch bạch huyết, thì tế bào của nó có thể di căn và phát triển tại các mô ở xa tại nơi chúng di chuyển tới. U di căn có thể gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong.
Quá trình tăng trƣởng của một khối u bắt đầu từ tế bào bị biến đổi di truyền bất thƣờng này đƣợc gọi là quá trình hay sự phát sinh ung thư. Vì các khối u thƣờng bắt nguồn từ những khối u nhỏ lành tính, rồi sau đó chuyển sang trạng thái ác tính và di căn, nên trong quá trình phát sinh ung thƣ, những tế bào hình thành khối u có xu hƣớng tích lũy các biến đổi di truyền và qua đó có những đặc tính mới. Sự tích lũy các gen ung thƣ ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung thƣ [17]. Gen ung thư và gen ức chế khối u Gen ung thƣ (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thƣ hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thƣ.
Các gen ung thƣ cũng có thể đƣợc coi nhƣ các dạng alen đặc biệt của các gen bình thƣờng xuất hiện do kết quả của đột biến [3]. Các cá thể đƣợc truyền các gen ung thƣ phát sinh từ các tế bào mầm sinh Lê Thị Lan Anh 3 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 dục (còn gọi là các gen ung thư bẩm sinh) từ bố, mẹ sẽ mang gen ung thƣ này trong hầu hết các tế bào của cơ thể, ở cả các tế bào sinh dƣỡng và các tế bào sinh dục (những cá thể này đƣợc gọi là các thể mang). Ngƣợc lại, các gen ung thƣ phát sinh từ các tế bào sôma sẽ không đƣợc truyền cho các thế hệ sau [17]. Các khối u tích lũy dần các gen ung thƣ khi chúng tăng trƣởng.
Sự tích lũy các gen đột biến gây ung thƣ có thể diễn ra theo ba con đƣờng: 1) Đƣợc truyền qua dòng sinh dục, 2) Do đột biến tự phát trong tế bào sôma và 3) Do sự lây nhiễm của virut. Các gen ung thƣ quan trọng có thể đƣợc nhóm lại theo chức năng bình thƣờng của chúng trong một tế bào. Các tiền gen ung thƣ (Proto-oncogenes) là các gen có vai trò quan trọng, ví dụ điều hòa sự sinh trƣởng tế bào, sinh sản và biệt hóa tế bào. Các gen tiền ung thƣ có thể đƣợc kích hoạt và trở thành gen ung thƣ thông qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn.
Các gen ung thƣ đƣợc di truyền trội, vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung thƣ hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thƣ. Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thƣơng ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trƣởng. Knudson quan sát thấy rằng các gen ức chế khối u là các gen lặn, cần phải có “cú đánh thứ hai” (cả hai alen trở thành bất hoạt) cho sự phát triển của bệnh ung thƣ. Sự ức chế khối u đã đƣợc mô tả trong một số hình thức di truyền của bệnh ung thƣ, “đòn thứ nhất” đƣợc di truyền và “đòn thứ hai” xảy ra ở tế bào soma [28].
Hơn nữa, các gen ức chế khối u có thể đƣợc chia thành gen gác cổng (Gatekeeper), gen trông giữ (Caretaker) và gen làm cảnh (Lanscaper). Gen gác cổng trực tiếp ức chế sự phát triển hoặc thúc đẩy tế bào chết, ví dụ gen APC khi bị đột biến sinh u tuyến polyp theo dòng họ (FAP). Ngƣợc lại, các gen trông giữ, không trực tiếp thúc đẩy sự phát triển khối u, nhƣng sự bất hoạt của chúng dẫn đến sự mất ổn định di truyền là nguyên nhân gia tăng tỷ lệ đột biến trong cả gen ung thƣ và gen ức chế khối u, góp phần cho sự tạo thành các khối u. Một ví dụ về gen trông giữ là Lê Thị Lan Anh 4 Cao học K18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) mở đƣờng cho hội chứng Lynch.
Gen “làm cảnh”, nhƣ tên của nó, gián tiếp gây ra ung thƣ bằng cách thay đổi cảnh quan, có nghĩa là vi môi trƣờng, tạo thuận lợi đối với sự hình thành khối u. Hiện tƣợng này đã đƣợc quan sát thấy trong ung thƣ ruột kết, nơi các môi trƣờng mô đệm bất thƣờng ảnh hƣởng đến sự phát triển và tăng trƣởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến sự hình thành ung thƣ (Hình 1). Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3] 1. Hội chứng ung thƣ ruột kết Ung thƣ ruột kết hay còn gọi là ung thƣ đại trực tràng là một loại ung thƣ biểu mô rất thƣờng gặp.
Đây là một trong những bệnh ung thƣ biểu mô phổ biến nhất trên thế giới, là ung thƣ gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ và đang có xu hƣớng tăng lên ở các nƣớc đang phát triển [8, 19]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thƣ đại trực tràng chỉ sau ung thƣ dạ dày.