Tổng quan luận án

Công nghiệp chế biến thủy sản đóng vai trò là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam, với mục tiêu đạt kim ngạch xuất khẩu 10 tỷ USD vào năm 2020. Cùng với định hướng này, việc tăng cường khai thác và bảo quản nguồn lợi thủy sản đánh bắt xa bờ vừa mang ý nghĩa phát triển kinh tế biển vừa góp phần khẳng định chủ quyền biển đảo. Tuy nhiên, hoạt động bảo quản các loại hải sản sau thu hoạch như tôm, cá, mực hiện nay còn gặp nhiều trở ngại. Theo các quy định về phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP), nguyên liệu thủy sản cần được bảo quản bằng phương pháp ướp đá để duy trì nhiệt độ ở mức bằng hoặc dưới 4°C. Trong thực tế khai thác, do điều kiện trang thiết bị bảo quản của ngư dân còn thiếu thốn, tình trạng lạm dụng hóa chất độc hại như hàn the, urê hoặc các loại thuốc kháng sinh diễn ra tương đối phổ biến. Điều này dẫn đến sự tồn dư hóa chất trong sản phẩm, gây ảnh hưởng tiêu cực đến vệ sinh an toàn thực phẩm.

Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các tác nhân sinh học có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và có khả năng ức chế vi sinh vật gây hư hỏng nhằm kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản là một yêu cầu cấp thiết. Oligochitosan là một oligosaccharide có nguồn gốc từ vỏ tôm, sở hữu hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên và có độ hòa tan tốt trong nước. Đề tài luận án tiến sĩ "Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch" của nghiên cứu sinh Vũ Thị Hoan, chuyên ngành Công nghệ chế biến thủy sản (mã số: 9540105) tại Trường Đại học Nha Trang, được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước mã số KC07.02/11-15 nhằm giải quyết khoảng trống công nghệ này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

  1. Mục tiêu chung: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này.
    • Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng dung dịch NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn.
    • Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:

  • Đối tượng nghiên cứu: Phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei), tôm bạc biển (Metapenaeus ensis) tươi sau thu hoạch; chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum VTCC-B 431; các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes); động vật thí nghiệm (chuột lang).
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trung tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Nha Trang; Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh; Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường; cùng cơ sở chiếu xạ nguồn Coban-60.
  • Phạm vi thời gian: Luận án được thực hiện trong giai đoạn triển khai Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15 và hoàn thành bảo vệ vào năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về cấu trúc, tính chất và các phương pháp sản xuất chitin, chitosan cũng như các kỹ thuật cắt mạch tạo oligochitosan:

Về sản xuất chitin và chitosan: Chitin được phát hiện đầu tiên vào năm 1811 từ nấm, và thuật ngữ chitosan được Hoppe Seiler đặt ra vào năm 1894. Trong phế liệu giáp xác, chitin chiếm 15% - 40%, liên kết chặt chẽ với protein (20% - 40%) và canxi cacbonat (20% - 50%). Quy trình hóa học truyền thống thường sử dụng dung dịch kiềm loãng (NaOH 1% - 10%) ở nhiệt độ cao (lên đến 100°C) để khử protein và dung dịch acid vô cơ (HCl 0,5N - 2N) để khử khoáng (theo tổng kết từ các công bố của tác giả nước ngoài và tài liệu kỹ thuật). Quá trình deacetyl hóa chitin tạo chitosan thường đòi hỏi kiềm đậm đặc (NaOH 40% - 50%) ở nhiệt độ trên 100°C. Các tác giả nhận định quy trình này tiêu tốn nhiều năng lượng, thải ra lượng lớn hóa chất gây ô nhiễm môi trường và dễ làm đứt gãy mạch polyme không kiểm soát.

Về hướng tiếp cận sinh học trong sản xuất chitin: Để giảm thiểu hóa chất, các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm enzyme protease (như alcalase, papain, chymotrypsin, bromelain) hoặc vi khuẩn sinh protease. Shimahara K. (1988) đã sử dụng protease từ vi khuẩn Pseudomonas maltophilia khử protein vỏ giáp xác còn khoảng 1%. Wang S. và cộng sự sử dụng protease từ Bacillus sp. khử 63% - 73% protein mai mực. Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Thị Luyến và cộng sự đã bước đầu ứng dụng các enzyme protease như papain, alcalase, protamex, flavourzyme trong chế biến phụ phẩm thủy sản. Ngoài ra, việc lên men vi khuẩn lactic đã được Rao M. và cộng sự (2000) cùng nhiều tác giả khác chứng minh có khả năng khử đồng thời protein và khoáng chất nhờ tác dụng phối hợp của acid lactic sinh ra và enzyme protease ngoại bào. Tuy nhiên, phương pháp lên men lactic đơn thuần thường để lại hàm lượng protein dư thừa tương đối cao, chưa đạt chuẩn chitin tinh sạch (< 1% protein).

Về các phương pháp sản xuất oligochitosan: Các nghiên cứu trước đây phân chia thành ba nhóm phương pháp:

  • Phương pháp hóa học: Thủy phân bằng acid đặc (HCl, HF, HNO2, H3PO4) hoặc chất oxy hóa (H2O2, O3). Trần Thị Luyến và cộng sự (2012) đã thủy phân chitosan bằng HCl 10M với hiệu suất đạt 70%. Nhược điểm của phương pháp hóa học là tạo ra nhiều tạp chất, biến đổi nhóm chức và đòi hỏi quá trình tinh sạch, trung hòa tốn dung môi.
  • Phương pháp sinh học: Sử dụng các enzyme như chitosanase, chitinase, cellulase, hemicellulase. Nghiên cứu của Bùi Văn Hoài và cộng sự (2017) đã dùng cellulase để tạo chitooligosaccharide (COS) có phân tử lượng dưới 10 kDa. Mặc dù phản ứng diễn ra trong điều kiện ôn hòa, chi phí enzyme cao là rào cản lớn đối với sản xuất quy mô lớn.
  • Phương pháp vật lý: Sử dụng vi sóng kết hợp chất oxy hóa hoặc kỹ thuật chiếu xạ bức xạ gamma Coban-60. Các công trình của Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự (2000) đã chứng minh khả năng cắt mạch chitosan trong dung dịch bằng tia gamma.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết: Luận án tập trung xây dựng một giải pháp kỹ thuật tích hợp gồm: (1) Kết hợp quá trình lên men lactic bằng Lactobacillus plantarum VTCC-B 431 với việc xử lý bổ sung bằng enzyme flavourzyme để loại bỏ triệt để protein khỏi đầu vỏ tôm mà không cần dùng kiềm nóng; (2) Tiến hành phản ứng deacetyl hóa ở nhiệt độ phòng với nồng độ kiềm cao nhằm thu được chitosan có độ deacetyl trên 90% nhưng vẫn bảo tồn được mạch polyme; (3) Cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn (dạng vẩy) bằng bức xạ gamma Coban-60 ở liều thích hợp để thu nhận trực tiếp oligochitosan tan trong nước mà không cần các công đoạn kết tủa phân đoạn phức tạp; (4) Khảo sát toàn diện tính an toàn độc học in vivo của sản phẩm chiếu xạ và xác lập quy trình ứng dụng bảo quản tôm bạc biển sau thu hoạch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Lý thuyết về chitin và chitosan: Chitin là một homopolyme của các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine liên kết β-(1→4). Khi tách nhóm acetyl (deacetyl hóa), chitin chuyển thành chitosan, một copolyme chứa các đơn vị D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine. Độ deacetyl (DD) quyết định mật độ nhóm amin tự do (-NH2), khả năng tích điện dương trong môi trường acid và hoạt tính sinh học.
  • Lý thuyết về oligochitosan: Là sản phẩm phân cắt mạch chitosan có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10.000 Dalton, độ depolyme thấp và tan hoàn toàn trong nước ở pH trung tính. Nhóm amin và hydroxyl linh động giúp oligochitosan có khả năng chống oxy hóa và kháng vi sinh vật mạnh.
  • Cơ chế cắt mạch bằng bức xạ gamma Coban-60: Bức xạ ion hóa tạo ra các gốc tự do (đặc biệt là gốc hydroxyl ·OH) trong cấu trúc polyme, dẫn đến sự phân cắt ngẫu nhiên các liên kết glycoside β-(1→4), làm suy giảm khối lượng phân tử mà không làm biến tính các nhóm chức cơ bản.
  • Cơ chế biến đổi của tôm sau thu hoạch: Tôm bị suy giảm chất lượng do phản ứng oxy hóa tạo sắc tố đen (melanosis) bởi hệ enzyme polyphenoloxidase (PPO), quá trình phân giải protein tạo các hợp chất base bay hơi (NH3, TVB-N) và sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí gây ươn hỏng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp nghiên cứu định lượng thực nghiệm trong phòng thí nghiệm và công nghệ sinh học:

  • Phương pháp bố trí thí nghiệm: Áp dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box - Behnken 3 yếu tố để tối ưu hóa quá trình lên men vi khuẩn lactic khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm.
  • Phương pháp phân tích hóa học: Xác định thành phần độ ẩm, protein thô, lipid, tro theo tiêu chuẩn AOAC và TCVN; xác định hàm lượng canxi bằng phương pháp chuẩn độ EDTA; đo hàm lượng nitơ bay hơi và NH3.
  • Phương pháp phân tích cấu trúc và khối lượng phân tử: Xác định độ deacetyl bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) và quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR); xác định khối lượng phân tử trung bình (Mn, Mw, Mz) và hệ số đa phân tán (PI) bằng sắc ký gel thấm qua (GPC); đo độ nhớt bằng nhớt kế Ostwald và tính toán khối lượng phân tử theo phương trình Mark-Houwink-Sakurada (MHS).
  • Phương pháp vi sinh và xác định hoạt tính kháng khuẩn: Nuôi cấy, hoạt hóa vi khuẩn L. plantarum VTCC-B 431 trên môi trường MRS; xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đo độ đục (OD) và đếm khuẩn lạc (CFU/ml); xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch đối với các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm.
  • Phương pháp đánh giá độc tính học: Thực hiện thử nghiệm độc tính cấp đường uống và giai đoạn hồi phục trên động vật thí nghiệm (chuột lang); phân tích các chỉ tiêu sinh hóa nước tiểu, sinh hóa huyết học; giải phẫu đại thể và cắt lát mô bệnh học quan sát vi thể gan, thận, lách và dạ dày.
  • Phương pháp bảo quản và đánh giá chất lượng tôm: Xử lý tôm bạc bằng phương pháp nhúng dung dịch oligochitosan; bảo quản ở nhiệt độ lạnh 0 - 4°C; theo dõi biến đổi chất lượng qua các chỉ tiêu cảm quan, hàm lượng NH3, chỉ số chống oxy hóa tổng (TAA), pH và tổng số vi sinh vật hiếu khí.
  • Phương pháp xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm thống kê xử lý phân tích phương sai (ANOVA) để kiểm định mức độ tin cậy của các số liệu thực nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu và Tổng quan tài liệu

Nội dung chương tổng quan tập trung luận giải cơ sở khoa học của việc khai thác phế liệu đầu vỏ tôm để sản xuất chitin, chitosan và dẫn xuất oligochitosan. Tác giả phân tích chi tiết bản chất của các liên kết hóa học giữa chitin, protein và khoáng canxi trong vỏ tôm. Phần tổng quan chỉ rõ những giới hạn của phương pháp hóa học truyền thống và hệ thống hóa các nghiên cứu sử dụng enzyme, vi sinh vật và kỹ thuật chiếu xạ. Đồng thời, chương này tổng kết cơ chế tác động kháng khuẩn của oligochitosan và các nguyên lý biến đổi sinh hóa, vi sinh vật của tôm nguyên liệu trong quá trình bảo quản sau thu hoạch.

Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, chủng giống vi sinh vật và trang thiết bị sử dụng. Phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng được thu gom từ các cơ sở chế biến, tôm bạc biển tươi được thu nhận trực tiếp từ tàu khai thác. Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum VTCC-B 431 được phục hồi và nhân giống đạt chuẩn mật độ tế bào. Toàn bộ các quy trình bố trí thí nghiệm đơn yếu tố và đa yếu tố, các bước phân tích hóa lý, trắc phổ (FTIR, 1H-NMR, GPC), quy trình thử nghiệm vi sinh vật học và mô hình đánh giá độc tính trên động vật được quy định chặt chẽ, tạo cơ sở cho các kết quả thực nghiệm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm qua 8 nhóm nội dung chính:

  1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng: Xác định các chỉ tiêu độ ẩm, protein, khoáng và chitin làm căn cứ tính toán hiệu quả của các quá trình công nghệ tiếp theo.

  2. Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và tạp chất trong sản xuất chitin:

  • Khảo sát các loại enzyme protease thương mại: Lựa chọn enzyme flavourzyme cho hiệu quả phân giải protein cao nhất.
  • Lên men bằng vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng gồm tỷ lệ dịch vi khuẩn, thời gian lên men, tỷ lệ rỉ đường bổ sung và pH ban đầu. Áp dụng quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken xác định được chế độ tối ưu: Tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn bổ sung là 11,20% (v/w) với mật độ 2.10^9 CFU/ml; tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w); tỷ lệ nước/nguyên liệu là 1/1; pH ban đầu 7,0; lên men ở nhiệt độ phòng trong thời gian 6,19 ngày.
  • Xử lý hoàn thiện: Bán chế phẩm sau lên men được khử protein còn lại bằng enzyme flavourzyme với tỷ lệ 0,06%, nhiệt độ 50°C, pH 7,5 trong 8 giờ. Khử khoáng còn lại bằng dung dịch acid HCl 3% với tỷ lệ acid/chitin thô là 2/1 ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ. Sản phẩm chitin thu được đạt độ tinh sạch cao, hàm lượng protein còn lại dưới 1%, chi phí nguyên vật liệu ước tính là 111.000 VNĐ/kg.
Chỉ tiêu công nghệ Chế độ lên men vi khuẩn lactic Chế độ xử lý enzyme flavourzyme Chế độ khử khoáng acid HCl
Tác nhân sử dụng L. plantarum VTCC-B 431 (2.10^9 CFU/ml) Enzyme flavourzyme Dung dịch HCl 3%
Tỷ lệ tác nhân 11,20% dịch vi khuẩn; 11,15% rỉ đường 0,06% enzyme Tỷ lệ dung dịch acid/chitin là 2/1
Nhiệt độ phản ứng Nhiệt độ phòng 50°C Nhiệt độ phòng
Thời gian phản ứng 6,19 ngày 8 giờ 10 giờ
pH môi trường Ban đầu pH = 7,0 pH = 7,5 -

  1. Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao: Khảo sát quá trình deacetyl chitin trong môi trường kiềm đậm đặc ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự suy giảm khối lượng phân tử. Kết quả xác định nồng độ dung dịch NaOH thích hợp là 50%, tỷ lệ dung dịch NaOH/chitin là 4/1, thời gian xử lý 120 giờ ở nhiệt độ thường. Sản phẩm chitosan tạo thành có độ deacetyl đạt trên 93%, chi phí nguyên vật liệu ước tính là 361.365 VNĐ/kg. Phổ FTIR và 1H-NMR khẳng định cấu trúc đặc trưng của chitosan có độ deacetyl cao.

  2. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban-60: Khảo sát việc chiếu xạ tia gamma Co-60 trên cả hai trạng thái của chitosan: dạng dung dịch hòa tan trong acid và dạng vẩy rắn. Kết quả cho thấy chiếu xạ trên chitosan dạng vẩy với liều xạ 166 kGy cho phép phân cắt hiệu quả mạch polyme mà không cần sử dụng lượng lớn dung môi acid hay cồn để kết tủa. Chế phẩm sau chiếu xạ được phân tách thành 3 phân đoạn oligochitosan có độ hòa tan tốt trong nước.

  3. Xác định cấu trúc và khối lượng phân tử của oligochitosan:

  • Đánh giá phổ hồng ngoại FTIR: Các phân đoạn oligochitosan vẫn giữ nguyên vẹn khung cấu trúc glycoside và các nhóm chức amine tự do đặc trưng, không xuất hiện các nhóm chức lạ do bị oxy hóa phá hủy vòng.
  • Đánh giá phổ sắc ký gel thấm qua (GPC) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR: Xác định khối lượng phân tử của các phân đoạn. Trong đó, phân đoạn 2 có cấu trúc phân tử trung bình tương ứng với 13 monomer D-glucosamine.

  1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn của oligochitosan: Khảo sát hoạt tính ức chế vi sinh vật của oligochitosan bằng phương pháp xác định nồng độ pha loãng thấp nhất ức chế vi khuẩn (MIC) và đo đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa thạch. Kết quả khẳng định chế phẩm oligochitosan có khả năng ức chế sinh trưởng rõ rệt đối với 5 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm gồm: Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus.

  2. Thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột lang thí nghiệm: Thiết kế thí nghiệm đánh giá độc tính cấp (nhóm I) và giai đoạn hồi phục (nhóm II) khi cho chuột lang uống oligochitosan với các liều thử nghiệm. Kết quả theo dõi:

  • Trọng lượng cơ thể chuột và trọng lượng tươi của các nội quan (gan, lách, thận) tăng trưởng bình thường, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng.
  • Các chỉ số sinh hóa nước tiểu và sinh hóa huyết học của chuột ở cả hai nhóm đều nằm trong giới hạn sinh lý bình thường.
  • Quan sát vi thể mô bệnh học gan, thận, lách và dạ dày chuột uống oligochitosan không ghi nhận tổn thương cấu trúc tế bào, viêm loét hay hoại tử. Kết quả chứng minh chế phẩm an toàn tuyệt đối qua đường tiêu hóa.
Nhóm chỉ tiêu đánh giá Kết quả nhóm thử nghiệm độc tính cấp (Nhóm I) Kết quả nhóm theo dõi hồi phục (Nhóm II) Kết luận về tính an toàn
Tỷ lệ sống sót 100% cá thể chuột sống bình thường 100% cá thể chuột sống bình thường Không gây độc tính cấp
Trọng lượng cơ thể và nội quan Tăng trưởng tương đương đối chứng Duy trì ổn định bình thường Không làm suy giảm thể trạng
Sinh hóa huyết học và nước tiểu Các chỉ số trong giới hạn sinh lý Các chỉ số trong giới hạn sinh lý Không làm biến đổi chức năng gan, thận
Mô bệnh học vi thể (gan, thận, lách) Cấu trúc tế bào nguyên vẹn, không hoại tử Cấu trúc tế bào bình thường Không gây tổn thương mô nội tạng
  1. Ứng dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu:
  • Xác định nồng độ xử lý: Thử nghiệm các nồng độ dung dịch oligochitosan khác nhau, xác định nồng độ 1% là phù hợp nhất để kiểm soát vi sinh vật và kìm hãm biến màu tôm.
  • Xác định chế độ xử lý và bao gói: Thời gian nhúng tôm nguyên liệu vào dung dịch oligochitosan 1% thích hợp là 1 phút. Sau đó tôm được để ráo, bao gói và bảo quản ở nhiệt độ 0 - 4°C.
  • Hiệu quả bảo quản: Theo dõi trong 6 ngày bảo quản lạnh, mẫu tôm được xử lý bằng oligochitosan 1% duy trì điểm cảm quan ở mức tốt; kìm hãm đáng kể tốc độ tích lũy base bay hơi (NH3); duy trì hoạt tính chống oxy hóa tổng (TAA) cao hơn; giữ ổn định chỉ số pH; mật độ tổng số vi sinh vật hiếu khí trên bề mặt tôm thấp hơn rõ rệt so với mẫu đối chứng không xử lý. Tôm sau 6 ngày bảo quản vẫn đạt đầy đủ tiêu chuẩn chất lượng dùng cho chế biến thực phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Theo công bố chính thức từ phần tóm tắt đóng góp mới của luận án, công trình đã đạt được 6 kết quả khoa học và thực tiễn cốt lõi sau:

  1. Đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học sử dụng phối hợp giữa vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 lên men khử protein, khoáng chất của đầu vỏ tôm thẻ và enzyme flavourzyme khử protein còn lại: Nuôi hoạt hóa vi khuẩn trong 28 giờ đạt mật độ 2.10^9 CFU/ml; tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1; tỷ lệ rỉ đường 11,15% (w/w); tỷ lệ dịch vi khuẩn bổ sung 11,20% (v/w); lên men ở nhiệt độ phòng trong 6,19 ngày với pH ban đầu 7,0. Tiếp tục khử protein còn lại bằng enzyme flavourzyme 0,06% ở 50°C, pH 7,5 trong 8 giờ. Khử khoáng còn lại bằng dung dịch acid HCl 3% với tỷ lệ acid/chitin thô là 2/1 ở nhiệt độ phòng trong 10 giờ. Quy trình giúp giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường, cho phép tận thu protein và sắc tố astaxanthin làm thức ăn chăn nuôi, với chi phí nguyên vật liệu là 111.000 VNĐ/kg chitin.

  2. Đã xác định được các thông số kỹ thuật thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao trên 90%: Khử nhóm acetyl của chitin bằng dung dịch NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120 giờ với tỷ lệ dung dịch NaOH/chitin là 4/1. Chitosan thành phẩm đạt độ deacetyl trên 93%, chi phí nguyên vật liệu là 361.365 VNĐ/kg.

  3. Đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ gamma Coban-60 để phân cắt trực tiếp chitosan dạng vẩy với liều xạ 166 kGy. Sản phẩm sau chiếu xạ tạo thành 3 phân đoạn, có khả năng ức chế 5 chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus). Phương pháp có ưu điểm công nghệ vượt trội là không cần thực hiện các công đoạn kết tủa bằng cồn, tinh sạch hay sấy khô phức tạp như các phương pháp hóa học hay enzyme, thuận lợi cho việc triển khai sản xuất đại trà.

  4. Đã phân tích và xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan phân đoạn 2 gồm 13 đơn vị monomer D-glucosamine.

  5. Đã thực hiện đầy đủ thử nghiệm độc tính của chế phẩm oligochitosan sau chiếu xạ trên chuột lang thí nghiệm qua đường tiêu hóa; phân tích sinh hóa máu, sinh hóa nước tiểu, giải phẫu đại thể và kiểm tra mô bệnh học vi thể gan, lách, thận, dạ dày. Kết quả chứng minh chế phẩm oligochitosan hoàn toàn an toàn, không gây độc tính đối với động vật thí nghiệm.

  6. Đã nghiên cứu và hoàn thiện quy trình công nghệ bảo quản tôm bạc biển nguyên liệu sau thu hoạch bằng giải pháp nhúng dung dịch oligochitosan 1% trong thời gian 1 phút. Tôm sau xử lý có thể kéo dài thời gian bảo quản lạnh ở 0 - 4°C lên đến 6 ngày mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng cho chế biến thủy sản, cung cấp cơ sở khoa học để hạn chế việc lạm dụng hóa chất độc hại trong bảo quản thủy sản.

Kiến nghị của luận án: Đề xuất tiếp tục hoàn thiện dây chuyền thiết bị ở quy mô pilot và chuyển giao quy trình công nghệ ứng dụng oligochitosan vào thực tiễn cho các đội tàu khai thác hải sản xa bờ và các doanh nghiệp chế biến thủy sản.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong luận án, một số hạn chế và hướng phát triển tiếp theo được ghi nhận:

  • Hạn chế về điều kiện công nghệ: Quá trình deacetyl hóa chitin ở nhiệt độ thường đòi hỏi thời gian kéo dài (120 giờ), cần mặt bằng và bể chứa lớn nếu triển khai ở quy mô công nghiệp. Việc sử dụng nguồn bức xạ gamma Coban-60 phụ thuộc vào các trung tâm chiếu xạ chuyên dụng có trang bị nguồn phóng xạ công nghiệp.
  • Phạm vi đối tượng ứng dụng: Luận án mới chỉ tập trung thử nghiệm bảo quản trên đối tượng tôm bạc biển (Metapenaeus ensis) ở chế độ bảo quản lạnh 0 - 4°C, chưa mở rộng khảo sát trên các nhóm nguyên liệu thủy sản khác như cá đáy, mực, giáp xác cỡ lớn hoặc các điều kiện bảo quản cấp đông sâu.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tiếp tục nghiên cứu các giải pháp cơ học hoặc hóa lý bổ trợ nhằm rút ngắn thời gian deacetyl hóa chitin ở nhiệt độ thường; mở rộng thử nghiệm bảo quản bằng oligochitosan trên nhiều đối tượng hải sản có giá trị kinh tế cao trong các chuyến biển dài ngày; nghiên cứu kết hợp màng bao oligochitosan với các hợp chất tự nhiên khác để tăng cường khả năng chống oxy hóa.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Công nghệ Chế biến Thủy sản, Công nghệ Thực phẩm và Công nghệ Sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo có giá trị về phương pháp ứng dụng vi sinh vật kết hợp enzyme trong tận dụng phụ phẩm; phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken; kỹ thuật phân tích cấu trúc polyme sinh học bằng FTIR, NMR, GPC và phương pháp thiết kế thử nghiệm độc học in vivo.
  • Đối với các viện nghiên cứu và cơ sở đào tạo: Là tài liệu nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ bức xạ ứng dụng trong biến tính vật liệu sinh học biển.
  • Đối với các doanh nghiệp chế biến thủy sản: Cung cấp quy trình công nghệ xanh để chế biến đầu vỏ tôm thành các sản phẩm có giá trị gia tăng cao (chitin, chitosan, oligochitosan) với chi phí nguyên vật liệu được hạch toán cụ thể, đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải.
  • Đối với các cơ quan quản lý và hoạch định chính sách nghề cá: Cung cấp luận cứ khoa học để xây dựng các hướng dẫn kỹ thuật bảo quản hải sản an toàn trên tàu cá, hướng tới việc thay thế các hóa chất bảo quản độc hại.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp sinh học sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm thẻ trong luận án có điểm gì khác biệt so với phương pháp truyền thống? Phương pháp truyền thống sử dụng dung dịch kiềm nóng (NaOH 1% - 10% ở nhiệt độ lên tới 100°C) để khử protein. Luận án đã thay thế bằng quá trình lên men vi khuẩn lactic L. plantarum VTCC-B 431 kết hợp xử lý tiếp bằng enzyme flavourzyme 0,06% và khử khoáng bằng dung dịch HCl loãng 3% ở nhiệt độ thường. Quy trình này giúp loại bỏ triệt để protein (hàm lượng còn lại dưới 1%), giảm thiểu sử dụng hóa chất và tận thu được phụ phẩm giàu protein và astaxanthin dùng cho chăn nuôi.

  2. Điều kiện công nghệ để sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90% ở nhiệt độ thường là gì? Quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong dung dịch NaOH nồng độ 50% ở nhiệt độ phòng, với tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin là 4/1, thời gian xử lý là 120 giờ. Sản phẩm thu được đạt độ deacetyl trên 93% với chi phí nguyên vật liệu là 361.365 VNĐ/kg.

  3. Kỹ thuật phân cắt chitosan bằng bức xạ Coban-60 có ưu thế gì so với phương pháp hóa học và enzyme? Chiếu xạ tia gamma Coban-60 với liều 166 kGy được thực hiện trực tiếp trên chitosan ở trạng thái rắn (dạng vẩy). Phương pháp này không sử dụng hóa chất cắt mạch độc hại, không làm biến đổi nhóm amin tự do và sản phẩm sau chiếu xạ tan trực tiếp trong nước mà không cần các công đoạn kết tủa bằng cồn, tinh sạch hay sấy phun phức tạp như phương pháp hóa học hay enzyme.

  4. Oligochitosan sản xuất bằng bức xạ Coban-60 có gây độc tính cho cơ thể hay không? Thử nghiệm độc tính trên chuột lang thí nghiệm qua đường tiêu hóa (cả giai đoạn cấp tính và giai đoạn hồi phục) cho thấy: các chỉ số thể trọng, trọng lượng tươi nội quan, chỉ số sinh hóa máu, sinh hóa nước tiểu và hình ảnh vi thể mô bệnh học của gan, thận, lách, dạ dày đều hoàn toàn bình thường, không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu tổn thương hay biến đổi bệnh lý nào.

  5. Hiệu quả ứng dụng chế phẩm oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu được ghi nhận như thế nào? Khi nhúng tôm bạc vào dung dịch oligochitosan 1% trong 1 phút rồi bảo quản ở nhiệt độ 0 - 4°C, tôm giữ được chất lượng cảm quan tốt trong 6 ngày, kìm hãm sự gia tăng hàm lượng NH3, ổn định chỉ số pH, duy trì hoạt tính chống oxy hóa tổng (TAA) và ức chế sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí trên bề mặt so với mẫu đối chứng không xử lý.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Vũ Thị Hoan đã giải quyết trọn vẹn chuỗi công nghệ từ việc tận dụng phụ phẩm đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp sinh học để sản xuất chitin, deacetyl hóa tạo chitosan ở nhiệt độ phòng, đến việc ứng dụng bức xạ gamma Coban-60 phân cắt chitosan vẩy tạo oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn. Công trình đã chứng minh tính an toàn độc học tuyệt đối của chế phẩm và xác lập thành công quy trình ứng dụng oligochitosan 1% để kéo dài thời gian bảo quản tôm bạc nguyên liệu lên 6 ngày ở nhiệt độ lạnh. Kết quả nghiên cứu đóng góp cơ sở khoa học và giải pháp thực tiễn quan trọng cho ngành công nghệ sau thu hoạch thủy sản, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và hạn chế lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm.