đặt vấn đề nghiên cứu chiết hesperidin từ quả Phật thủ nhằm tận dụng và nâng cao hiệu quả kinh tế. Với những lý do đề cập ở trên, việc nghiên cứu chiết xuất Hesperidin từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có trong nước trên cơ sở công nghệ tự nghiên cứu là hết sức cần thiết. Hơn nữa, việc tự sản xuất hesperidin trong nước vừa góp phần đa dạng hóa sản phẩm, vừa góp phần tự chủ, đa dạng hóa nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc phù hợp với mục tiêu, chiến lược xây dựng và phát triển ngành công nghiệp hóa dược. 1 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Mục tiêu của đề tài: • Xây dựng quy trình tách chiết, phân lập Hesperidin làm nguyên liệu sản xuất thuốc từ quả phật thủ.
Đề tài đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: • Xác định điều kiện chiết tách flavonoid toàn phần từ quả phật thủ. • Phân lập và tinh chế Hesperidin đạt tiêu chuẩn nguyên lieu thuốc. • Xây dựng quy trình tách chiết Hesperidin từ quả phật thủ. • Phân tích kiểm nghiệm một số chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm.
2 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc I. Cây Phật thủ I. Cây phật thủ và tác dụng chữa bệnh của Phật thủ Cây Phật thủ có tên khoa học là Citrus medica L var. Sarcodactylis Swingle thuộc chi Cam quýt (Citrus) họ Cửu lý hương (Rutaceace) thường được gọi là họ Cam; tên thường gọi là Buddha's Hand citron, Finger citrom frenit, Phật thủ.
[5] Cây Phật thủ là dạng cây nhỏ xanh tốt quanh năm, lá mọc so le, hình trứng, mép có răng cưa nhỏ, gai ngắn mọc ở dưới lá. Vào đầu mùa hạ ra hoa màu trắng, cánh hoa trên trắng dưới đỏ, quả chín vào mùa đông, vỏ ngoài màu vàng, trên một số những múi chạy dài dọc quả phía dưới tách ra trông như ngón tay nên có tên là phật thủ.[5], [4] (Hình 1) Hình 1: Cây, hoa và quả Phật thủ 3 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Phật thủ được trồng tại nhiều nơi trong nước ta, thường để lấy quả ăn, làm mứt và làm thuốc. Phật thủ còn được trồng ở Trung Quốc, Ấn độ, các nước vùng Địa Trung Hải, Úc, Nam Mỹ, Trung Đông. Y học cổ tryuền thường dùng quả phơi khô (Fructus Citri sarcodactyli).
Quả phật thủ hiện mới chỉ được dùng để chữa ho đặc biệt là chữa ho cho trẻ em, chữa bụng đầy, đau, biếng ăn, nôn mửa tại Trung Quốc và Việt Nam theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền.[5] Gần đây do thành phần phong phú các hợp chất polyphenol và đặc biệt là sự có mặt với hàm lượng đáng kể của các hợp chất flavonoid trong quả phật thủ nên phật thủ được sử dụng trong phòng ngừa và điều trị huyết áp, loãng xương, chống oxy hóa… [20] Ở Trung Quốc hiện cao chiết flavonoid toàn phần của quả Phật thủ đã được bào chế thành dạng thực phẩm chức năng. Thành phần hóa học của quả Phật thủ Trong quả Phật thủ ngoài tinh dầu, các hợp chất đường còn có các hợp chất polyphenol như: Hesperidin (1); diosmetin (2); eriocitrin(3); diosmin(4); 5-methoxyfurfural(5); 5-hydroxy-2-hydroxymethyl-4H-pyran-4-one(6); vanillic acid(7); 3-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-acrylic acid(8); 3,4- dihydroxy-benzoic acid(9); limettin(10); obacunone(11).[5],[4] (Hình 2) Trong đó các hợp chất 1, 2, 3, 4 là các flavonoid. Trong quả Phật thủ nói riêng, quả của các cây họ Cam nói chung các hợp chất flavonoid tập trung chủ yếu ở lớp vỏ cùi (Albedo) và ở lớp vỏ dầu (Flavedo). Trong đó hesperidin tập trung chủ yếu ở lớp vỏ cùi dưới dạng kết tinh.[2], [7] 4 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc I.
Flavonoid, các hợp chất flavonoid trong cây họ Cam I. Flavonoid Flavonoid bao gồm một nhóm lớn các hợp chất polyphenol tự nhiên khối lượng phân tử thấp phân bố rộng dãi trong giới thực vật. Chúng là sản phẩm của quá trình chuyển hóa thứ cấp trong cây qua con đường Shikimate và chuyển hóa phenylpropanoid. Flavonoid là một trong những nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng nhất và đáng chú ý nhất.
Cho đến nay, hơn 4.000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc. Chúng xuất hiện cả ở dạng tự do (aglycone) cũng như dạng glucosid. Flavonoid có trong hầu hết các phần của thực vật bao gồm: trong quả, thân, lá, rễ và hoa. [2], [19] Khung flavonoid được tạo thành từ hai vòng thơm (thường ký hiệu là A và B), được gắn với nhau qua một vòng pyrone (C) trong trường hợp các hợp chất flavone, hoặc là một vòng dihydropyrone trong trường hợp các hợp chất flavanone, như trong hình 3.
Hình 3: Khung flavone và flavanone Theo cấu trúc phân tử, flavonoid được chia thành sáu nhóm chính sau: flavone, flavanone, flavonol, isoflavone, anthocyanidin và flavanol. [17] Cấu trúc phân tử của chúng được biểu diễn như trong hình 4. 6 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Bảng 1: Các hợp chất flavanone dưới dạng aglycone Tên hợp chất R1 R2 R3 12 Hesperetin H OH OMe 13 Naringenin H H OH 14 Taxifolin OH OH OH 15 Isosakuranetin H H OMe 16 Eriodictyol H OH OH Trong bảng 2 là dạng aglycone của các flavone chủ yếu trong cây họ cam. Acacetin (17) và diosmetin (23) có một nhóm methoxy ở vị trí C4’ trong khi đó nhóm methoxy trong chrysoeriol (24) lại gắn ở vị trí C3’.
Kaempferol (20) và quercetin (21) lại có nhóm hydroxyl tại vị trí C3 và thường được xếp và phân nhóm flavonol. Bảng 2: Các hợp chất flavone dưới dạng aglycone Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 17 Acacetin H H H OMe R3 18 Isoscutellarein H OH H OH 5' 6' 4' R4 19 Luteolin H H OH OH R2 B HO 8 1 O 20 Kaempferol OH H H OH 7 2 3' A C 2' 21 Quercetin OH H OH OH 6 3 4 5 R1 22 Apigenin H H H OH OH O 23 Diosmetin H H OH OMe 24 Chrysoeriol H H OMe OH Nhóm polymethoxyflavone (PMF) thường thấy trong tinh dầu vỏ quả cây họ cam được trình bày trong bảng 3. 8 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Bảng 3: Các hợp chất polymethoxyflavone Tên hợp chất R1 R2 R3 R3 3' OMe 25 Quercetogetin OMe H OMe R2 2' 4' MeO 8 1 O 5' 26 3,3’,4’,5,6,7,8-Heptamethoxyflavone OMe OMe OMe 7 2 6' 6 3 27 Natsudaidain OH OMe OMe MeO 5 4 R1 28 Nobiletin H OMe OMe OMe O 29 Sinensetin H H OMe 30 Tangeretin H OMe H 31 Tetramethylscutellarein H H H Bảng 4: Các hợp chất flavanone-O-glycosid Tên hợp chất R1 R2 R3 a 32 Isosakuranetin 7-O-rutinoside (Didymin, Neoponcirin) O-Ru H OMe a 3 Eriodictyol 7-O-rutinoside (Eriocitrin) O-Ru OH OH a 1 Hesperetin 7-O-rutinoside (Hesperidin) O-Ru OH OMe b 33 Naringenin 7-O-neohesperidoside (Naringin) O-Nh H OH a 34 Naringenin 7-O-rutinoside (Narirutin) O-Ru H OH b 35 Hesperetin 7-O-neohesperidoside (Neohesperidin) O-Nh OH OMe b 36 Eriodictyol 7-O-neohesperidoside (Neoeriocitrin) O-Nh OH OH b 37 Isosakuranetin 7-O-neohesperidoside (Poncirin) O-Nh H OMe a b O-Rutinose; O-Neohesperidose Các flavanone O-glycosid có trong cây họ Cam được giới thiệu trong bảng 4. Các dẫn xuất này có một nhóm thế glycosyl ở vị trí C7 (trong vòng A).
Cho đến nay, trong nhóm hợp chất này chỉ có hai nhóm disaccharid được xác định mà cả hai đều là dẫn xuất L-rhamnosyl-D-glucosyl : Nhóm rutinose, có một liên kết α-1,6 interglycosid; còn nhóm neohesperidose thì hai phân tử đường liên kết với nhau qua liên kết α-1,2 interglycosid. (Hình 5) 9 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Hình 5: Rutinose và neohesperidose Bảng 5: Flavone-C-glucosid và flavone-O-glucosid Tên hợp chất R1 R2 R3 R4 R5 R6 38 Luteolin 6,8-di-C-glucoside (Lucenin-2) H Glu OH Glu OH OH 39 Apigenin 6,8-di-C-glucoside (Vicenin-2) H Glu OH Glu H OH 40 Chrysoeriol 6,8-di-C-glucoside (Stellarin-2) H Glu OH Glu OMe OH 41 Diosmetin 6,8-di-C-glucoside (Lucenin-2 4´-methyl ether) H Glu OH Glu OH OMe 42 Apigenin 7-O-neohesperidoside-4´-glucoside (Rhoifolin 4´-glucoside) H H O-Nhb H OH O-Glu 43 Chrysoeriol 7-O-neohesperidoside-4´-glucoside H H O-Nhb H OMe OH 44 Apigenin 6-C-glucoside (Isovitexin) H Glu OH H H OH 45 Luteolin 7-O-rutinoside H H O-Rua H OH OH 46 Chrysoeriol 8-C-glucoside (Scoparin) H H OH Glu OMe OH 47 Diosmetin 8-C-glucoside (Orientin 4´-methyl ether) H H OH Glu OH OMe 48 Quercetin 3-O-rutinoside (Rutin) O-Rua H OH H OH OH 49 Apigenin 7-O-neohesperidoside (Rhoifolin) H H O-Nhb H OH OH 50 Apigenin 7-O-rutinoside (Isorhoifolin) H H O-Rua H OH OH b 51 Chrysoeriol 7-O-neohesperidoside H H O-Nh H OMe OH 4 Diosmetin 7-O-rutinoside (Diosmin) H H O-Rua H OH OMe 53 Diosmetin 7-O-neohesperidoside (Neodiosmin) H H O-Nhb H OH OMe a b O-Rutinose; O-Neohesperidose. 10 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Các hợp chất flavone-O-glycosid tìm thấy trong cây họ cam thường là 7-O-rutinoside hoặc 7-O-neohesperidoside. (Bảng 5) Cho đến nay, người ta mới chỉ tìm thấy duy nhất Rutin (48) là dẫn xuất 3-O-rutinoside.
Trong cây họ cam cũng còn chứa một số lớn dẫn xuất di-C-glycosid cũng như một số lượng nhỏ hơn dẫn xuất mono-C-glycosid. Với những hợp chất này, sự thế thường ở vị trí C6 hay C8 hoặc cả hai. Hiện mới chỉ có dẫn xuất D-glucosyl được tìm thấy. [2], [9] Hesperidin có công thức phân tử: C28H34O15.
Khối lượng phân tử: 610,56. Công thức cấu tạo của Hesperidin như sau: OH HO OH OH OH H3C O O CH3 O O OH O O OH OH O Hesperidin (1) Tên khoa học: (2S)-7-[[6-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D- glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one. Tên khác: hesperetin 7-rhamnoglucoside; cirantin; hesperetin-7- rutinoside. 11 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Theo cấu trúc phân tử hesperidin thuộc về nhóm flavanone.
Phân tử hesperidin gồm một phân tử aglycone hesperetin (12) liên kết với một phân tử disaccharid (rutinose). Do đó có thể coi hesperidin là dẫn xuất β-7-rutinoside của hesperetin. Rutinose (6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-D-glucose) là một disaccharid tạo nên bởi một phân tử rhamnose và một phân tử glucose bằng liên kết α-1,6. Trong phân tử hesperidin, glucose gắn với hesperetin còn rhamnose gắn với phân tử glucose.[2], [7] Khi thủy phân hesperidin bằng kiềm thu được phloroglucinol và hesperetenic axít.
[9] Khi thủy phân hesperidin bằng axít thu được hesperetin, D-glucose, L-rhamnose. Tính chất của Hesperidin Hesperidin là bột màu trắng hay nâu nhạt, không mùi, không vị. Khó tan trong nước (1 gam trong 50 lít nước). Tan trong formamid, DMF ở 60 oC.
Tan ít trong metanol, axít axetic nóng. Hầu như không tan trong acetone, benzene, chloroform. Tan tự do trong kiềm loãng, pyridine tạo ra một dung dịch có màu vàng sáng.[20] Nhiệt độ nóng chẩy: 258-262 °C. Tác dụng dược lý của Hesperidin Tác dụng chữa bệnh của hesperidin được các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm trong hai thập kỷ vừa qua và đã có một số lượng lớn ấn phẩm được công bố về ứng dụng hesperidin trong điều trị bệnh.[2], [6], [19] Hesperidin cũng như các flavonoid khác có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư.
