ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan B là một bệnh truyền nhiễm có khả năng đe dọa tính mạng con người do vi rút viêm gan B (HBV) gây ra, có thể gây ra nhiễm trùng mạn tính và tăng nguy cơ tử vong do xơ gan và ung thư gan. Theo WHO tỷ lệ nhiễm viêm gan B cao nhất ở khu vực Tây Thái Bình Dương và khu vực châu Phi nơi có 6,2% (khoảng 115 triệu người) và 6,1% dân số trưởng thành bị nhiễm bệnh. Tại khu vực Đông Địa Trung Hải, khu vực Đông Nam Á và khu vực châu Âu, ước tính lần lượt là 3,3%, 2,0% và 1,6% dân số bị nhiễm bệnh. Và tại khu vực châu Mỹ ước tính 0,7% dân số bị nhiễm bệnh [76].
Tại Việt Nam, khoảng 7,8 triệu người đang sống chung với viêm gan B và gần 1 triệu người đang sống chung với viêm gan C có nghĩa là trong chín người ở Việt Nam thì có một người bị nhiễm viêm gan B (HBV) hoặc nhiễm viêm gan C (HCV). Viêm gan B và C gây ra gần 80.000 ca ung thư gan và 40.000 ca tử vong mỗi năm. Một nghiên cứu cho thấy gần 90% người ung thư gan đã hoặc đang nhiễm vi rút viêm gan B và hoặc viêm gan C [71]. Có thể thấy, viêm gan B là vấn đề y tế mang tính chất toàn cầu, việc chuẩn đoán nhiễm viêm gan B chủ yếu dựa trên các xét nghiệm AST, ALT, Bilirubin, Anti-HBc IgM, HBsAg.
Việc chỉ định điều trị kháng vi rút dựa vào 3 yếu tố: nồng độ ALT, định lượng HBV-DNA và mức độ xơ hóa của gan [7]. Định lượng HBV-DNA trong huyết tương hoặc huyết thanh là một xét nghiệm đáng tin cậy và có giá trị cao trong đánh giá mức độ nhiễm vi rút trong máu ở người nhiễm HBV. Để xác định bệnh mạn tính, theo dõi hiệu quả điều trị của thuốc kháng vi rút và dự đoán nguy cơ xơ gan và ung thư gan ở bệnh nhân bị bệnh viêm gan B mạn tính [7], [15]. Trong những năm gần đây, xét nghiệm định lượng HBV-DNA bằng phương pháp real-time PCR đã được áp dụng rộng rãi ở nhiều cơ sở với ưu điểm độ nhạy và độ đặc hiệu cao [25].
Tuy nhiên chất lượng của kết quả xét nghiệm vẫn còn phụ thuộc nhiều vào phương pháp và kinh nghiệm của kỹ thuật viên. Do đó, ngoại kiểm tra chất lượng. 2 (EQA) trong phòng xét nghiệm y học được xem như một công cụ quan trọng và hữu hiệu trong việc kiểm soát chất lượng xét nghiệm. Trên thực tế, việc cung cấp mẫu ngoại kiểm trong chương trình ngoại kiểm HBV- DNA còn nhiều hạn chế.
Các mẫu ngoại kiểm nhập từ nước ngoài với giá thành cao, nguồn cung cấp mẫu không ổn định, đôi khi không mua được mẫu do nhiều lý do, gây khó khăn cho đơn vị tham gia ngoại kiểm. Từ năm 2016, mẫu ngoại kiểm được cung cấp bởi Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh với dạng mẫu lỏng đông lạnh đã phần nào giải quyết được vướng mắc mà mẫu ngoại kiểm nước ngoài gặp phải. Tuy nhiên, mẫu ngoại kiểm sản xuất ở dạng lỏng lại có nhược điểm trong quá trình vận chuyển như dễ tràn đổ và cần đảm bảo vận chuyển trong môi trường lạnh từ đó phát sinh thêm chi phí vận chuyển. Hiện nay, các xét nghiệm định lượng HBV-DNA rất đa dạng về phương pháp, do đó mẫu ngoại kiểm sau khi sản xuất cần phải đánh giá sự phù hợp trên hầu hết các phương pháp xét nghiệm mà đơn vị sử dụng.
Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất mẫu huyết tương đông khô ứng dụng cho ngoại kiểm định lượng HBV-DNA theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17043:2010”. 3 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Mẫu huyết tương đông khô HBV-DNA được sản xuất tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh có đáp ứng yêu cầu về mẫu ngoại kiểm theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17043:2010 hay không? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu quy trình sản xuất và đánh giá mẫu huyết tương đông khô HBV-DNA theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17043:2010 Mục tiêu cụ thể 1. Hoàn thiện quy trình sản xuất mẫu huyết tương đông khô HBV-DNA ứng dụng cho chương trình ngoại kiểm định lượng HBV-DNA. Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của bộ mẫu được sản xuất tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh theo ISO 13528:2015.
Đánh giá mẫu ngoại kiểm huyết tương đông khô HBV-DNA trên 06 phương pháp xét nghiệm được đơn vị sử dụng trong chương trình thử nghiệm. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đại cương về viêm gan B 1. Hình thái vi rút HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc di truyền DNA với 10 kiểu gen ký hiệu từ A đến J [7], [63].
HBV có 3 loại kháng nguyên chính: HbsAg, HbeAg và HbcAg tương ứng với 3 loại kháng thể, lần lượt là: Anti-HBs, Anti-Hbe, Anti-HBc [7]. Có 3 thành phần vi rút xuất hiện trong huyết thanh bệnh nhân được tìm thấy dưới kính hiển vi điện tử bao gồm: - Các tiểu thể HBs hình cầu có đường kính 20nm, là các protein HBs được tạo ra dư thừa trong bào tương của tế bào gan sau đó được phóng thích vào máu. Các hạt này bao gồm kháng nguyên bề mặt (HBsAg) và lipid có nguồn gốc từ vật chủ mà không chứa DNA của vi rút do đó không gây nhiễm [42]. - Các tiểu thể hình ống có đường kính khoảng 22 nm nhưng chiều dài thay đổi, có khi dài hơn 200m, được tạo thành từ các tiểu thể hình cầu chồng chất lên nhau và không có khả năng lây nhiễm - Các virion hoàn chỉnh (tiểu thể Dane): có dạng hình cầu, cấu trúc vỏ kép với đường kính 42nm, vỏ bọc bên ngoài chứa kháng nguyên bề mặt HbsAg với 3 loại protein S, M, L.
Bên trong là một nucleocapsid có đường kính 34nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi HbcAg, DNA và các enzyme (DNA polymerase, protein kinase). Chính vì vậy, các virion này có khả năng lây nhiễm [73], [42]. Mô hình các thành phần HBV xuất hiện trong huyết thanh, huyết tương Nguồn: Wolfram H Gerlich, 2010 [44] 1. Cấu trúc bộ gen vi rút Bộ gen HBV có chiều dài khoảng 3200 bases với dạng phân tử DNA dạng vòng không khép kín, gồm 2 chuỗi có chiều dài khác nhau.
Sợi âm nằm phía ngoài, tạo thành một vòng tròng liên lục, chiều dài cố định là 3200 base mã hóa cho các thông tin di truyền của vi rút. Sợi dương nằm ở trong, chiều dài thay đổi dao động từ 50 - 80% chiều dài sợi âm. Trên chuỗi dài (sợi âm) có 4 đoạn gen tương tứng với 4 khung đọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hóa cho sự tổng hợp các protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg, HBcAg), polymerase và protein X [36]. Bao gồm các gen như sau: - Gen S: chứa 3 vùng bao gồm vùng Pre-S1, Pre-S2 và vùng S tổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg.
Đoạn gen S tổng hợp nên Protein S, đoạn gen S và pre-S2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài 108 acid amin. Đoạn S, Pre-S1, Pre-. 6 S2 tổng hợp nên Protein L (Large). Vùng Pre-S1 là vùng chủ yếu giúp virus sẽ gắn lên các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan, giúp vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào.
Ngoài ra, vùng Pre-S2 có khả năng liên kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh của người giúp vi rút bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan [12]. - Gen C: gồm 2 vùng là vùng C (Core) và pre-C (Pre-core), chức năng tổng hợp protein của nucleocapsid. Vùng Pre-core chứa nucleotide đầu tiên mã hóa tạo nên một đoạn peptide tín hiệu giúp cho kháng nguyên HBeAg bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, hòa tan vào huyết thanh. Sự hiện diện của HBeAg phản ánh tình trạng nhân lên của vi rút ở bên trong tế bào gan và thể hiện tính lây nhiễm cao.
- Gen X: mã hóa cho sự tổng hợp protein HBx. Protein HBx có vai trò chuyển hoạt hóa trong quá trình sao chép của vi rút, quan trọng trong cơ chế sinh ung thư ở các tế bào gan bị nhiễm. Chu kỳ nhân lên Trong quá trình nhân lên, DNA của HBV không sao chép trực tiếp thành DNA mới mà qua bước trung gian là tạo ra 2 sợi mRNA nhờ RNA của tế bào ký chủ. Hai sợi mRNA này chứa toàn bộ thông tin di truyền của vi rút và được gọi là tiền genome.
Từ 2 sợi mRNA này sẽ sao chép từ mRNA thành DNA của vi rút. Như vậy, DNA polymerase hoạt động như một men sao chép ngược. Khi sợi DNA dài (L) được hình thành thì sợi mRNA cũng tự phá hủy. 7 Phần lõi của vi rút được lắp ghép thêm phần vỏ bên ngoài thành phần là kháng nguyên bề mặt HbsAg rồi được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào tương để phóng thích ra khỏi tế bào gan dưới dạng một virion hoàn chỉnh hoặc phần lõi này sẽ trở lại nhân tế bào gan để vào lại một chu trình sao chép mới [1].
Dịch tễ học 1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới HBV là nguyên nhân gây ra bệnh viêm gan B, gây hoại tử tế bào gan và viêm gan, có thể tiến triển cấp tính hoặc mạn tính. Theo WHO, năm 2015 ước tính có 257 triệu người, tương đương 3,5% dân số đang sống chung với bệnh viêm gan B mạn tính trên thế giới. Các khu vực Châu Phi và Tây Thái Bình Dương chiếm 68% tổng số người nhiễm bệnh.
Ngoài ra có 2,7 triệu người đồng nhiễm với HBV và HIV. Tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất ở khu vực châu Phi (6,1%) và Tây Thái Bình Dương (6,2%) [67]. Ở khu vực Châu Âu, Viêm gan B tấn công gan và cuộc sống của 15 triệu người. HBV gây nhiễm trùng cấp tính và mạn tính dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng, bao gồm xơ gan và ung thư gan ở 20 - 30% bệnh nhân.
Viêm gan B gây ra cái chết cho 56.000 người mỗi năm. Viêm gan B có tỉ lệ nhiễm thấp dưới 0,1% ở các nước ở khu vực tây Châu Âu, khu vực Bắc Âu và Trung Âu. Tỉ lệ nhiễm cao hơn từ 6 - 8% ở một số nước phía đông Châu Âu và Trung Á [70]. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam hiện có khoảng 7,7 triệu người nhiễm vi rút viêm gan B chiếm tỉ lệ 8,1% dân số.