Khóa luận tốt nghiệp: Quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp tìm hiểu quy trình phát hiện enterobacter sakazakii trong sữa bột, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp cụ thể cho vấn đề .

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Vi Sinh Vật
• Đề tài: Quy Trình Phát Hiện Enterobacter Sakazakii Trong Sữa Bột
• Loại tài liệu: Khóa Luận

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Nội dung nghiên cứu
• 1.2. Mục đích
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
• 2.1. Giá trị dinh dưỡng của sữa bột
• 2.1.1. Đường lactose
• 2.1.2. Protein - Casein
• 2.1.3. Các protein khác
• 2.1.4. Enzyme
• 2.1.5. Chất béo
• 2.2. Chất khoáng
• 2.3. Vitamin
• 2.4. Các hợp chất khác
• 2.5. Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột
• 2.5.1. Giới thiệu
• 2.5.2. Phân loại
• 2.5.3. Hình thái, cấu trúc
• 2.5.4. Yếu tố độc lực
• 2.5.5. Khả năng gây bệnh
• 2.5.6. Các thực phẩm liên quan
• 2.6. Giới thiệu Escherichia coli
• 2.6.1. Phân loại
• 2.6.2. Hình thái, cấu trúc
• 2.6.3. Khả năng gây bệnh
• 2.6.4. Các thực phẩm liên quan
• 2.7. Tổng quan về Enterobacter sakazakii
• 2.7.1. Lịch sử phát hiện
• 2.7.2. Phân loại
• 3. CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII
• 3.1. Phương pháp truyền thống
• 3.1.1. Môi trường nuôi cấy
• 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ
• 3.1.3. Chuẩn bị mẫu thử
• 3.1.4. Quy trình phân tích
• 3.1.4.1. Cách tiến hành
• 3.1.4.2. Phần mẫu thử
• 3.1.4.3. Tiền tăng sinh
• 3.1.4.4. Tăng sinh chọn lọc
• 3.1.4.5. Phân lập Enterobacter sakazakii giả định
• 3.1.4.6. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar
• 3.1.4.7. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey
• 3.1.4.8. Khẳng định sinh hóa
• 3.1.5. Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa
• 3.1.6. Phép thử Oxydase
• 3.1.7. Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase
• 3.1.8. Phép thử L-arginin dihydrolase
• 3.1.9. Phép thử lên men các loại đường khác nhau
• 3.1.10. Phép thử chỉ sử dụng Citrate
• 3.1.11. Thử nghiệm Nitrate
• 3.1.12. Thử nghiệm ONPG
• 3.1.13. Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm
• 3.1.14. Thử nghiệm VP (voges-proskauer)
• 3.2. Các phương pháp hiện đại
• 3.2.1. Phương pháp PCR
• 3.2.1.1. Lịch sử phát triển
• 3.2.1.2. Các thành phần tham gia vào quá trình PCR
• 3.2.1.3. Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR
• 3.2.2. Phương pháp real time PCR
• 3.2.2.1. Lịch sử phát triển
• 3.2.2.2. Khái niệm và nguyên lí hoạt động
• 3.2.2.3. Phương pháp tiến hành
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột

Quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột là một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực an toàn thực phẩm. Vi khuẩn này có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng như viêm màng não và viêm ruột hoại tử, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh. Việc phát hiện sớm và chính xác Enterobacter sakazakii là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Bài viết này sẽ trình bày tổng quan về quy trình phát hiện vi khuẩn này, từ các phương pháp truyền thống đến hiện đại.

1.1. Tầm quan trọng của việc phát hiện Enterobacter sakazakii

Việc phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột là rất quan trọng để ngăn ngừa ngộ độc thực phẩm. Vi khuẩn này có thể gây ra các bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là ở trẻ sơ sinh. Tỷ lệ tử vong do nhiễm E. sakazakii có thể lên đến 40-80% trong trường hợp viêm màng não.

1.2. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn trong sữa bột

Có nhiều phương pháp để phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột, bao gồm phương pháp truyền thống và hiện đại. Phương pháp truyền thống thường sử dụng môi trường nuôi cấy, trong khi phương pháp hiện đại như PCR cho kết quả nhanh và chính xác hơn.

II. Vấn đề và thách thức trong phát hiện Enterobacter sakazakii

Mặc dù có nhiều phương pháp để phát hiện Enterobacter sakazakii, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong quy trình này. Các yếu tố như môi trường nuôi cấy, thời gian và điều kiện bảo quản mẫu có thể ảnh hưởng đến kết quả phát hiện. Ngoài ra, việc phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa bột cũng gặp khó khăn do sự hiện diện của các vi sinh vật khác.

2.1. Những khó khăn trong việc phân lập vi khuẩn

Phân lập Enterobacter sakazakii từ sữa bột có thể gặp khó khăn do sự cạnh tranh từ các vi sinh vật khác. Điều này đòi hỏi các kỹ thuật nuôi cấy chọn lọc và điều kiện nuôi cấy phù hợp để đảm bảo vi khuẩn này có thể phát triển.

2.2. Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu

Điều kiện bảo quản mẫu sữa bột có thể ảnh hưởng đến khả năng phát hiện Enterobacter sakazakii. Nhiệt độ và độ ẩm không phù hợp có thể làm giảm số lượng vi khuẩn, dẫn đến kết quả âm tính giả.

III. Phương pháp truyền thống trong phát hiện Enterobacter sakazakii

Phương pháp truyền thống để phát hiện Enterobacter sakazakii thường bao gồm việc sử dụng môi trường nuôi cấy như Brilliance Enterobacter sakazakii Agar và MacConkey agar. Các phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi và có thể cho kết quả đáng tin cậy nếu được thực hiện đúng cách.

3.1. Môi trường nuôi cấy truyền thống

Môi trường nuôi cấy như Brilliance Enterobacter sakazakii Agar được thiết kế đặc biệt để phân lập E. sakazakii. Môi trường này giúp phát hiện vi khuẩn qua sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc.

3.2. Quy trình phân lập vi khuẩn

Quy trình phân lập Enterobacter sakazakii bao gồm các bước như chuẩn bị mẫu thử, tiền tăng sinh và phân lập vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác.

IV. Phương pháp hiện đại trong phát hiện Enterobacter sakazakii

Phương pháp hiện đại như PCR (Polymerase Chain Reaction) đã cách mạng hóa quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii. Phương pháp này cho phép phát hiện vi khuẩn với độ nhạy và độ chính xác cao hơn so với các phương pháp truyền thống.

4.1. Nguyên lý hoạt động của PCR

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản DNA của Enterobacter sakazakii. Kỹ thuật này giúp phát hiện vi khuẩn ngay cả khi số lượng vi khuẩn trong mẫu rất thấp.

4.2. Lợi ích của phương pháp PCR

Phương pháp PCR không chỉ nhanh chóng mà còn cho kết quả chính xác, giúp phát hiện Enterobacter sakazakii trong thời gian ngắn. Điều này rất quan trọng trong việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm.

V. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu về Enterobacter sakazakii

Nghiên cứu về Enterobacter sakazakii đã chỉ ra rằng việc phát hiện và kiểm soát vi khuẩn này trong sữa bột là rất cần thiết. Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc áp dụng các phương pháp phát hiện hiện đại có thể giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn trong thực phẩm.

5.1. Kết quả nghiên cứu về sự nhiễm khuẩn

Nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ nhiễm Enterobacter sakazakii trong sữa bột có thể lên đến 10%. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng thực phẩm.

5.2. Ứng dụng các phương pháp phát hiện mới

Việc áp dụng các phương pháp phát hiện mới như PCR đã giúp nâng cao khả năng phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột, từ đó bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

VI. Kết luận và tương lai của quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii

Quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột đang ngày càng được cải thiện nhờ vào sự phát triển của công nghệ. Tương lai của quy trình này hứa hẹn sẽ mang lại những phương pháp phát hiện nhanh chóng và chính xác hơn, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

6.1. Tương lai của nghiên cứu về Enterobacter sakazakii

Nghiên cứu về Enterobacter sakazakii sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu phát triển các phương pháp phát hiện mới và hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn trong thực phẩm.

6.2. Tầm quan trọng của an toàn thực phẩm

An toàn thực phẩm là một vấn đề quan trọng trong xã hội hiện đại. Việc phát hiện và kiểm soát Enterobacter sakazakii trong sữa bột là một phần không thể thiếu trong nỗ lực bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật trên thế giới cũng như tại Việt Nam diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng. Mặc dù đã có nhiều cảnh báo y tế và biện pháp phòng ngừa, các vụ ngộ độc thực phẩm tập thể nguy hiểm vẫn liên tục xảy ra, đe dọa trực tiếp đến tính mạng con người. Trong số các tác nhân sinh học đường ruột, vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân hàng đầu gây nên các bệnh lý nhiễm trùng cấp tính nguy hiểm ở trẻ nhỏ, đặc biệt là viêm màng não và viêm ruột hoại tử, để lại nhiều di chứng thần kinh vĩnh viễn hoặc dẫn đến tử vong. Dữ liệu dịch tễ học ghi nhận tỷ lệ tử vong do Enterobacter sakazakii gây ra ở bệnh viêm màng não dao động từ 40% đến 80%, và ở bệnh viêm ruột hoại tử là từ 10% đến 55%. Con đường lây nhiễm phổ biến và nguy hiểm nhất của chủng vi khuẩn này được xác định là qua việc sử dụng các sản phẩm sữa bột công thức dành cho trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn.

Xuất phát từ thực trạng trên, tác giả thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: "Qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột" nhằm hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học và phương pháp kiểm nghiệm đối với vi sinh vật này.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm:

1. Tìm hiểu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Enterobacter sakazakii.
2. Xây dựng và hệ thống hóa quy trình phân lập, phát hiện Enterobacter sakazakii trong nền mẫu sữa bột.

Nhiệm vụ nghiên cứu được phân chia thành ba nội dung chính:

1. Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy vi sinh vật hiện diện trong sữa bột;
2. Tìm hiểu tổng quan về vi khuẩn Enterobacter sakazakii (đặc điểm hình thái, phân loại, yếu tố độc lực, khả năng gây bệnh và tình hình dịch tễ);
3. Khảo sát các quy trình phân lập và phát hiện Enterobacter sakazakii bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống kết hợp thử nghiệm sinh hóa và các phương pháp sinh học phân tử hiện đại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Enterobacter sakazakii (hiện nay được đề xuất phân loại thuộc chi mới Cronobacter spp.) và các chỉ tiêu vi sinh vật liên quan trong sản phẩm sữa bột.
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung vào thành phần dinh dưỡng của sữa bột, cơ chế sinh học, các vụ dịch tễ nhiễm khuẩn trên thế giới và tại Việt Nam; phạm vi kỹ thuật kiểm nghiệm bao quát từ phương pháp chuẩn thức theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 6400, TCVN 6263, TCVN 7850:2008) đến các kỹ thuật sinh học phân tử gồm phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) và Real-time PCR.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết vi sinh vật học thực phẩm, an toàn vệ sinh thực phẩm và sinh học phân tử:

• Khung lý thuyết phân loại học vi khuẩn: Hệ thống phân loại vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae; các nghiên cứu định danh vi khuẩn của Urmenyi, Franklin (1958), Riichi Sakazakii (1980) và công trình đề xuất phân loại chi mới Cronobacter spp. của Iversen và cộng sự dựa trên kỹ thuật f-AFLP, giải trình tự gen 16S rRNA cùng phương pháp lai phân tử DNA-DNA.
• Khung pháp lý và tiêu chuẩn kỹ thuật:
  • Cảnh báo an toàn thực phẩm từ Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA), Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO), Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) Việt Nam.
  • Hệ thống tiêu chuẩn kiểm nghiệm quốc gia: TCVN 6400 (quy trình và dụng cụ lấy mẫu sữa, sản phẩm sữa); TCVN 6263 (kỹ thuật chuẩn bị mẫu thử và pha loãng thập phân); TCVN 7850:2008 (quy trình chuẩn phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột).
• Phương pháp nghiên cứu:
  • Phương pháp phân tích, tổng hợp tài liệu chuyên khảo: Thu thập, đối chiếu và tổng hợp các nghiên cứu khoa học trong nước và quốc tế về dinh dưỡng sữa, cơ chế nhiễm khuẩn, cấu trúc thành tế bào và màng sinh học vi khuẩn.
  • Phương pháp phân tích vi sinh truyền thống: Mô tả thực nghiệm quy trình tăng sinh (môi trường BPW, mLST/vancomyxin), phân lập trên môi trường chọn lọc sinh màu (thạch ESIATM, Brilliance Enterobacter sakazakii Agar, MacConkey), làm sạch khuẩn lạc trên thạch TSA và định danh bằng chuỗi phản ứng sinh hóa đặc hiệu.
  • Phương pháp sinh học phân tử: Hệ thống hóa nguyên lý khuếch đại gen in vitro bằng kỹ thuật PCR cổ điển và kỹ thuật Real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang Taqman-probe nhắm vào trình tự gen đích OmpA.
• Nguồn dữ liệu: Dữ liệu công bố từ FDA, FAO, WHO, Tổng Cục Kiểm tra Chất lượng và Kiểm dịch Trung Quốc, Viện Kiểm nghiệm ATVSTP, các tiêu chuẩn TCVN và tài liệu chuyên ngành vi sinh vật học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương mở đầu tập trung nêu bật tính cấp thiết của vấn đề kiểm soát an toàn vi sinh trong sữa bột. Tác giả khẳng định sữa bột là nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho trẻ sơ sinh nhưng cũng là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển nếu quá trình chế biến và bảo quản không đảm bảo vô trùng. Chương này xác định rõ mục đích nghiên cứu là tìm hiểu toàn diện về chủng vi khuẩn Enterobacter sakazakii và xây dựng quy trình phân lập, phát hiện trong sữa bột, đồng thời phân định cụ thể ba nội dung nghiên cứu làm kim chỉ nam cho các chương tiếp theo.

Chương 2: Tổng quan

Chương 2 trình bày chi tiết ba nhóm nội dung nền tảng: giá trị dinh dưỡng của sữa bột, các vi sinh vật gây hại điển hình và tổng quan sinh học về Enterobacter sakazakii.

Về giá trị dinh dưỡng, tác giả phân tích các thành phần hóa học chính:

• Glucid: Chủ yếu là đường lactose (trung bình 50g/lít sữa), tồn tại ở dạng $\alpha$-lactose monohydrat ($C_{12}H_{22}O_{11}\cdot H_2O$) và $\beta$-lactose khan ($C_{12}H_{22}O_{11}$). Hàm lượng lactose trong sữa bột thông thường đạt 78,0g/100g bột, sữa bột tách kem là 52,9g/100g và sữa bột cho trẻ sơ sinh là 50,9g/100g.
• Protein: Chiếm khoảng 26g/lít sữa, trong đó casein chiếm gần 80% tổng lượng protein, tồn tại dưới dạng micelle hình cầu kích thước 40-200 µm chứa 65% nước cùng khoáng chất. Các protein hòa tan gồm albumin (0,4%), globulin (0,2%), các kháng thể đường ruột (IgG chiếm tỷ lệ cao nhất, IgM, IgA), serum-albumin cùng hệ enzyme phong phú (lactoperoxidase, catalase, lipase, protease).
• Lipid: Chiếm từ 2,5% đến 6,0% (ở sữa bò trung bình khoảng 3,9%), gồm hơn 20 loại acid béo (2/3 là acid béo no). Trong đó, lipid đơn giản chiếm 98,5% tổng khối lượng chất béo (triglyceride chiếm 95-96%, diglyceride chiếm 2-3%, monoglyceride 0,1%, cholesteride 0,03%, ceride 0,02%) và phospholipid chiếm khoảng 0,7g/lít sữa.

Thành phần chất khoáng	Khối lượng / 100g sữa bột	Thành phần vitamin	Khối lượng / 100g sữa bột
Natri	560,0 mg	Vitamin A	0,3 mg
Muối	1426,9 mg	Vitamin D	0,001 mg
Kali	1710,0 mg	Vitamin E	1,4 mg
Magiê	126,0 mg	Vitamin B1	0,4 mg
Canxi	1360,0 mg	Vitamin B2	1,7 mg
Photpho	980,0 mg	Vitamin B3	1,0 mg
Kẽm	0,4 mg	Vitamin B5	3,0 mg
Iốt	130,0 µg	Vitamin B6	0,005 mg
Selen	20,0 µg	Vitamin B12	0,5 mg
		Vitamin C	20,0 mg
		Vitamin H	0,04 mg
		Vitamin M	0,05 mg

Về các vi sinh vật gây hại trong sữa bột, tác giả phân tích hai đối tượng vi khuẩn đối chứng nguy hiểm:

• Listeria monocytogenes: Vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kị khí tùy nghi, phát triển ở dải nhiệt độ 3-45°C, catalase dương tính, oxidase âm tính, sinh hemolysin beta làm tan máu. Độc lực gắn liền với khả năng phá vỡ hệ thống sumoylation của tế bào chủ và kích thích đại thực bào giải phóng interferon $\alpha\beta$ (IFN-$\alpha\beta$), gây tỷ lệ tử vong 20-30%.
• Escherichia coli: Trực khuẩn Gram âm, kích thước 0,5 µm $\times$ 1-3 µm, di động bằng tiên mao, phát triển ở 7-50°C (tối ưu 37°C), có giá trị D ở 60°C là 0,1 phút. Vi khuẩn sinh nội độc tố và ngoại độc tố, bám dính vào niêm mạc ruột qua các yếu tố F4, F5, F6, F41 gây tiêu chảy ra máu và nhiễm trùng huyết.

Về Enterobacter sakazakii, chương tổng quan làm rõ:

• Lịch sử và phân loại: Phát hiện lần đầu năm 1958 tại Anh, định danh chính thức loài mới vào năm 1980 bởi Riichi Sakazakii dựa trên lai tạo DNA-DNA cho thấy 53-54% độ tương đồng giữa chi Enterobacter và Citrobacter. Sau đó, Iversen và cộng sự nghiên cứu trên 210 chủng đã đề xuất chi mới Cronobacter spp.
• Đặc tính sinh học: Trực khuẩn Gram âm thuộc nhóm Coliform, dài khoảng 3 µm, không sinh bào tử, kị khí tùy nghi, di động bằng tiên mao peritrichous. Dải nhiệt độ phát triển từ 5,5-8°C đến 45-46°C (tối ưu 37-43°C), pH từ 3,89 đến 9,0. Thời gian thế hệ ở 10°C là 4-6 giờ và rút ngắn xuống 40 phút ở nhiệt độ phòng. Vi khuẩn có khả năng chịu khô hạn vượt bậc nhờ tích tụ trehalose nội bào.
• Cấu trúc: Vách tế bào Gram âm phức tạp với lớp peptidoglycan mỏng và màng ngoài dày 8-10 nm chứa lipopolysaccharide (Lipid A, kháng nguyên O) cùng các protein kênh xuyên màng porin. Hệ thống tiên mao gồm sợi protein flagellin (30.000-60.000 Da) gắn với thể gốc 4 vòng nhẫn L, P, S, M. Quá trình tạo màng sinh học trải qua 5 bước: tế bào tham gia tạo màng, kết dính cố định, trưởng thành giai đoạn 1, trưởng thành giai đoạn 2 và phát tán màng sinh học.
• Độc lực và dịch tễ: Liều gây nhiễm rất thấp, chỉ khoảng 1000 tế bào hoặc dưới 3 CFU/100g sữa bột cho trẻ em đã có thể gây bệnh. Năm 1994, tại Pháp ghi nhận 17 trẻ sơ sinh nhiễm bệnh trong khu chăm sóc đặc biệt (7 ca viêm ruột hoại tử, 1 ca nhiễm trùng máu, 1 ca viêm màng não). Trung Quốc từng công bố danh sách 852 sản phẩm bị cấm lưu hành và thu hồi 9.624 tấn sữa bột của công ty Wei Quan (Đài Loan) cùng sữa Pauls của công ty Parmalat (Australia) do nhiễm Enterobacter sakazakii. Tại Việt Nam, vi khuẩn này hiếm gặp và chưa có ca công bố chính thức, do đó Cục ATVSTP chưa đưa vào danh mục bắt buộc giám sát thường quy.

Chương 3: Các phương pháp phát hiện Enterobacter sakazakii

Chương 3 là phần trọng tâm về kỹ thuật của khóa luận, mô tả tường tận hai hướng tiếp cận phân tích:

1. Phương pháp truyền thống theo TCVN 7850:2008:

• Công tác lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Tuân thủ TCVN 6400 (lấy tối thiểu 100g mẫu bằng ống xăm vô trùng, dụng cụ khử trùng bằng tủ sấy 170-175°C trong 2 giờ hoặc hấp tiệt trùng 121°C trong 20 phút) và TCVN 6263 (hòa tan 10g mẫu trong 90ml dung dịch pha loãng ở 45°C, lắc 25 lần với biên độ 300mm trong 7 giây).
• Quy trình phân tích 4 bước:
  • Bước 1 (Tiền tăng sinh): Cân x gam mẫu vào thể tích môi trường nước đệm pepton (BPW) gấp 9 lần, ủ ở 37°C trong 18-22 giờ để phục hồi các tế bào vi khuẩn bị tổn thương.
  • Bước 2 (Tăng sinh chọn lọc): Chuyển 0,1 ml dịch nuôi cấy BPW vào 10 ml canh thang vancomyxin/mLST (tryptoza lauryl sulfat cải biến), ủ ở 44°C trong 24 giờ để ức chế tạp khuẩn.
  • Bước 3 (Phân lập trên thạch sinh màu chọn lọc): Cấy ria một vòng dịch cấy (khoảng 0,1 µl) lên đĩa thạch ESIATM, ủ ở 44°C trong 24 giờ. Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii điển hình có màu xanh lục đến xanh lam, đường kính 1-3 mm.
  • Bước 4 (Khẳng định): Chọn 1 đến 5 khuẩn lạc điển hình cấy vạch lên thạch đậu tương trypton (TSA), ủ ở 25°C từ 44 đến 48 giờ để quan sát khả năng sinh sắc tố màu vàng đặc trưng.

Bên cạnh đó, tác giả phân tích hai môi trường phân lập khác:

• Môi trường Brilliance Enterobacter sakazakii Agar: Dựa trên phản ứng enzyme $\alpha$-glucosidase thủy phân cơ chất chromogenic 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-$\alpha$-D-glucopyranoside tạo khuẩn lạc màu xanh lá cây; muối mật desoxycholate ức chế vi khuẩn Gram dương; phân biệt với Proteus spp. (mọc khuẩn lạc xám do sinh $H_2S$ tạo ferrous sulphide).
• Môi trường thạch MacConkey: Phân biệt dựa trên khả năng lên men lactose; vi khuẩn lên men lactose tạo khuẩn lạc màu hồng hoặc đỏ mận sau 18-24 giờ ở 35-37°C.

Hệ thống thử nghiệm sinh hóa khẳng định được trình bày chi tiết về nguyên tắc và kết quả:

Tên phép thử sinh hóa	Nguyên tắc / Cơ chất	Kết quả ở Enterobacter sakazakii
Thử nghiệm Oxidase	Phản ứng oxy hóa cytochrome c oxidase trên giấy lọc ẩm	Âm tính (-) (giấy lọc không chuyển màu tím/xanh đậm)
Decarboxylase (Lysin)	Khả năng khử carboxyl của amino acid L-lysin	Âm tính (-) (ống nghiệm giữ màu vàng)
Decarboxylase (Ornithin)	Khả năng khử carboxyl của amino acid L-ornithin	Dương tính (+) (ống nghiệm chuyển màu tím)
Dihydrolase (Arginin)	Thủy phân và khử amin amino acid L-arginin	Dương tính (+) (ống nghiệm chuyển màu tím)
Lên men Hydrat Carbon	Lên men các loại đường sinh acid và hơi	Dương tính (+) với glucose, lactose; Âm tính (-) với sorbitol
Phép thử Simmons Citrate	Sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất	Dương tính (+) (môi trường thạch nghiêng chuyển sang màu xanh lam)
Thử nghiệm Nitrate	Enzyme nitratase khử nitrate ($NO_3^-$) thành nitrite ($NO_2^-$)	Dương tính (+) (xuất hiện màu hồng đỏ với thuốc thử sulphanilamide)
Thử nghiệm ONPG	Thủy phân o-nitrophenyl-$\beta$-D-galactopyranoside bằng $\beta$-galactosidase	Dương tính (+) (ống nghiệm chuyển sang màu vàng)
Tính di động trên thạch mềm	Sự di chuyển qua môi trường thạch mềm 0,5% agar	Dương tính (+) (mọc lan khỏi đường cấy, làm đục môi trường)
Thử nghiệm Voges-Proskauer	Oxy hóa acetoin thành diacetyl phản ứng với naphthol và KOH	Dương tính (+) (xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường)

2. Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại:

• Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR): Dựa trên nguyên lý phát minh năm 1985 của Kary Mullis, thực hiện nhân bản in vitro đoạn DNA đích qua 3 bước chu kỳ: biến tính tách chuỗi, bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi nhờ DNA polymerase. Các thành phần phản ứng gồm: DNA khuôn, cặp mồi xuôi và mồi ngược (kích thước 18-25 nucleotide, khoảng cách khuếch đại dưới 1 kb), hỗn hợp dNTP nồng độ 200 µM, enzyme Taq polymerase (1-2 đơn vị cho 25 µl phản ứng) và hệ đệm đệm chứa $KCl$, $MgCl_2$ và Tris.
• Phản ứng Real-time PCR: Khảo sát tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu dò Taqman-probe liên kết đặc hiệu trên trình tự gen OmpA (outer membrane protein A) của Enterobacter sakazakii, đọc kết quả tự động trên hệ thống máy Real-time 7500. Phương pháp này khắc phục nhược điểm kéo dài thời gian của phương pháp nuôi cấy truyền thống, hạn chế nhiễm chéo và mang lại độ nhạy cùng độ chính xác cao.

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương 4 đúc kết các phát hiện then chốt: vi khuẩn Enterobacter sakazakii là tác nhân sinh học có độc lực nguy hiểm, có sức đề kháng cao trong môi trường khô hạn của sữa bột và đe dọa nghiêm trọng tính mạng của trẻ nhỏ. Tác giả kết luận quy trình nuôi cấy vi sinh theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7850:2008 là phương pháp tin cậy, chuẩn mực nhưng mất nhiều thời gian (4-5 ngày); trong khi kỹ thuật Real-time PCR nhắm vào gen OmpA là hướng đi hiện đại, rút ngắn thời gian phân tích và có độ nhạy vượt trội.

Các kiến nghị được tác giả đề xuất gồm:

• Đối với người tiêu dùng và cơ sở y tế: Thực hiện nghiêm ngặt vệ sinh dụng cụ pha sữa bằng nước sôi; nhiệt độ nước pha sữa bột phải đạt tối thiểu từ 70°C đến 72°C để bất hoạt vi khuẩn; sữa sau khi pha không được để quá 4 giờ ở nhiệt độ phòng.
• Đối với nhà máy sản xuất: Kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và độ ẩm tại khu vực sấy bột và máy trộn (nơi vi khuẩn có thể tồn tại ở nhiệt độ 45-46°C); tăng cường vệ sinh dây chuyền đóng gói.
• Đối với cơ quan quản lý: Đề nghị Cục ATVSTP sớm bổ sung chỉ tiêu kiểm nghiệm Enterobacter sakazakii vào quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh lưu hành tại Việt Nam.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp và trích xuất các kết quả định lượng cụ thể:

• Xác định môi trường cơ chất tối ưu trong sữa bột thúc đẩy vi sinh vật tồn tại: cung cấp 50,9-78,0g lactose/100g bột, 26g/lít protein với 80% casein và hệ khoáng chất, vitamin phong phú.
• Hệ thống hóa các thông số sinh học sinh tồn của Enterobacter sakazakii: phát triển trong dải nhiệt độ rộng 5,5-46°C, pH 3,89-9,0; thời gian nhân đôi 40 phút ở nhiệt độ phòng và sống sót trong điều kiện thiếu nước nhờ tích lũy trehalose; liều gây nhiễm cực thấp chỉ dưới 3 CFU/100g sữa bột hoặc 1000 tế bào vi khuẩn.
• Xác lập bảng dữ liệu sinh hóa chuẩn xác nhận diện Enterobacter sakazakii: Oxidase (-), Catalase (+), VP (+), ONPG (+), Di động (+), Simmons Citrate (+), Arginin (+), Ornithin (+), Lysin (-), Sorbitol (-).
• So sánh các giải pháp kỹ thuật kiểm nghiệm: Làm rõ quy trình nuôi cấy 4 bước theo TCVN 7850:2008 sử dụng thạch ESIATM kết hợp khẳng định sắc tố vàng trên TSA, đồng thời xác lập thông số kỹ thuật cho kỹ thuật PCR và Real-time PCR trên gen chỉ thị OmpA.

Đóng góp của khóa luận thể hiện ở việc hệ thống hóa toàn diện các căn cứ khoa học từ dịch tễ, độc lực, cơ chế sinh học phân tử đến các hướng dẫn kỹ thuật kiểm nghiệm chuẩn thức. Khóa luận cung cấp tài liệu kỹ thuật có tính đối chiếu cao giữa phương pháp vi sinh truyền thống và phương pháp khuếch đại gen hiện đại trong bối cảnh vi khuẩn này chưa được định danh kiểm soát bắt buộc tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận là công trình tổng quan lý thuyết và hệ thống hóa quy trình kỹ thuật dựa trên các công bố khoa học và tiêu chuẩn sẵn có, chưa triển khai lấy mẫu thực địa và phân tích thực nghiệm trên các lô sữa bột thực tế đang lưu thông trên thị trường Việt Nam. Do đó, khóa luận chưa cung cấp số liệu thống kê cụ thể về tỷ lệ nhiễm thực tế của chủng khuẩn này tại các cơ sở sản xuất và phân phối trong nước. Ngoài ra, tác giả chưa tiến hành các thử nghiệm đối chứng trực tiếp trong phòng thí nghiệm để đánh giá giới hạn phát hiện (LOD) và chi phí thực tế giữa phương pháp TCVN 7850:2008 và phương pháp Real-time PCR.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định là:

• Triển khai thu thập các mẫu sữa bột nội địa và sữa nhập khẩu trên thị trường Việt Nam để tiến hành phân lập, định danh thực nghiệm theo đúng quy trình TCVN 7850:2008;
• Thiết lập quy trình Real-time PCR đa mồi (multiplex Real-time PCR) trên hệ máy 7500 nhằm đồng thời phát hiện gen định danh loài OmpA và các gen quy định độc lực enterotoxin của vi khuẩn trực tiếp trên nền mẫu sữa bột mà không cần qua bước nuôi cấy tăng sinh kéo dài.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên, học viên cao học thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm, Đảm bảo chất lượng và An toàn thực phẩm, Vi sinh vật học ứng dụng và Dinh dưỡng học;
• Kỹ thuật viên kiểm nghiệm vi sinh tại các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025, các trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng và viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm;
• Cán bộ quản lý chất lượng (QA/QC) và R&D tại các nhà máy sản xuất, chế biến và đóng gói sữa bột, thức ăn công thức cho trẻ em.

Phần đáng tham khảo nhất trong khóa luận là Chương 3, đặc biệt là các mô tả chi tiết về thao tác chuẩn bị mẫu vô trùng theo TCVN 6400, TCVN 6263, quy trình tăng sinh chọn lọc trên môi trường vancomyxin/mLST, cơ chế đổi màu chỉ thị trên các loại thạch chuyên dụng (ESIATM, Brilliance Enterobacter sakazakii Agar) và chuỗi thử nghiệm sinh hóa phân biệt họ Enterobacteriaceae.

Câu hỏi thường gặp

1. Vi khuẩn Enterobacter sakazakii gây ra những bệnh lý nguy hiểm nào ở trẻ em và tỷ lệ tử vong được ghi nhận là bao nhiêu?
Vi khuẩn là tác nhân trực tiếp gây ra viêm màng não và viêm ruột hoại tử ở trẻ sơ sinh, đặc biệt là trẻ sinh non dưới 2,5 kg và dưới 1 tháng tuổi. Tỷ lệ tử vong do vi khuẩn này gây ra trong các ca viêm màng não là từ 40% đến 80%, và trong các ca viêm ruột hoại tử là từ 10% đến 55%, người bệnh sống sót thường chịu di chứng nặng nề như não úng thủy hoặc chậm phát triển trí tuệ.

2. Khả năng sống sót và chịu đựng khô hạn kéo dài của Enterobacter sakazakii trong sữa bột xuất phát từ cơ chế sinh học nào?
Khả năng chịu khô hạn và áp suất thẩm thấu cao của vi khuẩn gắn liền với cơ chế tích lũy nồng độ cao trehalose trong tế bào. Trehalose là hợp chất có khả năng giữ nước mạnh, giúp bảo vệ cấu trúc màng và protein nội bào, giúp vi khuẩn sống sót trong điều kiện môi trường bột sữa có hoạt độ nước rất thấp và thiết bị sấy ở nhiệt độ lên đến 45-46°C.

3. Quy trình phát hiện Enterobacter sakazakii theo TCVN 7850:2008 gồm những bước nuôi cấy cơ bản nào?
Quy trình gồm 4 giai đoạn chính: Tiền tăng sinh mẫu trong môi trường BPW ở 37°C trong 18-22 giờ; Tăng sinh chọn lọc bằng cách chuyển 0,1 ml dịch BPW vào 10 ml canh thang vancomyxin/mLST ủ ở 44°C trong 24 giờ; Phân lập chọn lọc trên đĩa thạch ESIATM ủ ở 44°C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc màu xanh lục (kích thước 1-3 mm); và Khẳng định bằng cách cấy truyền khuẩn lạc lên thạch TSA ủ ở 25°C trong 44-48 giờ để quan sát sắc tố màu vàng, sau đó tiến hành các phép thử sinh hóa.

4. Kết quả của các thử nghiệm sinh hóa Oxidase, ONPG và Voges-Proskauer đối với Enterobacter sakazakii là gì?
Phép thử Oxidase cho kết quả âm tính (giấy lọc không đổi màu tím đậm); phép thử ONPG cho kết quả dương tính (môi trường chuyển màu vàng do enzyme $\beta$-galactosidase thủy phân cơ chất); và phép thử Voges-Proskauer (MR-VP) cho kết quả dương tính (bề mặt môi trường xuất hiện màu đỏ với thuốc thử Koblentz do oxy hóa acetoin thành diacetyl).

5. Đoạn gen nào được sử dụng làm mục tiêu khuếch đại trong phương pháp Real-time PCR để phát hiện Enterobacter sakazakii?
Phương pháp Real-time PCR khảo sát sự khuếch đại trên trình tự gen OmpA (mã hóa protein màng ngoài OmpA đặc thù của vi khuẩn), sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang Taqman-probe và được ghi nhận tín hiệu tự động qua hệ thống máy Real-time 7500.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hệ thống hóa cơ sở lý luận khoa học về vi khuẩn gây ngộ độc nguy hiểm Enterobacter sakazakii, làm rõ các mối nguy sinh học và tỷ lệ tử vong cao liên quan đến sữa bột dành cho trẻ nhỏ. Tác giả đã mô tả chi tiết quy trình chuẩn thức phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp vi sinh truyền thống theo tiêu chuẩn TCVN 7850:2008 qua các bước tăng sinh chọn lọc, phân lập trên môi trường sinh màu và định danh bằng chuỗi phản ứng sinh hóa. Đồng thời, công trình phân tích các nguyên lý sinh học phân tử hiện đại thông qua kỹ thuật PCR và Real-time PCR nhắm vào gen đích OmpA, mở ra giải pháp phát hiện nhanh và chính xác. Toàn bộ nội dung khóa luận là tài liệu tham khảo kỹ thuật hữu ích, cung cấp luận cứ khoa học để hoàn thiện quy chuẩn giám sát an toàn vi sinh trong ngành công nghệ chế biến sữa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng. Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra. Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong.

Trong đó Vi khuẩn Enterobacter sakazakii là nguyên nhân gây ra các bệnh như viêm màng não, viêm ruột hoại tử để lại nhiều di chứng nghiêm trọng về thần kinh và có thể gây chết người. Tỷ lệ Enterobacter sakazakii gây tử vong ở bệnh viêm màng não là 40-80% và viêm ruột hoại tử là 10-55%. Nguyên nhân lây nhiễm chủ yếu của loại vi khuẩn này là do sử dụng sữa bột bị nhiễm Enterobacter Sakazakii Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiến hành thực hiện bài khóa luận: “Qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột”. Để có cái nhìn tổng quan về vi sinh vật này 1.2 Mục đích Tìm hiểu về vi khuẩn Enterobacter sakazakii và qui trình phân lập và phát hiện E.

sakazakii trong sữa bột.3 Nội dung nghiên cứu - Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy trong sữa bột - Tìm hiểu tổng quan về E. sakazakii - Các qui trình phân lập E. sakazakii 1 CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 2.1 Giá trị dinh dưỡng của sữa bột 2.1 Đường lactose Glucid của sữa là lactose hay còn gọi là đường sữa, trung bình mỗi 1 lít sữa bột có 50g. Lactose là một disaccharide do một phân tử glucose liên kết với một phân tử galactose tạo thành, enzyme lactase phân hủy đường lactose thành monosacarit Trong sữa đường lactose tồn tại dưới 2 dạng  Dạng α-lactose mono hydrat C12H22O11H2O  Dạng β-lactose anhydrous C12H22O11 Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất thấp Bảng 2.1 khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột[1] Loại sữa bột Khối lượng lactose/100g bột Sữa bột 78.0 g Sữa bột tách kem 52,9 g Sữa bột cho trẻ sơ sinh 50,9 g 2.2 Protein - Casein Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa.

Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein hay khoảng 26 g cho 1 lít sữa. Có cấu tạo là các hạt hình cầu có kích thước 40-200 µm. Chúng tồn tại dưới dạng micelle chứa 65% là nước phần còn lại là các casein và khoáng (canxi, magie, phosphate, citrate). Là protein có tính acid vì phân tử của chúng chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic 2 - Các protein khác Protein hòa tan gồm : albumin 0,4% và globulin 0,2% bị đông tụ khi đun nóng sữa lên đến 80oc Immunoglobulin trong sữa bò có 3 loại là IgG, IgM, IgA trong đó IgG chiếm hàm lượng cao nhất, IgA có chức năng chống nhiễm trùng đường ruột Serum-albumin là protein có phân tử lượng lớn có nguồn gốc từ máu rất mẫn cảm với nhiệt độ Ngoài ra trong sữa còn có các loại protein màng, hàm lượng của chúng rất thấp - Enzyme Enzyme do tuyến vú tiết ra hoặc do vi sinh vật trong sữa tổng hợp nên.

Sự có mặt của enzyme là nguyên nhân gây ra biến đổi thành phần hóa học của sữa trong quá trình bảo quản, dẫn đến chất lượng sữa hư hỏng. Nhưng một số loại enzyme trong sữa có khả năng kháng khuẩn như lactoperoxydase, lysozyme. Hàm lượng vi sinh vật càng nhiều thì thành phần enzyme càng đa dạng, có 60 loại enzyme trong sữa Lactoperoxidase: Enzyme này xúc tác phản ứng chuyển hóa oxy từ H2O2, đến các chất oxy hóa khác Catalase: Enzyme này luôn có trong sữa do tuyến vú tiết ra, xúc tác phân hủy H2O2, thành nước và oxy tự do Lipase: enzyme quan trọng nhất trong sữa,là một glycoprotein, xúc tác thủy phân liên kết ester trong cơ chất triglyceride Protease: enzyme này xúc tác phân hủy protein. Có 2 loại protease là : protease kiềm và protease axit Ngoài ra còn có các loại enzyme khác như : phosphatase, phosphatase acid.3 Chất béo Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất của sữa.

Hàm lượng chất béo của sữa thay đổi trong một phạm vi khá rộng. Có loại sữa ít 3 béo, khoảng 3g trong 100 ml sữa, có loại sữa nhiều chất béo khoảng 5-6g trong 100 ml sữa. Đối với sữa bò hàm lượng béo khoảng 3. Thông thường, chất béo chiếm khoảng 2,5 đến 6,0% thành phần sữa, tùy thuộc vào giống bò và chế độ dinh dưỡng.

Mỡ sữa tồn tại dưới dạng hạt nhỏ lơ lửng trong nước sữa. Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid béo khác nhau, trong đó 2/3 là acid béo no và còn lại là acid béo chưa no. Trong số những acid béo trong sữa có khá nhiều acid béo dễ hòa tan trong nước (ví dụ acid caproic). Chất béo của sữa cũng dễ xảy ra những quá trình phân hủy làm thay đổi thành phần và tính chất như quá trình thủy phân, quá trình oxy hóa,… làm giảm dần chất lượng của sữa và nhiều khi làm hỏng sữa.

Ngoài chất béo thuộc nhóm lipid của sữa còn có phospholipide và một số chất khác nhưng hàm lượng không nhiều, phospholipide có khoảng 0.7g trong một lít sữa, trong đó chủ yếu là lexitin. Thành phần chất béo có trong sữa bò Hàm lượng (% so với tổng Thành phần khối lượng chất Ghi chú béo) Lypid đơn giản 98,5 Ester của acid béo và triglyceride 95-96 cholesterol Diglyceride 2-3 Ester của acid béo và Monoglycerride 0,1 rượu cao phân tử Cholesteride 0,03 Ceride 0,02 4 2. Chất khoáng Hàm lượng chất khoáng trong sữa dao động từ 8-10g/l, các chất khoáng trong sữa dạng hòa tan hoặc dung dịch dạng keo dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ và pH các muối trong sữa đều ở dạng dễ đồng hóa. Các nguyên tố chiếm hàm lượng cao nhất là Ca, P, Mg, K, Các nguyên tố khác như K, Na, Cl đóng vai trò là chất điện ly.

Và Zn, Al, I, Cu, Mn, Ag… chúng cần thiết cho quá trình dinh dưỡng của con người [1] Bảng 2. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột Thành phần Khối lương/100g Natri 560,0 mg Muối 1426,9 mg Kali 1710,0 mg Magiê 126,0 mg Canxi 1360,0 mg Photpho 980 mg Kẽm 0,4 mg Iôt 130 µg Selen 20 µg 2.Vitamin Tùy theo khả năng hòa tan trong nước hay trong chất béo ta tách vitamin trong sữa làm hai nhóm  Vitamin hòa tan trong nước: B1, B2 B3 B5 B6 , C và H…  Vitamin hòa tan trong chất béo A, D, E 5 Bảng 2. các thành phần vitamin trong sữa[1] Vitamin Mg/100g Vitamin Mg/100g A 0,3 B6 0,005 D 0,001 B3 1 E 1,4 B5 3 B1 0,4 C 20 B2 1,7 H 0,04 B12 0,5 M 0,05 2. Các hợp chất khác Trong sữa bò còn chứa các chất khí chủ yếu là CO2, O2 và N2.

Tổng hàm lượng của chúng chiếm 5-6% thể tích sữa. Hormone do các tuyến nội tiết ra và giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của động vật. Trong sữa có nhiều loại hormone được chia làm 3 nhóm: proteohormone, hormone peptide, hormone steoride.Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột 2.1 Giới thiệu Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listeriosis do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra. Nó là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nguy hiểm nhất.

với 20-30% gây các bệnh nhiễm trùng dẫn đến tử vong Ca đầu tiên bệnh Listeriosis phát hiện cách đây 70 năm, nhưng mãi đến năm 1980 mới chính thức xác nhận bệnh do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra các bệnh ngộ độc thực phẩm 2.2 Phân loại 6 Hình 2.1 Vi khuẩn Listeria monocytogenes Các vi khuẩn chi Listeria bao gồm sáu loài khác nhau (L. monocytogenes đều gây bệnh ở chuột, nhưng chỉ có L. monocytogenes luôn gắn liền với bệnh tật của con người 2. monocytogenes là vi khuẩn gram dương (+), không sinh bào tử, yếm khí, và có thể phát triển trong tế bào, có thể di chuyển thông qua các tiên mao ở nhiệt độ dưới 30oC nhưng trên 37oC thì không di chuyển được.

- Nhiệt độ phát triển Vi khuẩn L. monocytogenes có thể sống và phát triển ở nhiệt độ từ 3-45oC - Phản ứng sinh hóa Phản ứng catalase dương tính Phản ứng oxydase âm tính Tạo ra hemolysin beta gây phá hủy tế bào máu 2.4 Yếu tố độc lực Vi khuẩn L. monocytogenes có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào chủ (của bệnh nhân) và làm thay đổi một vài chức năng của tế bào trong chiều hướng có lợi cho vi khuẩn để chúng thoát khỏi hệ thống phòng vệ của cơ thể. Nhờ vào chiến thuật này, vi khuẩn có thể dễ dàng vượt qua hàng rào của vùng ruột cũng như của một số bộ phận khác trong cơ thể.

7 Nhóm khảo cứu Pháp cho biết vi khuẩn L. monocytogenes sản xuất ra một loại độc tố chuyên biệt có khả năng phá vỡ hệ thống SUMOYLATION tức là nguồn máy phòng vệ tối quan trọng của tế bào chủ. Ngày 15/2 trong tạp chí Thực nghiệm Y Khoa, tiến sĩ Laurel Lenz và đồng sự đã công bố, đại thực bào bị Listeria xâm nhiễm phóng ra interferon αβ (IFN- αβ), làm chúng và những tế bào miễn dịch lân cận không thể đáp ứng với các tín hiệu hoạt hóa. Điều này làm giảm khả năng miễn dịch với vi khuẩn, gây ra hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm và hơn 500 người chết mỗi năm ở Mỹ 2.5 Khả năng gây bệnh Bệnh do nhiễm khuẩn Listeria hay còn gọi là bệnh Listeriosis.

Đây là tình trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm một loại vi khuẩn có tên khoa học là Listeria monocytogenes. Loại vi khuẩn listeria này được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Hiện nay, chúng ta đã biết đến hai thể bệnh Listeriosis: Listeriosis khu trú ở ruột: Bệnh chỉ khu trú ở hệ thống tiêu hóa. Người bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm thường như sốt và đau mỏi cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy.

Listeriosis thể xâm nhập và lan tỏa: Sự nhiễm bệnh không tập trung tại đường tiêu hóa mà còn xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan sang cả hệ thần kinh trung ương và não bộ gây viêm màng não. Listeriosis lan tỏa là một bệnh lý khá nguy hiểm, đòi hỏi phải nhập viện ngay lập tức để được điều trị tích cực bằng các loại thuốc kháng sinh Các trường hợp dễ nhiễm bệnh là trẻ sơ sinh dưới 1 tháng tuổi, người già trên 60 tuổi, Người đang trong giai đoạn dùng các phương pháp điều trị làm suy giảm chức năng miễn dịch như hóa-xạ trị, phụ nữ mang thai 8 2.