CHƯƠNG 1. Tổng quan về thuốc diệt chuột chống đông máu Từ lâu trên thế giới, việc kiểm soát các loài gặm nhấm ở các cơ sở công nghiệp, khu dân cư được thực hiện dưới nhiều hình thức bao gồm bẫy vật lý và kiểm soát bằng hoá học. Trong đó việc kiểm soát hoá học được thực hiện bằng cách sử dụng các hợp chất kháng vitamin K, được viết tắt là AVK. Vào cuối những năm 40 của thế kỷ XX, AVK lần đầu tiên được công bố thông qua việc phát triển các dẫn xuất của WAR và dicoumarin [7].
TDC chống đông máu hoạt động theo cơ chế ức chế enzyme carboxylase phụ thuộc vitamin K và do đó làm giảm khả năng tái hoạt động của vitamin K1, ảnh hưởng gián tiếp đến quá trình đông máu sinh lý [29]. TDC chống đông máu được chia thành 2 nhóm: hydroxycoumarin và indandion (chlorophacinon, diphacinon, pindon, và valon). Hydroxycoumarin được chia thành 2 thế hệ: thế hệ 1 (coumachlor, coumafuryl, coumatetralyl, và warfarin) và thế hệ 2 (brodifacoum, bromadiolon, difenacoum, difethialon và flocoumafen) [29]. TDC chống đông máu thế hệ thứ 2 còn được gọi với các tên gọi khác nhau như: “Superwafarin”, “ Thuốc diệt chuột đơn liều”, “ Thuốc diệt chuột tác dụng kéo dài”.
Hiệu lực và thời gian tác dụng lớn hơn của TDC chống đông máu thế hệ thứ hai là do chúng : (i) ái lực với enzym khử hoá vitamin K-epoxide lớn hơn; (ii) tích tụ ở gan; và (iii) thời gian bán hủy rất dài do hòa tan tốt trong lipid và tuần hoàn gan ruột [31]. Những năm gần đây, TDC chứa superwafarin được sử dụng rộng rãi và phổ biến trên toàn thế giới, đã xảy ra rất nhiều trường hợp ngộ độc superwafarin. Vì vậy một phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chính xác cao để xác định TDC chống đông máu là hết sức quan trọng. Việc phân tích các hợp chất superwafarin trong mẫu máu các trường hợp ngộ độc là phù hợp vì thời gian bán huỷ của các hợp chất này dài [19].
Bên cạnh đó, trong các TDC chứa nhóm chất này, brodifacoum là hoạt chất được ghi nhận trong nhiều báo cáo là có khả năng gây độc cao nhất [17], [27], [6]. Trên thực tế, BDF ngày nay được sử dụng rộng rãi ở cả công nghiệp và hộ gia đình dưới dạng bột hoặc viên nén rắn giống viên kẹo với màu sắc cực kỳ bắt mắt, dễ gây nhầm lẫn ở người già và trẻ nhỏ. Do vậy, BDF đáng được quan tâm để xây dựng một phương pháp phân tích chính xác và có hiệu quả cao. Tổng quan về brodifacoum 1.
Sơ lược về brodifacoum Brodifacoum là TDC chống đông máu thế hệ thứ hai, là dẫn xuất của nhóm 4- hydroxy-coumarin. Theo Luật pháp của Cộng đồng châu Âu yêu cầu ghi nhãn cho các sản phẩm có chứa brodifacoum là rất độc hại với ký hiệu nguy hiểm T+. Ngoài ra, các khuyến nghị về vận chuyển hàng hóa của Liên Hợp Quốc đã phân loại brodifacoum trong nhóm 6.1 - là một chất độc (Số 3027) [24]. Công thức cấu tạo và tính chất lý hoá - Công thức phân tử: C31H23BrO3 - Công thức cấu tạo: Hình 1.
Công thức cấu tạo của brodifacoum - Danh pháp: 3-[3-[4-(4-Bromophenyl)phenyl]-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]-2- hydroxychromen-4-one - Khối lượng phân tử 523,4 g/mol[22] - BDF ở dạng bột trắng mịn, không mùi. Trong nước, ít tan trong nước( dưới 10 mg/L ở 20ºC, pH=7), tan tốt trong ethylacetat, ethanol, ít tan trong benzen. Nhiệt độ nóng chảy ở khoảng 230 - 232ºC. Dược động học của BDF.
BDF được hấp thu qua đường tiêu hoá (dạ dày và ruột) sau đó được tích tụ trong các mô như não, gan, thận, tim, phổi với nồng độ cao nhất trong gan. Nồng độ BDF trong huyết tương đạt tối đa sau 24 giờ và giảm dần trong 4 ngày tiếp theo. Từ mô hình invitro của chuyển hoá pha I và pha II cũng như thực hiện đo invivo trên mô, nước tiểu và phân khi sử dụng BDF đã không đưa ra được bằng chứng về quá trình chuyển hoá của chất này. BDF được thải trừ chủ yếu qua phân và có thời gian bán huỷ rất dài do tính ưa mỡ của BDF dẫn đến trải qua quá trình tuần hoàn gan ruột[11].
Sản phẩm thải trừ chủ yếu dưới dạng hợp chất gốc còn hoạt tính. Độc tính của BDF BDF có độc tính cao đối với động vật có vú và chim. Các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng của ngộ độc cấp tính BDF ở người là chảy máu ở mức độ nhẹ, và bị rối loạn đông máu ở mức độ nặng. Chảy máu nhẹ thường là chảy máu mũi hoặc nướu, ho ra máu, bầm máu, phân có máu, tiểu máu, đau bụng hoặc đau sườn, bầm tím hoặc tụ máu ở bụng, có thể chảy máu nặng dẫn tới sốc và tử vong.
Chảy máu bên trong và bên ngoài là những biểu hiện lâm sàng thường gặp nhất của nhiễm độc cấp tính gây ra bởi BDF, sau đó là nhịp tim nhanh, hạ huyết áp, suy đa cơ quan do mất máu và tưới máu không đủ [20]. Theo một số nghiên cứu về độc tính của BDF, LD50 của BDF trên chuột qua đường uống là 266 µg/kg [8], trên chó qua đường uống là 0,25 mg/kg và trên mèo qua đường uống là 25 mg/kg [26]. Dữ liệu về độc tính của brodifacoum với động vật thực nghiệm cũng phản ánh độc tính cao của chất này với động vật có vú nói chung và con người nói riêng. Tổng quan về phương pháp chiết BDF trong máu 1.
Xử lý mẫu Trong quá trình phân tích các mẫu dịch sinh học như máu, huyết tương, việc xử lý mẫu là vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến hiệu quả của cả quá trình phân tích. Các mẫu máu thường có rất nhiều tạp chất nên thành phần nền mẫu khá phức tạp. Điều này gây ảnh hưởng tới độ nhạy, hiệu suất phân tích và tuổi thọ của các thiết bị phân tích, vì vậy mà xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein là cực kỳ cần thiết trước khi tiến hành phân tích BDF trên hệ thống sắc ký. Phương pháp loại protein thường kết hợp sử dụng các hoá chất như acid trichloroacetic, acid mạnh như HClO4 hoặc sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetonitril để gây kết tủa protein.
Sau đó kết hợp cùng với siêu âm và ly tâm để dễ dàng loại bỏ protein khỏi mẫu phân tích. Protein kết tủa do sự thay đổi pH hoặc tính kỵ nước, làm thay đổi tương tác của protein với môi trường nước. Phương pháp chiết xuất: Các kỹ thuật thường được sử dụng để chiết xuất mẫu trước khi phân tích là: chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE). Chiết lỏng – lỏng (LLE) Chiết lỏng - lỏng là phương pháp chiết dựa trên sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau thường một pha là nước và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít hòa tan trong nước.
Quá trình chiết là quá trình chuyển 4 chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ được thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tương tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [1] Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết. Điều kiện chiết chất phân tích vào pha hữu cơ: + Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không được trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích; + Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt. + Cân bằng chiết đạt được nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết được tốt. + Phải chọn được điều kiện chiết tối ưu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia… Phương pháp LLE có thể áp dụng cho các chất chất lỏng và rắn với những ưu điểm như các thiết bị đơn giản, hiện có rất nhiều dung môi tinh khiết với độ hòa tan và chọn lọc tốt, hòa tan mẫu thuận lợi và phù hợp với thiết bị sắc ký.
BDF là một chất tan tốt trong dung môi hữu cơ như ethyl acetat, ethanol nên việc chiết trực tiếp BDF bằng LLE được nhiều tác giả sử dụng. Chiết pha rắn (SPE) Nguyên tắc của kỹ thuật này cũng tương tự với kỹ thuật chiết lỏng lỏng, cũng liên quan đến việc phân tách dung dịch giữa hai pha. Tuy nhiên thay vì phân tách giữa hai pha lỏng – lỏng như LLE thì chiết pha rắn tách chất phân tích giữa hai pha: pha rắn (chất hấp phụ) và pha lỏng (thường là dung môi và chất phân tích).[34] Cơ chế của sự chiết pha rắn có thể có các bản chất theo các kiểu như sau: - Theo cơ chế tương tác hấp phụ pha rắn - Theo cơ chế trao đổi ion (cation và anion) - Theo kiểu trao đổi tạo cặp ion. - Theo kiểu hợp chất liên hợp phân tử.
- Kiểu chiết rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn. Kỹ thuật này có quy trình chiết bao gồm 4 bước chính: xử lý cột bằng dung môi hoặc dung dịch đệm, tách chất phân tích, loại tạp, rửa giải. Cột SPE thường được sử dụng là cột HLB, C18, Bond Elut Certify II. Tổng quan sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS) là một kỹ thuật phân tích kết hợp phân tách sắc ký có độ phân giải hiệu suất cao, độ nhạy và phát hiện phổ khối cụ thể.
Sự kết hợp giữa LC với MS là một sự phát triển quan trọng trong lịch sử sắc ký (những năm 1980). [15] LC-MS cho phép sử dụng các chế độ ion hóa (ESI, PI, quang hóa được hỗ trợ bằng laser (LAPI) và APCI), cho phép tách và ion hoá nhiều loại chất phân tích dễ bay hơi và không bay hơi, bao gồm peptid, protein và các chất không bền nhiệt. Mẫu được phân tách bằng LC và các loại mẫu phân tích được phun vào nguồn ion áp suất khí quyển, nơi các chất chuyển thành ion ở pha khí. Máy phân tích khối lượng sau đó được sử dụng để sắp xếp các ion theo khối lượng và khuếch đại tín hiệu được tạo ra từ mỗi ion.
Kết quả là phổ khối (biểu đồ tín hiệu ion như là một hàm của tỷ lệ khối lượng/điện tích) được tạo ra, được sử dụng để xác định bản chất nguyên tố của một mẫu, khối lượng của các hạt và phân tử, và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của phân tử. Cấu tạo một máy sắc ký lỏng khối phổ Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng gồm các phần chính: (1) Hệ thống cấp pha động, (2) bơm sắc ký lỏng, (3) bộ phận tiêm mẫu, (4) cột sắc ký. Cấu tạo hệ thống khối phổ gồm các phần chính: (1) bộ phần nạp mẫu, (2) bộ nguồn ion, (3) bộ phân tích khối, (4) dectector, (5) bộ phận xử lý dữ liệu.