Kiểm Nghiệm Thuốc Bằng Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Chuyên khảo phân tích Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sắc ký, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: MSc. Trương Phú Chí Hiếu
• Trường học: Nhà Xuất Bản Y Học
• Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc
• Đề tài: Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao Trong Kiểm Nghiệm Thuốc
• Loại tài liệu: Tài Liệu Tham Khảo
• Năm xuất bản: 2005
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích quan trọng trong lĩnh vực dược phẩm. HPLC cho phép tách biệt và xác định các thành phần trong mẫu một cách chính xác và nhanh chóng. Kỹ thuật này dựa trên sự tương tác giữa các chất phân tích và pha tĩnh, pha động trong cột sắc ký. HPLC được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc, giúp đảm bảo chất lượng và độ an toàn của dược phẩm.

1.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của HPLC

HPLC hoạt động dựa trên nguyên tắc phân tách các chất phân tích thông qua sự tương tác với pha tĩnh và pha động. Chất phân tích có ái lực cao với pha tĩnh sẽ lưu giữ lâu hơn, trong khi chất có ái lực cao với pha động sẽ di chuyển nhanh hơn.

1.2. Lợi Ích Của HPLC Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

HPLC mang lại nhiều lợi ích trong kiểm nghiệm thuốc, bao gồm độ chính xác cao, khả năng phân tích nhiều mẫu cùng lúc và thời gian phân tích ngắn. Điều này giúp tiết kiệm thời gian và chi phí cho các phòng thí nghiệm.

II. Các Thách Thức Trong Việc Ứng Dụng HPLC

Mặc dù HPLC có nhiều ưu điểm, nhưng cũng tồn tại một số thách thức trong quá trình ứng dụng. Các vấn đề như lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp, cũng như điều chỉnh các thông số vận hành có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Việc tối ưu hóa các điều kiện này là rất quan trọng để đạt được độ chính xác và độ nhạy cao trong phân tích.

2.1. Vấn Đề Lựa Chọn Pha Tĩnh Và Pha Động

Lựa chọn pha tĩnh và pha động không phù hợp có thể dẫn đến kết quả phân tích không chính xác. Cần phải xem xét tính chất của chất phân tích để chọn lựa đúng loại pha.

2.2. Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ Và Áp Suất

Nhiệt độ và áp suất trong quá trình sắc ký có thể ảnh hưởng đến độ phân giải và thời gian lưu của các chất phân tích. Việc kiểm soát các yếu tố này là cần thiết để đảm bảo kết quả phân tích chính xác.

III. Phương Pháp Phân Tích Trong HPLC

HPLC sử dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau để tách biệt và xác định các chất trong mẫu. Các phương pháp này bao gồm sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ và sắc ký trao đổi ion. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, phù hợp với từng loại mẫu và mục đích phân tích.

3.1. Sắc Ký Phân Bố

Sắc ký phân bố là phương pháp phổ biến nhất trong HPLC, cho phép phân tích các chất có độ phân cực khác nhau. Phương pháp này giúp tách biệt các hợp chất ion và không ion.

3.2. Sắc Ký Trao Đổi Ion

Sắc ký trao đổi ion được sử dụng để phân tích các chất có tính ion hóa. Phương pháp này rất hiệu quả trong việc tách các ion và hợp chất có điện tích.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của HPLC Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

HPLC được ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc, từ phân tích định tính đến định lượng. Kỹ thuật này giúp xác định hàm lượng các hoạt chất trong dược phẩm, kiểm tra tạp chất và đảm bảo chất lượng sản phẩm. HPLC cũng được sử dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới.

4.1. Phân Tích Định Tính

Phân tích định tính bằng HPLC giúp xác định sự có mặt của các chất trong mẫu. Thời gian lưu của các chất phân tích được sử dụng để nhận diện chúng.

4.2. Phân Tích Định Lượng

Phân tích định lượng sử dụng diện tích hoặc chiều cao pic sắc ký để tính toán nồng độ của chất phân tích. Phương pháp ngoại chuẩn thường được áp dụng trong trường hợp này.

V. Kết Luận Về Tương Lai Của HPLC Trong Kiểm Nghiệm Thuốc

HPLC sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc trong tương lai. Với sự phát triển của công nghệ và các thiết bị hiện đại, HPLC sẽ ngày càng trở nên chính xác và hiệu quả hơn. Việc nghiên cứu và cải tiến các phương pháp sắc ký sẽ giúp nâng cao chất lượng và độ an toàn của dược phẩm.

5.1. Xu Hướng Phát Triển Công Nghệ HPLC

Công nghệ HPLC đang được cải tiến với các thiết bị tự động hóa và phần mềm phân tích hiện đại, giúp nâng cao độ chính xác và giảm thiểu thời gian phân tích.

5.2. Tương Lai Của HPLC Trong Nghiên Cứu Dược Phẩm

HPLC sẽ tiếp tục là công cụ quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới, giúp đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các sản phẩm dược phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MSc. Trương Phú Chí Hiếu PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO MSc. Trương Phú Chí Hiếu Mục tiêu • Hiểu được cơ sở lý thuyết sắc ký, cấu tạo cơ bản của hệ thống và các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao. • Trình bày các ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích thuốc.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Sắc ký cột thông thường Sắc ký cột Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng Sắc ký lớp mỏng Sắc ký phẳng Sắc ký giấy SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Nguyên tắc Ø HPLC = High - Performance Liquid Chromatography High - Pressure Liquid Chromatography Ø Quá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình: - Những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động. - Sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất phân tích theo từng lớp qua chất nhồi cột, từ đầu đến cuối cột tách. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Nguyên tắc Ø Các chất phân tích di chuyển theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động: - Chất phân tích có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị lưu giữ lại lâu hơn trên cột. - Chất phân tích có ái lực nhiều với pha động thì có tốc độ di chuyển nhanh, ít bị lưu giữ.

=> Xảy ra quá trình tách các chất trên cột sắc ký. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Detector ở cuối cột ghi lại sự có mặt của các chất phân tích trong pha động qua dạng các pic sắc ký (sắc ký đồ) được dùng cho phân tính định tính và định lượng SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Dựa vào kỹ thuật sắc ký: Sắc ký phân bố Sắc ký hấp phụ Sắc ký trao đổi ion Sắc ký loại trừ kích thước SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Sắc ký phân bố: - Được ứng dụng nhiều nhất vì phân tích được những chất có khoảng phân cực rộng (từ không phân cực đến rất phân cực) hoặc hợp chất ion. - Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động: Độ phân cực của chất Độ phân cực của chất phân tích gần với độ phân tích gần với độ phân cực pha tĩnh và phân cực pha động và khác xa độ phân cực khác xa độ phân cực pha động pha tĩnh SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Sắc ký phân bố: - Độ phân cực của các nhóm chức hữu cơ: Hydrocarbon mạch thẳng < olefin < hydrocarbon thơm < dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ andehyd ≈ ceton < alcol ≈ amin < sulfo < sulfoxid < acid carboxylic < nước. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Pha tĩnh: - Thường dùng silica SiO2 được xử lý bề mặt bằng cách đun nóng với acid (thủy phân) để tạo nhóm –OH OH OH OH O O Si Si Si - Tiếp tục cho phản ứng với dẫn chất hữu cơ của chlorosilan tạo ra các dẫn chất siloxan có độ phân cực phụ thuộc vào nhóm thế R CH3 CH3 Si OH Cl Si R Si O Si R CH3 CH3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Pha tĩnh: Tính phân cực tăng dần -(CH2)3-CN: -C18H37: cyanopropyl Tính không phân cực giảm dần octadecyl -(CH2)3-NH2: aminopropyl -C8H17: octyl -(CH2)2-O- CH(OH)-CH2-OH: -(CH2)n- diol C6H5: phenyl SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Phân loại Ø Pha tĩnh: - Dựa vào độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động có thể chia sắc ký phân bố thành: Sắc ký pha Sắc ký pha thuận đảo Pha tĩnh phân cực Pha tĩnh ít phân hơn pha động (R cực hơn pha động là nhóm thế phân (R là nhóm thế ít cực) phân cực) Dùng trong phân Dùng trong phân tích các hợp chất tích các hợp chất có độ phân cực từ không phân cao cực đến phân cực SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Lựa chọn kỹ thuật sắc ký Ø Dựa vào các đặc tính lý hóa của chất phân tích để lựa chọn kỹ thuật sắc ký phù hợp: - Tính tan: tan hay không tan trong nước.

- Phân tử lượng. - Tính phân cực: ion hóa hay không ion hóa. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Lựa chọn kỹ thuật sắc ký - Phân tử lượng lớn hơn 2000: sắc ký loại trừ kích thước. Pha động là nước hay dung môi hữu cơ tùy thuộc vào tính tan của chất phân tích.

- Phân tử lượng từ 2000 trở xuống: xem xét tính tan của chất phân tích: + Mẫu tan hoặc ít tan trong nước: sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký phân bố pha đảo. + Độ tan tăng thêm khi dùng acid hoặc kiềm: sắc ký trao đổi ion. + Độ tan không bị ảnh hưởng bởi acid hoặc kiềm; dung dịch nước của chất phân tích trung tính: sắc ký phân bố pha đảo. + Mẫu không tan trong nước: sắc ký phân bố pha thuận hoặc sắc ký hấp phụ + Tách các đồng phân: sắc ký hấp phụ.

+ Tách các đồng đẳng: sắc ký phân bố. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC 1. Hệ tiêm mẫu 4. Bình thải SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Pha động (bình dung môi): Cấu Một hay nhiều bình, dung tích thường từ 500 ml trở lên.

tạo Các bình được khoan lỗ ở nắp, cắm ống dẫn bằng nhựa. Vai Dung môi được dẫn từ bình đến bơm nhờ hoạt động của bơm. trò Cung cấp dung môi cho quá trình sắc ký, đưa chất phân tích di chuyển qua cột. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Pha động (bình dung môi): - Lựa chọn dung môi dựa vào độ phân cực của chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

Dung môi phân cực Nước, n-hexane, n- Dung môi không phân cực Methanol, pentane, Acetonitrile, Cyclohexane Ethanol SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Pha động (bình dung môi): - Yêu cầu kỹ thuật với dung môi: Lọc qua giấy lọc Không chứa bụi 0,45 𝛍m trước bẩn và vật lạ khi sử dụng Có đầu lọc ở đầu Loại bỏ khí hòa ống nhựa trong tan (sục khí trơ) bình dung môi SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Pha động (bình dung môi): - Chương trình trộn dung môi: + Chương trình trộn dung môi ở áp suất thấp Bình dung môi 1 Bình dung môi 2 Bộ phận trộn Bơm Van mẫu Ưu điểm: chỉ dùng một bơm, chi phí không cao. Bình dung môi 3 Nhược điểm: hệ thống ba van để lấy ba dung môi, ảnh hướng đến độ chính xác. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Pha động (bình dung môi): - Chương trình trộn dung môi: + Chương trình trộn dung môi ở áp suất cao Bình dung môi 1 Bơm 1 Bình dung môi 2 Bơm 2 Bộ phận trộn Van mẫu Ưu điểm: độ đúng và độ lặp Bình dung môi 3 Bơm 3 lại cao hơn. Nhược điểm: tốn kém hơn, hệ thống cồng kềnh hơn.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Hệ thống bơm: - Vai trò: tạo động lực để đưa pha động qua cột sắc ký với tốc độ xác định. - Yêu cầu kỹ thuật với hệ thống bơm: Áp suất Dung môi Tốc độ dòng • Chịu được • Chịu được • Lưu lượng áp suất tác động lặp lại. của nhiều • Có thể loại dung chọn lựa môi. và thay đổi dễ dàng.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Hệ thống bơm: - Các loại bơm thông dụng: Bơm đẩy liên tục: Bơm đẩy hút luân dung môi được bơm phiên: việc đẩy và đầy một lần, được đẩy bơm dung môi xảy ra đến khi hết thì dừng. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Hệ thống tiêm mẫu: - Vai trò: nạp một lượng chính xác mẫu các chất phân tích vào trong vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích nhất định (5 – 500 𝛍l), sau đó được đưa vào cột sắc ký. - Chế độ tiêm: + Tiêm thủ công bằng xy lanh. + Tiêm tự động.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Cột sắc ký: - Vai trò: tách các mẫu phân tích ra khỏi nhau. - Cấu tạo: được làm bằng vật liệu không rỉ (thép Cr – Ni – Mo) với mặt trong của cột được làm nhẵn, hoặc làm bằng thủy tinh. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Cột sắc ký: - Cột nhồi: Thông số Cột thông thường Cột tốc độ cao Chiều dài L 10-30 cm 3-7 cm Đường kính trong 4-10 mm 1-4,6 mm Kích thước hạt nhồi cột 5 hoặc 10 𝛍m 3 hoặc 5 𝛍m Số đĩa lý thuyết N 40000-60000 đĩa/m 100000 đĩa/m SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Cột sắc ký: - Cột bảo vệ: + Được đặt trước cột sắt ký để loại các chất bẩn có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích. + Có kích thước ngắn hơn cột sắc ký và được nhồi cùng loại hạt nhưng có kích thước nhỏ hơn.

+ Trải qua một số lần tiêm mẫu nhất định, khi hình dáng pic trên sắc ký đồ thay đổi, hoặc độ phân giải giảm là những dấu hiệu cho thấy cần thay cột bảo vệ. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Cột sắc ký: - Hệ thống điều nhiệt: + HPLC thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng. + Sự thay đổi nhiệt độ (dù nhỏ) cũng gây ảnh hưởng đến chất lượng của sắc ký đồ. => Các thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm bộ phận điều nhiệt, có thể giữ ổn định nhiệt độ lên tới 1500C với sai số không quá 0,050C.

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) v Cấu tạo máy HPLC Ø Detecter: - Vai trò: chuyển các tín hiệu thành dạng điện.