Tổng quan luận án

Thông đỏ (Taxus sp., họ Taxaceae) là nguồn dược liệu chứa nhóm hoạt chất chính là các diterpenoid khung taxan (taxoid), tiêu biểu là paclitaxel và tiền chất 10-deacetylbaccatin III (10-DAB) dùng để sản xuất biệt dược Taxol® cùng các dẫn xuất phục vụ điều trị các bệnh ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú và ung thư phổi. Trước đây, paclitaxel chủ yếu được khai thác từ vỏ cây Taxus brevifolia, đòi hỏi phải đốn hạ 6 đến 8 cây 100 năm tuổi mới đủ lượng hoạt chất điều trị cho một bệnh nhân, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng nguồn tài nguyên thiên nhiên. Năm 2011, Sách đỏ IUCN đã xếp Taxus wallichiana vào danh mục loài có nguy cơ tuyệt chủng. Tại Việt Nam, Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố tự nhiên rất hạn chế tại vùng núi cao tỉnh Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Khánh Hòa và Hà Giang, với số lượng ước tính trên 250 cây. Loài này được xếp vào cấp VU (sẽ nguy cấp) trong Sách đỏ Việt Nam (2007) và thuộc nhóm IA theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ (nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại).

Nhằm tạo nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu và sản xuất mà không xâm hại quần thể tự nhiên, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã tiến hành nhân giống và trồng Thông đỏ lá dài tại Lâm Đồng. Cành và lá Thông đỏ được xác định chứa hàm lượng 10-DAB cùng các taxoid khác cao hơn so với vỏ cây. Mặc dù đã có một số công trình nghiên cứu về chiết xuất và phân lập hoạt chất sinh học từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng, thành phần các hợp chất taxoid trong loài này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ để làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu. Do đó, luận án tiến sĩ dược học chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc (mã số 62720410) của nghiên cứu sinh Hứa Hoàng Oanh với đề tài "Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu" được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Phương Dung tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (năm 2020).

Luận án xác định 03 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng.
  2. Thiết lập một số chất đối chiếu được phân lập từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng phục vụ công tác kiểm nghiệm.
  3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời taxol và một số taxoid phân lập được từ lá Thông đỏ lá dài trồng ở Lâm Đồng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Lá cây Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.), thu hái vào tháng 9 năm 2012 tại Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt - Vimedimex, tỉnh Lâm Đồng (mã mẫu T9-B7). Dược liệu được TS. Võ Văn Chi định danh khoa học và lưu giữ tiêu bản tại Bộ môn Tài nguyên - Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh. Khối lượng mẫu nghiên cứu gồm 25 kg bột lá khô đã xay mịn (kích thước hạt ≤ 2 mm).
  • Phạm vi triển khai: Thực nghiệm chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc, thiết lập chất đối chiếu và thẩm định quy trình định lượng HPLC được thực hiện phối hợp tại các phòng thí nghiệm của Đại học Y Dược TP.HCM (Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Bộ môn Hóa Hữu cơ, Bộ môn Dược liệu), Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM, Viện Công nghệ hóa học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam tại TP.HCM, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM (Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Khoa Vật lý đo lường), Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam tại Hà Nội và Công ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng dược lý và phương pháp phân tích các hợp chất taxoid từ chi Taxus:

  • Về phân loại thực vật và nguồn gốc: Spjut (2007, 2010) phân loại chi Taxus thành 24 loài và 55 thứ thuộc 3 nhóm chính (Baccata, Wallichiana, Sumatrana). Nhóm Wallichiana được phân biệt nhờ cấu trúc biểu bì lá có nhú (papillose) và các dải lỗ khí đặc trưng ở mặt dưới. Manchester (1994) mô tả bằng chứng hóa thạch hạt Taxaceae; Axelrod (1975) xác định ảnh hưởng của khí hậu Neogene đến sự phân nhánh và hình thái lá Thông đỏ châu Á.
  • Về chiết xuất và phân lập taxoid: Wani và cộng sự (1971) lần đầu phân lập paclitaxel từ Taxus brevifolia. Rao (1993) phát triển mô hình chiết xuất taxoid bằng dung môi hữu cơ thông thường. Jennings và cộng sự (1992) chiết xuất taxoid bằng CO2 siêu tới hạn kết hợp ethanol 3%. Nhóm nghiên cứu Đại học Bách khoa Virginia và Polysciences Inc. (1986) công bố quy trình chiết tách taxol quy mô lớn từ vỏ cây T. brevifolia. Yang và cộng sự (1998) dùng sắc ký lỏng điều chế công nghiệp (IPLC) với nhựa D956 để tinh chế taxol từ T. yunnanensis. Xue và cộng sự (2000, 2001) ứng dụng cột pha đảo C18 tinh sạch taxol từ dịch chiết T. yunnanensis. Madhusudanan, Chattopadhyay và cộng sự (2002), Atta-ur-Rahman và cộng sự (2003), Dang và cộng sự (2017) phân lập nhiều dẫn xuất taxan mới (như abeo-taxoid, wallitaxan A–F) từ T. wallichiana.
  • Về các kỹ thuật chiết xuất hiện đại: Mattina và cộng sự (1997) ứng dụng chiết hỗ trợ vi sóng (MAE); Kikuchi (1997) và Kawamura (1999) sử dụng chiết gia tốc dung môi (ASE); Shujie và cộng sự (2016) nghiên cứu chiết siêu âm (UAE); Dorota và cộng sự (2009) so sánh 4 phương pháp trích ly taxoid với dung môi methanol.
  • Về phương pháp phân tích, định lượng taxoid: Vidensek và cộng sự (1990), Harvey và cộng sự (1991), Theodoridis và cộng sự (2001), Dong và cộng sự (2005), Yuangang Zu và cộng sự (2006) phát triển phương pháp RP-HPLC trên cột C18 và C8; Castor và Tyler (1993) dùng cột phenyl; Auriola và cộng sự (1992) dùng cột cyano; Richheimer và cộng sự (1992), Fu YJ và cộng sự (2009) phân tích taxoid trên cột pentafluorophenyl (PFP); Chan và cộng sự (1994), Truus và cộng sự (2012) ứng dụng sắc ký mixel điện động (MEKC) và điện di mao quản vùng (CZE); Zhang Jing và cộng sự (2011, 2012) phân tích đồng thời taxoid bằng UPLC; Glowaniak và Mroczek (1999) dùng sắc ký lớp mỏng điều chế (TLC).
  • Về nghiên cứu Thông đỏ lá dài tại Việt Nam: Mai Văn Trì và cộng sự (2001) phân lập 7,7'',4-tri-O-trimethylamentoflavon từ lá Thông đỏ lá dài Lâm Đồng. Nguyễn Hữu Toàn Phan và cộng sự (2007) khảo sát hàm lượng 10-DAB và 19-hydroxybaccatin III theo thời gian thu hái, xác định hàm lượng cao nhất vào tháng 6 (0,037% và 0,032%). Trần Công Luận và cộng sự (2008, 2015) khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và thử nghiệm chiết taxol bằng CO2 siêu tới hạn quy mô pilot, phân lập deacetyl baccatin III, 10-DAB, taxuspin F và taxchinin A. Nguyễn Thị Thanh Tâm và cộng sự (2009) phân lập taxinin B, taxuspin F, 10-deacetyltaxuspin F, 19-hydroxybaccatin III, 10-DAB và 7-(β-xylosyl)-10-deacetyltaxol. Lê Thị Kim Phụng và cộng sự (2016) so sánh các phương pháp trích ly taxol và 10-DAB từ lá và cành Thông đỏ Lâm Đồng.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết: Mặc dù các nghiên cứu trước đã ghi nhận sự hiện diện của một số hợp chất taxoid trong Thông đỏ lá dài trồng tại Lâm Đồng, việc phân lập có hệ thống, tinh sạch lượng lớn, thẩm định cấu trúc chi tiết bằng phổ 2D-NMR, thiết lập các chất này thành chất đối chiếu đạt chuẩn hướng dẫn quốc tế (WHO, ASEAN) và xây dựng quy trình HPLC định lượng đồng thời nhiều taxoid vẫn chưa được thực hiện hoàn chỉnh. Luận án giải quyết toàn diện các yêu cầu này nhằm phục vụ công tác kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa dược liệu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và phân loại taxoid

Taxoid là nhóm hợp chất diterpenoid sinh tổng hợp từ pyruvat và glyceraldehyd-3-phosphat qua con đường 2-C-methyl-D-erythritol phosphat, tạo isopentenyl diphosphat và dimethylallyl diphosphat, chuyển hóa thành geranyl diphosphat và đóng vòng lõi taxan nhờ enzym taxadien synthetase. Khung carbon taxoid gồm khung cơ bản 6/8/6 (vòng 8 carbon kẹp giữa hai vòng 6 carbon) và các dạng khung sắp xếp lại như 3,11-cyclotaxan, 11(15→1)-abeo-taxan (khung 5/7/6), 2(3→20)-abeo-taxan (khung 6/10/6) và 11(15→1), 11(10→9)-bisabeo-taxan.

Quy trình thiết lập chất đối chiếu tuân thủ hướng dẫn kỹ thuật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á (ASEAN), quy định yêu cầu về độ tinh khiết sắc ký (> 95%), khối lượng (> 150 mg), kiểm tra độ đồng nhất lô (trong lọ và liên lọ) bằng phân tích thống kê phương sai ANOVA một yếu tố, đánh giá liên phòng thí nghiệm và ấn định giá trị hàm lượng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp chiết xuất, phân lập hóa thực vật, phổ học cấu trúc và phân tích kiểm nghiệm hóa lý:

Giai đoạn nghiên cứu Phương pháp / Kỹ thuật thực hiện Thiết bị, hóa chất và điều kiện chính
Chiết xuất thô Ngâm lạnh bột lá khô với MeOH (tỷ lệ 1:6, 24 giờ). Cô giảm áp thu cao MeOH thô. Máy cô quay chân không Rotavapor R-3000; dung môi MeOH kỹ thuật/phân tích.
Chiết phân đoạn Hòa cao MeOH vào nước, lắc phân bố lỏng - lỏng với dicloromethan (DCM). Phễu chiết thủy tinh, dung môi CH2Cl2 thu cao phân đoạn CH2Cl2.
Hấp phụ phân đoạn Sắc ký cột hấp phụ Diaion HP-20. Rửa giải phân đoạn: Nước, MeOH 20%, 40%, 60%, 80%, 100%. Chọn cao MeOH 100%.
Phân lập sắc ký Sắc ký cột cổ điển Silica gel (CC) và sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC). - Silica gel Merck cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, cột 7 x 100 cm (nạp mẫu khô 75 g và 50 g, tốc độ dòng 20 ml/phút).
- Hệ thống MPLC Combiflash Companion TS, cột RediSep (30 x 3 cm), đầu dò UV K2600. Khảo sát SKLM bản mỏng F254 với hệ PE – EtOH (9:1), DCM – MeOH (9:1), PE – aceton (7:3).
Tinh chế chất Kết tinh lại trong dung môi tinh khiết; HPLC điều chế (Preparative HPLC). Hệ thống Preparative HPLC Merck Knauer, đầu dò UV K2600; dung môi Merck đạt chuẩn phân tích.
Xác định cấu trúc Đo điểm chảy, năng suất quay cực, đo phổ UV-Vis, FT-IR, MS, 1D/2D-NMR. - Máy đo điểm chảy, phân cực kế.
- Quang phổ Nicolet iS50 FT-IR.
- Khối phổ MS-5989B Engine.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz (dung môi CDCl3; đo 1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC).
Thiết lập chất đối chiếu Kiểm tra độ tinh khiết HPLC, kiểm tra độ đồng nhất lô, đánh giá liên PTN, phân tích ANOVA. Hệ thống HPLC Shimadzu CBM 20A, đầu dò PDA SPD-M20A; cân phân tích Mettler Toledo XP26 (độ nhạy 0,001 mg); xử lý thống kê ANOVA một yếu tố.
Định lượng đồng thời Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC). Thẩm định theo hướng dẫn quốc tế. Cột Phenomenex Gemini - NX - 5u C18 110 Å (250 x 4,6 mm; 5 µm), đầu dò PDA SPD-M20A (bước sóng 227 nm và 280 nm), pha động Acetonitril – Nước rửa giải gradient.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 trình bày chi tiết về đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu giải phẫu lá, các dạng hạt của chi Taxus, đối chiếu các loài Thông đỏ trên thế giới và phân nhóm Thông đỏ châu Á (T. contorta, T. chinensis, T. wallichiana). Tác giả tổng hợp các hợp chất hóa học đã công bố từ Taxus wallichiana, bao gồm hơn 50 diterpenoid khung taxan, các nhóm biflavonoid (amentoflavon, sciadopitysin, ginkgetin, 7,7'',4-tri-O-trimethylamentoflavon), các dẫn xuất lignan (texiresinol, isotaxiresinol, secoisolariciresinol), tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen, alkan, anken, este), phytosterol (β-sitosterol, daucosterol) và phytoecdysteroid (ponasteron, ecdyson). Chương này cũng điểm lại các tác dụng dược lý trong y học cổ truyền (tiêu tích, thông kinh mạch, trị đau đầu, hen suyễn) và y học hiện đại (ức chế thụ thai trên chuột cái ở liều 100 và 500 mg/kg, ức chế tế bào ung thư, giảm đau, an thần, chống co giật, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn) cùng độc tính của alkaloid taxin và tác dụng phụ của paclitaxel. Cuối chương là tổng quan hệ thống về các phương pháp chiết xuất, phân lập và phân tích định lượng taxoid bằng HPLC (sử dụng cột C18, C8, phenyl, cyano, pentafluorophenyl), UPLC, CZE, MEKC và TLC.

Chương 2. Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn nguyên liệu lá Thông đỏ lá dài thu hái tại Đà Lạt (Lâm Đồng) vào tháng 9/2012 (mẫu T9-B7) với khối lượng 25 kg bột khô (≤ 2 mm), hóa chất, dung môi phân tích (Chemsol, Merck, J.T.Baker), chất đối chiếu paclitaxel chuẩn (Sigma, độ tinh khiết 99%), dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu. Nội dung phương pháp trình bày sơ đồ tổng thể từ chiết xuất bột lá bằng ngâm lạnh MeOH (tỷ lệ 1:6), lắc phân bố lỏng - lỏng với CH2Cl2, phân đoạn qua cột Diaion HP-20 (rửa giải gradient nước - MeOH), phân lập bằng sắc ký cột silica gel cổ điển (2 đợt nạp mẫu 75 g và 50 g cao MeOH 100%, hạt silica gel 0,040 – 0,063 mm, chiều cao cột 80 cm, tốc độ 20 ml/phút), MPLC trên cột RediSep, HPLC điều chế và kết tinh lại. Phương pháp khảo sát SKLM hệ dung môi triển khai, phương pháp đo phổ cấu trúc (UV-Vis, FT-IR, MS, NMR 500 MHz), phương pháp thiết lập chất đối chiếu theo WHO/ASEAN và phương pháp thẩm định quy trình định lượng đồng thời HPLC (tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ đúng) được quy định chặt chẽ.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 3 nội dung trọng tâm:

  1. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc 05 hợp chất taxoid: Từ phân đoạn cao MeOH 100% của lá Thông đỏ lá dài, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 05 hợp chất taxoid tinh khiết:
  • Hợp chất (1): Taxinin B (công thức phân tử và khung taxoid 6/8/6).
  • Hợp chất (2): Taxuspin F (khung taxoid 6/8/6).
  • Hợp chất (3): 10-Deacetyl taxinin B (khung taxoid 6/8/6).
  • Hợp chất (4): Taxuspin D (khung taxoid 6/8/6).
  • Hợp chất (5): Taxchinin B (khung taxoid 6/8/6).

Cấu trúc của 05 hợp chất được biện giải đầy đủ qua sự tương đồng dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và các tương quan phổ 2D-NMR (HMBC, 1H-1H COSY, HSQC), kết hợp với dữ liệu phổ UV-Vis, FT-IR, phổ khối MS, điểm chảy và năng suất quay cực.

                  Cấu trúc khung hóa học các taxoid phân lập
                      (Dẫn xuất Diterpenoid khung 6/8/6)
             
       Taxinin B (1)           Taxuspin F (2)       10-Deacetyl taxinin B (3)
       Taxuspin D (4)          Taxchinin B (5)
  1. Thiết lập 04 chất đối chiếu: Từ các hợp chất phân lập được có khối lượng > 150 mg và độ tinh khiết sắc ký > 95%, tác giả đã tiến hành quy trình thiết lập chất đối chiếu cho 04 hợp chất: Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và Taxuspin D.
  • Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký bằng HPLC với đầu dò PDA (kiểm tra độ tinh khiết đỉnh 3D tại các bước sóng 227 nm và 280 nm).
  • Kiểm tra độ đồng nhất lô (trong lọ và giữa các lọ) và đánh giá độ lặp lại. Xử lý thống kê ANOVA một yếu tố cho thấy sự đồng nhất đạt yêu cầu, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu thử.
  • Đánh giá liên phòng thí nghiệm giữa Đại học Y Dược TP.HCM và Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM bằng phân tích thống kê ANOVA một yếu tố.
  • Xác định và ấn định giá trị hàm lượng chuẩn cho 04 nguyên liệu chất đối chiếu.
  1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời bằng HPLC:
  • Điều kiện phân tích: Cột Phenomenex Gemini - NX - 5u C18 110 Å (250 x 4,6 mm; 5 µm); pha động Acetonitril (ACN) – Nước (H2O) rửa giải gradient; tốc độ dòng 1,0 ml/phút; đầu dò PDA phát hiện đồng thời ở 2 bước sóng 227 nm và 280 nm.
  • Kết quả thẩm định quy trình định lượng:
Chỉ tiêu thẩm định Kết quả thực nghiệm đạt được
Tính phù hợp hệ thống Độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) của diện tích pic và thời gian lưu của các taxoid đều đạt yêu cầu kiểm nghiệm.
Tính đặc hiệu / chọn lọc Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử tách biệt rõ ràng; các pic taxoid không bị chồng lấn bởi tạp chất.
Độ tuyến tính, LOD, LOQ Hệ số tương quan tuyến tính $r$ đạt chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát; xác định rõ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho từng chất.
Độ đúng (Độ thu hồi) Khảo sát ở 3 mức nồng độ ($n = 9$), độ thu hồi của các taxoid nằm trong khoảng 95,0% – 105,0%.
Độ lặp lại & Chính xác trung gian Khảo sát lặp lại và liên ngày/kiểm nghiệm viên ($n = 6$), hệ số biến thiên %RSD đều < 3,0%.
Ứng dụng thực tế Định lượng đồng thời hàm lượng các hợp chất taxoid trong mẫu thử lá Thông đỏ lá dài Lâm Đồng (mẫu TW).

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung bàn luận về 3 khía cạnh khoa học chính:

  1. Quy trình chiết xuất, phân lập và làm sạch: Việc sử dụng cột hấp phụ Diaion HP-20 kết hợp sắc ký cột silica gel cổ điển nạp mẫu khô, MPLC và HPLC điều chế giúp loại bỏ hiệu quả tạp chất màu và phân đoạn chính xác các taxoid có độ phân cực gần nhau.
  2. Quy trình thiết lập chất đối chiếu: Đánh giá tính chuẩn mực của việc thẩm định độ tinh khiết 3D trên đầu dò PDA, kiểm tra độ đồng nhất lô và thử nghiệm liên phòng thí nghiệm theo hướng dẫn của WHO và ASEAN, tạo cơ sở cung cấp chất đối chiếu đặc thù phục vụ kiểm nghiệm trong nước.
  3. Quy trình định lượng HPLC: Phân tích sự phù hợp của việc chọn hệ dung môi pha động ACN – H2O rửa giải gradient và phát hiện đồng thời ở bước sóng 227 nm và 280 nm nhằm tối ưu hóa độ nhạy và độ chọn lọc đối với các hợp chất taxoid trong mẫu dược liệu phức tạp.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Về mặt khoa học và lý luận:
    • Phân lập và xác định cấu trúc đầy đủ của 05 hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng bằng hệ thống dữ liệu phổ nghiệm hiện đại (UV, IR, MS, 1D và 2D-NMR): Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B, Taxuspin D và Taxchinin B.
    • Cung cấp dữ liệu phổ học và bằng chứng hóa thực vật chi tiết về nhóm diterpenoid khung taxan của nguồn Thông đỏ lá dài di thực trồng trọt tại Việt Nam.
  2. Về mặt thực tiễn và kiểm nghiệm:
    • Thiết lập thành công 04 chất đối chiếu gồm Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và Taxuspin D theo đúng hướng dẫn kỹ thuật của WHO và ASEAN (đạt độ tinh khiết > 95%, khối lượng > 150 mg, đánh giá đồng nhất lô và liên phòng thí nghiệm bằng phân tích thống kê ANOVA).
    • Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh quy trình định lượng đồng thời các hợp chất taxoid bằng phương pháp HPLC pha đảo sử dụng đầu dò PDA ở hai bước sóng 227 nm và 280 nm, đạt đầy đủ các tiêu chí thẩm định phương pháp phân tích theo quy định.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đề xuất ứng dụng quy trình phân tích HPLC đã thẩm định vào công tác kiểm tra chất lượng dược liệu lá Thông đỏ lá dài và các bán thành phẩm, cao chiết xuất trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm.
  • Kiến nghị tiếp tục mở rộng quy trình phân lập để thiết lập thêm các chất đối chiếu taxoid khác có trong lá cây Thông đỏ trồng nhằm phục vụ toàn diện hơn cho công tác nghiên cứu và kiểm nghiệm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Nghiên cứu thực hiện trên một mẫu đại diện thu hái vào tháng 9 năm 2012 tại Lâm Đồng (mẫu T9-B7), chưa mở rộng khảo sát hàm lượng trên các mẫu thu hái ở các thời điểm sinh trưởng khác nhau trong năm hoặc tại các vùng trồng thực nghiệm khác.
    • Số lượng chất đối chiếu được thiết lập dừng lại ở 04 hợp chất trong số các taxoid hiện diện trong dược liệu.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục phân lập và tinh chế các hợp chất taxoid phân cực và các dẫn xuất thứ cấp khác trong các phân đoạn còn lại của cao chiết.
    • Ứng dụng quy trình định lượng HPLC đã xây dựng để theo dõi biến động hàm lượng taxoid theo mùa vụ, độ tuổi cây và quy trình chăm sóc tại các vùng di thực Thông đỏ lá dài.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo hữu ích cho các đối tượng và lĩnh vực:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên chuyên ngành Dược học, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất, Hóa thực vật và Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Tham khảo phương pháp phân lập diterpenoid, kỹ thuật giải phổ 2D-NMR và quy trình thẩm định phương pháp phân tích sắc ký.
  • Cán bộ kiểm nghiệm tại các viện kiểm nghiệm thuốc, trung tâm sâm và dược liệu, phòng kiểm tra chất lượng (QC/QA) của các nhà máy sản xuất dược phẩm: Áp dụng quy trình kỹ thuật thiết lập chất đối chiếu theo tiêu chuẩn WHO/ASEAN và quy trình định lượng HPLC đồng thời các taxoid.
  • Các nhà khoa học và cơ quan quản lý dược liệu: Sử dụng dữ liệu thành phần hóa học để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, tiêu chuẩn Dược điển cho nguồn dược liệu Thông đỏ lá dài trồng tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc được những hợp chất taxoid nào từ lá Thông đỏ lá dài? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 05 hợp chất taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng ở Lâm Đồng gồm: (1) Taxinin B, (2) Taxuspin F, (3) 10-Deacetyl taxinin B, (4) Taxuspin D, và (5) Taxchinin B.

2. Những hợp chất nào được lựa chọn để thiết lập thành chất đối chiếu và theo tiêu chuẩn nào? 04 hợp chất gồm Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B và Taxuspin D đã được thiết lập thành chất đối chiếu theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á (ASEAN), đảm bảo độ tinh khiết sắc ký > 95% và khối lượng > 150 mg.

3. Điều kiện sắc ký chính của quy trình định lượng đồng thời các taxoid là gì? Quy trình sử dụng hệ thống HPLC với cột Phenomenex Gemini - NX - 5u C18 110 Å (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động Acetonitril – Nước rửa giải gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, phát hiện bằng đầu dò PDA ở hai bước sóng 227 nm và 280 nm.

4. Dữ liệu phổ nghiệm nào được sử dụng để xác định cấu trúc hóa học của các taxoid phân lập? Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên kết hợp dữ liệu điểm nóng chảy, năng suất quay cực, phổ UV-Vis, phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), khối phổ MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC) đo ở tần số 500 MHz trên dung môi CDCl3.

5. Nguồn nguyên liệu nghiên cứu được thu hái ở đâu và định danh bởi ai? Nguyên liệu là 25 kg bột lá khô Thông đỏ lá dài thu hái vào tháng 9/2012 tại Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt - Vimedimex (tỉnh Lâm Đồng), do TS. Võ Văn Chi giám định tên khoa học và lưu tiêu bản tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Hứa Hoàng Oanh đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của 05 hợp chất diterpenoid taxoid từ lá Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) trồng tại Lâm Đồng. Đề tài đã thiết lập hoàn chỉnh 04 chất đối chiếu (Taxinin B, Taxuspin F, 10-deacetyl taxinin B, Taxuspin D) đạt chuẩn hướng dẫn của WHO và ASEAN thông qua đánh giá độ tinh khiết 3D, độ đồng nhất lô và kiểm tra liên phòng thí nghiệm bằng phân tích thống kê ANOVA. Đồng thời, luận án đã xây dựng và thẩm định đầy đủ quy trình HPLC pha đảo gradient phát hiện ở bước sóng 227 nm và 280 nm để định lượng đồng thời các taxoid, đóng góp cơ sở khoa học và phương tiện kỹ thuật phục vụ kiểm nghiệm chất lượng nguồn dược liệu Thông đỏ lá dài tại Việt Nam.