MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp dược trên thế giới, ngành dược Việt Nam cũng đã phát triển và khẳng định được vị trí của mình. Trên cả nước, với khoảng 200 nhà máy sản xuất dược phẩm đạt GMP-WHO, sản xuất các thành phẩm đa phần là thuốc generic, đặc biệt là các thuốc kháng sinh, thuốc điều trị bệnh tim mạch. Thêm vào đó, hiện đang có nhiều nhà máy sản xuất nguyên liệu dược ở nước ngoài mà nước ta phụ thuộc rất nhiều vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu nên việc kiểm tra chất lượng cần phải được đặt lên hàng đầu áp dụng cho nguyên liệu đầu vào trước khi đưa vào sản xuất cũng như thành phẩm trước và trong quá trình lưu hành thuốc. Tạp chất là những hợp chất được tạo thành trong quá trình sản xuất, bảo quản và lưu thông phân phối của nguyên liệu và thành phẩm.
Tạp chất làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, tác động không nhỏ đến hiệu quả điều trị, làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc hoặc gây các tác dụng không mong muốn của thuốc. Nhiều chuyên luận trong hầu hết dược điển tham chiếu và dược điển Việt Nam V [1], [24], [35], [74] bắt buộc phải kiểm tra tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm như cephalexin, amlodipin, captopril, nifedipin,. Trong khi đó, các tạp chuẩn được bán với giá rất đắt và phải nhập mua từ nước ngoài và đôi lúc không có sẵn trên thị trường, vì vậy gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm như tốn nhiều chi phí khi phải mua tạp chuẩn từ nước ngoài, mất thời gian đặt hàng và không chủ động trong công tác kiểm nghiệm. Hiện nay, các thuốc kháng sinh nhóm cephalexin và các thuốc tim mạch captopril, amlodipin, nifedipin được đa số các nhà máy trong nước sản xuất và đã được các bác sĩ sử dụng điều trị cho người bệnh từ trước đến nay.
Chỉ tiêu tạp chất liên quan trong thuốc và nguyên liệu làm thuốc là bắt buộc và đã được Cục quản lý Dược - Bộ Y tế qui định. Tuy nhiên, nguồn tạp đối chiếu hiện nay đang là mục tiêu hàng đầu cần phải giải quyết của nhà quản lý. Các nhà khoa học Dược cũng tập trung, nỗ lực nghiên cứu các quy trình tổng hợp nhằm bổ sung nguồn tạp chuẩn cho hệ thống kiểm nghiệm quốc gia. Do đó, việc lựa chọn các tạp chất của các hoạt chất 2 này làm đối tượng nghiên cứu trong luận án để nghiên cứu điều chế và tiêu chuẩn hóa tạp chất lựa chọn nhằm hướng tới thiết lập tạp chuẩn góp phần thuận lợi trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc, giúp giảm bớt chi phí mua tạp chuẩn từ nước ngoài và tăng danh mục tạp chuẩn thiết lập tại Việt Nam.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và B của nifedipin dùng trong kiểm nghiệm thuốc” được thực hiện với mong muốn điều chế, đánh giá, xây dựng bộ dữ liệu chuẩn cho các tạp chất và thiết lập tạp chuẩn để phục vụ công tác kiểm nghiệm tạp chất liên quan của nguyên liệu và thành phẩm chứa hoạt chất tương ứng. Mục tiêu của đề tài là: 1. Xây dựng qui trình tổng hợp 6 tạp chất captopril disulfid, 7-ADCA, D- phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin ở qui mô phòng thí nghiệm. Xây dựng và thẩm định qui trình xác định độ tinh khiết các tạp tổng hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Thiết lập được các tạp chuẩn captopril disulfid, 7-ADCA, D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin đạt yêu cầu chất đối chiếu quốc gia. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng tạp chất captopril disulfid trong nguyên liệu và thành phẩm captopril bằng phương pháp sắc ký lỏng. Ứng dụng các tạp chuẩn đã thiết lập trong kiểm nghiệm tạp captopril disulfid, 7-ADCA , D-phenylglycin, tạp D của amlodipin, tạp A và tạp B của nifedipin trong một số nguyên liệu và thành phẩm tương ứng đang lưu hành trên thị trường. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
TỔNG QUAN TẠP CHẤT CAPTOPRIL DISULFID CỦA CAPTOPRIL Tên quốc tế: captopril disulfid. Tên khoa học: acid (2S,2’S)-1,1’-[disulphanediylbis[(2S)-2-methyl-1-oxopropan- 3,1-diyl]-bis[pyrrolidin-2-carboxylic]. Công thức phân tử: C18H28N2O6S2. Khối lượng phân tử 432,6 g/mol.
Công thức cấu tạo: HO OH O O 3 2 2 3 CH3 CH3 1 1 N S S N 1' 2' 3' 3' 2' 1' 4 5 O 5 4 O Hình 1. Cấu trúc hóa học của captopril disulfid Tính chất: tinh thể trắng, vị đắng, mùi lưu huỳnh. Nhiệt độ nóng chảy 233 – 235 oC; ít tan trong nước, tan ít trong cloroform, ethyl acetat, dễ tan trong methanol [64]. Nguồn gốc phát sinh: captopril disulfid là sản phẩm phân hủy chủ yếu của captopril dưới tác động của các yếu tố môi trường như ánh sáng, oxy không khí [70].
Độc tính: lượng lớn captopril disulfid gây vị kim loại, khó chịu, làm giảm khả năng tuân thủ điều trị của bệnh nhân [46]. Độc tính cấp: LD50 của captopril disulfid là 4,245 (g/kg). Captopril disulfid gây hạ huyết áp, tăng nhịp tim và suy thận hồi phục, ngứa, phát ban, rối loạn vị giác, dị ứng, mất bạch cầu, đau bụng, loét miệng, ho, thở khò khè và sưng hạch bạch huyết. Sốc phản vệ cũng có thể xảy ra, hạ huyết áp và suy thận có thể nghiêm trọng do làm giảm lượng nước tiểu, tuy nhiên, hiếm trường hợp tử vong do suy thận.
Tình trạng sưng hạch xảy ra ở lưỡi, môi, mặt, tứ chi và cổ họng có thể đe dọa tính mạng [32]. Độc tính mãn: Các nghiên cứu trên động vật cho thấy captopril disulfid gây độc hại đến sự phát triển của thai nhi ở nhiều cấp độ mà không gây độc hại đáng kể cho người mẹ. Sẩy thai hoặc thai chết lưu có thể xảy ra. Tiếp xúc lâu dài với nồng độ captopril disulfid cao có thể gây ra thay đổi chức năng phổi, gây tình trạng ho dị 4 ứng, co thắt phế quản cấp tính.
Captopril disulfid có thể gây rối loạn tiết niệu và rối loạn collagen mạch máu, tăng trưởng các tuyến, nhưng hiếm khi gây ra bệnh ung thư ác tính [32]. Một số công trình nghiên cứu về tạp captopril disulfid Theo Hellen Karine Stulzer [71] và Julia Aparecida L. Souza [70] về thử độ ổn định viên nén captopril ở 40 ± 2 oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5%, captopril bị phân hủy tạo captopril disulfid. CH3 HO OH H O O CH3 CH3 SH C O 1/2 O2 N S S N COOH N 2 H O O Hình 1.
Phản ứng phân hủy captopril với tác nhân oxy không khí "Nguồn: Souza J. và cộng sự, 2012" [70] Do đó captopril disulfid là tạp chất liên quan của captopril cần phải được kiểm soát. - Công trình nghiên cứu Waleed M. Mahmoud và Klaus Kümmerer khảo sát quá trình phân hủy captopril trong môi trường vi sinh, ánh sáng và nước cũng cho thấy sự oxy hóa captopril trong nước tạo sản phẩm captopril disulfid là chủ yếu [53].
- Nghiên cứu của Tak Yee Lee và Robert E. Notari về độ ổn định của dung dịch captopril ở pH 6,6–8,0, nhiệt độ 32 oC, dưới áp suất oxy riêng phần 90–760 mmHg, có và không có ion Cu2+ cũng cho kết quả tạo thành captopril disulfid [49]. - Nghiên cứu của Torreggiani A và cộng sự về phản ứng giữa captopril và ion Cu2+ cho thấy khi tỷ lệ Cu2+ và captopril là 1 : 1, tủa captopril disulfid sẽ tạo thành. Ở tỷ lệ 0,5 : 1, hình thành phức tan captopril với Cu2+ ở pH 10 và một phức khác không tan ở pH 3 [73].
- Nghiên cứu của Seema S. Badi và Suresh M. Tuwar về động học của phản ứng oxy hóa captopril với tác nhân [Fe(CN)6]3- ở 27 oC trong môi trường acid được điều chỉnh bởi HClO4 và NaClO4, kết quả cho ra sản phẩm chủ yếu là captopril disulfid [22]. 5 - Nghiên cứu của Sing D và cộng sự về qui trình tổng hợp các disulfid với tác nhân là oxy không khí, môi trường [BMIM]-BF4 và Na2CO3, sản phẩm chính từ captopril là captopril disulfid [69].
HOOC CH3 N CH3 H S C O O2; Na2CO3 O SH S C O N COOH [BMIM] - BF4 CH3 N 2 COOH Captopirl Captopril disulfid Hình 1. Tổng hợp captopril disulfid với tác nhân oxy không khí, môi trường [BMIM]-BF4 và Na2CO3 "Nguồn: Singh D. và cộng sự, 2010" [69] - Nghiên cứu của Schaefer J. về sự tương tác in vitro giữa chế phẩm captopril 25 mg và FeSO4 300 mg cho thấy có sự tạo thành phức trong phản ứng giữa Fe3+ với captopirl và captopril disulfid là tinh thể màu trắng [64].
Casy và Dewar đã dựa trên kết quả phổ NMR và MS của captopril, captopril disulfid và epicaptopril để đề xuất qui trình phát hiện tạp đồng phân và dựa vào phổ 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) để phát hiện tạp oxy hóa của captopril [25]. - Nghiên cứu của Nafisur Rahman và Nishat Anwar về ứng dụng định lượng gián tiếp captopril dựa trên phản ứng oxy hóa của Fe3+ và phản ứng tạo phức xanh của Fe2+ với K3[Fe(CN)6] cũng đề cập sản phẩm oxy hóa tạo thành là captopril disulfid [57]. - Năm 2004, Takashi Nishikawa đã công bố điều kiện sắc ký để phân tích 3 cặp đồng phân cis – trans, cis – cis, trans – trans captopril disulfid: pha động acetonitril – đệm phosphat pH 6,8 và nhiệt độ cột thấp hơn 12 oC [60]. - Năm 2011, Raquel Nogueira đã xây dựng qui trình định lượng tạp chất của captopril, pha động methanol – acid phosphoric, phát hiện 4 tạp chất, trong đó 6 captopril disulfid được tạo thành từ captopril trong acid hydrocloric 1 M, natri hydroxyd 1 M và nước oxy già 3% [61].
- Một nghiên cứu khác tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid cũng thu được captopril disulfid đạt độ tinh khiết 99,25% [11]. Từ các nghiên cứu trên, có thể nhận định captopril disulfid là sản phẩm phân hủy của captopril dưới tác động của môi trường như ánh sáng, oxy không khí. Ion Cu2+ tạo phức chất bền với captopril nên khó ứng dụng. Ion Fe2+, Fe3+ tạo phức kém bền với captopril nên Fe3+ là tác nhân có khả năng tổng hợp captopril disulfid, tuy nhiên phức chất tạo thành khó tinh chế.
[BMIM]-BF4 là môi trường chọn lọc để tổng hợp captopril disulfid, nhưng đắt tiền và khó tinh chế. TỔNG QUAN TẠP CHẤT 7-ADCA và D-PHENYLGLYCIN CỦA CEPHALEXIN 1. Tổng quan về enzym penicillin acylase và sự cố định hóa enzym 1. Enzym penicillin acylase - Penicillin G acylase (PGA) đã được thương mại hóa và sử dụng để thủy phân gốc acyl của penicillin G hoặc cephalosporin để tạo thành acid 6-aminopenicillanic (6- APA) hoặc acid 7-aminodesacetoxycephalosporanic (7-ADCA) là 2 chất trung gian chính trong sản xuất trên qui mô công nghiệp của các kháng sinh β-lactam bán tổng hợp.