ĐẶT VẤN ĐỀ Patulin là một loại độc tố nấm mốc được tạo ra bởi một số loại nấm (Penicillium, Aspergillus, Byssochlamys). Nấm mốc Penicillium expansum xâm nhập vào những quả táo bị thương, gây ra nấm mốc xanh phân hủy và sau đó sản sinh ra Patulin - một loại độc tố nấm mốc ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người [34]. Patulin có thể xuất hiện trong nhiều loại trái cây, ngũ cốc và các thực phẩm khác bị mốc, tuy nhiên nguồn cung cấp Patulin chính là táo và các sản phẩm từ táo như nước táo, giấm táo, mật táo… [31]. Việc sử dụng các thực phẩm tiếp xúc với Patulin có thể dẫn đến một số biến chứng về sức khỏe như ức chế miễn dịch; gây ung thư; viêm, loét và chảy máu đường tiêu hóa; gây đột biến và nhiễm độc phôi và có tác dụng gây quái thai[28].
Một số biện pháp chỉ loại bỏ sự tồn tại của mầm bệnh mà không loại bỏ sự hiện diện của Patulin nên thực phẩm làm từ táo phải được giám sát chặt chẽ [34]. Quy định của Liên minh Châu Âu (EU) số 2023/915 và quy định của Bộ Y tế Viêt Nam đưa ra giới hạn dư lượng tối đa (MRL) là 50 µg/kg trong nước táo và rượu táo, 25 µg/kg trong các sản phẩm táo dạng rắn và 10 µg/kg trong các sản phẩm dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (trẻ dưới 36 tháng tuổi) [3], [32]. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về xác định hàm lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [24], [25], [26], [30] , sắc ký khí khối phổ (GC-MS) [20] hoặc sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) [21], [22], [29], [33]. Ở Việt Nam có nghiên cứu về vấn đề trên bằng phương pháp HPLC [1] nhưng chưa có nghiên cứu sử dụng phương pháp LC – MS/MS.
Giới hạn dư lượng tối đa cho phép của Patulin rất nhỏ, nền mẫu khá phức tạp gây khó khăn cho quá trình phân tích. Vì vậy, phân tích bằng LC-MS/MS có độ nhạy, độ chọn lọc cao được ưu tiên lựa chọn. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng LC-MS/MS” được thực hiện với mục tiêu như sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC – MS/MS).
Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Patulin trong một số mẫu táo và sản phẩm từ táo trên thị trường. Tổng quan về Patulin 1. Tổng quan về Patulin a. Định danh - Công thức phân tử: C7H6O4 - Công thức cấu tạo: Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Patulin - Tên hóa học: 4-hydroxy-4,6-dihydrofuro[3,2-c] pyran-2-on.
- Tên gọi khác: 2-Hydroxy-3,7-dioxabicyclo[4.0]nona-5,9-dien-8-on; Clairformin; Expansin; Gigantin; Leucopin; Patulin [35]. Tính chất vật lý, hóa học - Khối lượng phân tử: 154,12 g/mol. - Trạng thái vật lý: chất rắn kết tinh, màu trắng, không mùi. - Nhiệt độ nóng chảy: 111,0°C.
- Độ tan: tan trong nước và các dung môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril, ethyl acetat, … Patulin khá ổn định trong môi trường acid nhưng không bền trong môi trường kiềm. - Hệ số log Kow (n-octanol/nước): 1,4 – 1,6 [35]. Độc tính Giá trị LD50 qua đường uống của Patulin ở chuột nhắt và chuột cống thay đổi từ 20 – 100 mg/kg. Giá trị này cao hơn nhiều so với nồng độ Patulin thực tế mà sinh vật tiếp xúc.
Trong các nghiên cứu cấp tính, Patulin gây xuất huyết, hình thành phù nề và giãn nở đường ruột ở động vật thí nghiệm [12]. Trong các nghiên cứu cận mãn tính, tăng biểu mô tá tràng và suy giảm chức năng thận được coi là độc tính chính. Các dấu hiệu độc hại được báo cáo nhất quán trong tất cả các nghiên cứu là kích động, trong một số trường hợp là co giật, khó thở, tắc nghẽn phổi, phù nề, loét, sung huyết đường tiêu hóa [13]. Ở cấp độ tế bào, Patulin đã được chứng minh là có tác dụng bao gồm phá vỡ màng huyết tương, ức chế tổng hợp protein, ức chế vận chuyển acid amin kết hợp Na+, ức chế phiên mã và dịch mã, ức chế tổng hợp DNA [10] và ức chế interferon γ sản xuất tế bào T- 2 helper loại 1 [18].
Hơn nữa, sự mất glutathion tự do trong tế bào sống có liên quan đến phơi nhiễm Patulin [8] và việc điều trị bằng cystein và glutathion ngoại sinh đã ngăn ngừa độc tính của nó trong biểu mô ruột [10]. Ức chế các enzym khác nhau: Patulin tạo thành một chất kết hợp với thiol chứa các thành phần tế bào như glutathion và protein chứa cystein [8]. Thật vậy, nhiều enzym có nhóm sulfhydryl ở vị trí hoạt động rất nhạy cảm với Patulin. ATPase phụ thuộc Na + - K +, RNA polymerase, aminoacyl-tRNA synthetase và aldolase cơ đều đã được chứng minh là bị ức chế bởi Patulin.
Tuy nhiên, các enzym thiếu nhóm sulfhydryl như urease cũng nhạy cảm với Patulin [14]. Độc tính miễn dịch: Patulin gây tăng hô hấp và viêm phổi tăng bạch cầu ái toan do đó làm tăng phản ứng miễn dịch dị ứng [16]. Patulin tiếp xúc với chuột đực trong 60 đến 90 ngày gây xuất huyết, tăng sản xuất tế bào plasma, giãn nở và xơ hóa vỏ não, mô kẽ phì đại giữa các tiểu thùy tuyến ức, mô mỡ phì đại, vỏ não mỏng đi và mờ vỏ - tủy ranh giới trong tuyến ức ở nồng độ 0,1 mg/kg [7]. Phơi nhiễm Patulin dẫn đến giảm biểu hiện IL-4, IL-13, IFN-gamma, IL-10 và sự suy giảm GSH nội bào trong các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người [9].
Độc tính trên cơ quan: Patulin gây tổn thương đường ruột, nhiễm độc gan, có độc tính trên thần kinh và thận. Patulin được báo cáo là gây loét đường ruột, viêm và chảy máu [17]. Những con chuột tiếp xúc với Patulin trong 8 tuần cho thấy hàm lượng Glutathione Disulfide, các chất phản ứng với axit thiobarbituric và hàm lượng protein carbonyl tăng lên. Hơn nữa, PAT còn làm giảm hoạt động của glutathione peroxidase và glutathione reductase.
Trong tế bào thần kinh-2a, Patulin gây ra sự suy giảm ATP và rối loạn chức năng ty thể và lysosomal [11]. Chất độc có thể tập trung ở mô thận do quá trình tái hấp thu ở ống thận. Khi nồng độ của chất độc trong lòng thận và các tế bào thận xung quanh khá cao gây độc tính do patulin [28]. Khả năng gây ung thư: Có rất ít dữ liệu được báo cáo về khả năng gây ung thư của Patulin, do đó nó được phân loại vào nhóm 3 vì nó không gây ung thư cho con người, tuy nhiên, việc tiếp xúc lâu dài với Patulin ở chuột cống và chuột nhắt cho thấy khả năng gây ung thư.
Ở chuột, người ta quan sát thấy sự gia tăng đáng kể tỷ lệ mắc khối u giữa động vật đối chứng và động vật được điều trị bằng Patulin dẫn đến ung thư sarcoma tại chỗ tiêm. Khi tiêm dưới da, cả chuột đực và chuột cái được tiêm liều cao nhất (1,5 mg/kg) đều không sống sót. Trong suốt thời gian nghiên cứu, chứng minh tính độc hại của Patulin bằng việc bôi Patulin tại chỗ một lần ở nồng độ 400 nM gây ra sự hình thành khối u trên da chuột sau 14 tuần. Từ đó cho thấy vai trò của nó như là tác nhân khởi đầu khối u [15].
Quy định hiện hành Patulin có đặc tính kháng sinh nhưng đã được chứng minh là gây ung thư và gây đột biến trên động vật do đó một số quốc gia đã ban hành các hạn chế về Patulin trong các sản phẩm táo. Patulin đã được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế phân loại là chất gây ung thư nhóm 3, nhóm này bao gồm các hợp chất không có đủ dữ liệu để cho phép phân loại. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo mức tối đa là 50 µg/L nước táo [27]. EU và Bộ Y tế Việt Nam có quy định giới hạn tối đa của Patulin là giống nhau [3], [32] được trình bày trong bảng 1.1 Mức giới hạn tối đa cho phép trong táo và các sản phẩm từ táo.
Mức giới hạn tối đa Nền mẫu (µg/kg) Nước ép trái cây, nước ép trái cây cô đặc và mật hoa quả 50 Đồ uống có cồn: rượu táo và các đồ uống lên men khác làm từ 50 táo hoặc chứa nước táo Các sản phẩm táo dạng rắn được đưa ra thị trường (Bao gồm 25 cả nước ép táo và táo xay nhuyễn). Nước ép táo và các sản phẩm táo đặc dành cho trẻ sơ sinh và 10 trẻ nhỏ (trẻ dưới 36 tháng tuổi). Tổng quan phương pháp xác định Patulin 1. Một số phương pháp xác định Patulin trên thế giới Bảng 1.2 Các phương pháp xác định Patulin trên thế giới Nền mẫu - Phương pháp xử lý mẫu Phương pháp phân tích TLTK Chiết lỏng - lỏng LC - MS/MS 5 mL nước táo đã đồng nhất thêm 20 -Pha tĩnh: cột Nova-Pak C18 (150 Táo và mL ethyl acetat.
Siêu âm 15 phút. mm × 3,9 mm × 4 μm) (Waters, sản Dịch chiết ethyl acetat được làm bay Milford, USA) phẩm từ hơi dung môi bằng máy cô quay chân - Pha động: kênh A: CH3COOH táo không đến cắn. Hòa tan cắn trong 1 0,1%/ MeOH 10%/H2O; kênh B: [22] mL dung dịch methanol/nước/acid CH3COOH 0,1%/MeOH 100%. acetic (83,5:16:0,5, v/v/v) - Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút 4 - Chương trình gradient: Ban đầu với 0% B, giữ trong 1 phút, sau đó tăng đến 85% B trong 2 phút, giữ trong 1 phút, cột được cân bằng trong 2 phút với 100 % B cho đến lần tiêm tiếp theo.
- LOD= 1 µg/kg LOQ= 5 µg/kg Chiết lỏng – lỏng HPLC - UV - Với táo gai khô: 4 g mẫu đã đồng - Pha tĩnh: Cột Waters Xbridge™ nhất, thêm 4 mL nước cùng 75 μL C18 (250 mm × 4,6 mm × 5,0 μm), pectinase. Ủ ở 40℃ trong 2 giờ để tiền cột Xbridge™ C18 (4,6 mm × 20 thực hiện phản ứng enzym. - Với nước táo: 4 g mẫu đã đồng nhất. - Pha động: ACN: H2O (10:90, v/v) - Chiết bằng 20 mL ACN, lắc xoáy 2 - Bước sóng: 276 nm phút.
Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút Sản phút ở nhiệt độ phòng. - Thể tích tiêm: 50 μL phẩm Thu dịch chiết, thêm 1g PSA và 3g - Nhiệt độ cột: 30℃. trái cây MgSO4. Lắc nhanh bằng tay trong 1 - LOD= 2,6 µg/kg; [25] phút.
Ly tâm 6793 vòng/phút trong 3 LOQ= 8,0µg/kg phút. Hút 9 mL dịch phía trên đưa qua cột đa chức năng PriboFast® 228 để làm sạch. 4 mL dịch chiết đã làm sạch được làm khô bằng khí nitơ ở 45 ℃. Hoàn nguyên bằng 1 mL ACN: H2O pH=4 (10:90, v/v).
Lọc qua màng lọc 0,22 µm.