Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Patulin (4-hydroxy-4,6-dihydrofuro[3,2-c]pyran-2-on) là độc tố vi nấm nguy hiểm do các chủng nấm mốc thuộc chi Penicillium (đặc biệt là Penicillium expansum), Aspergillus và Byssochlamys sản sinh. Độc tố này thường tích tụ trên các loại quả bị dập nát, tổn thương hoặc hư hỏng trong quá trình thu hoạch và bảo quản, trong đó táo và các sản phẩm chế biến từ táo (nước ép táo, giấm táo, rượu táo, bột nghiền táo, thức ăn dặm cho trẻ em) là nguồn phơi nhiễm chính đối với con người. Patulin có độc tính cấp và mãn tính nghiêm trọng: gây xuất huyết, loét đường tiêu hóa, suy giảm chức năng gan, thận, ức chế hệ miễn dịch, gây độc phôi và có khả năng gây đột biến gen. Dù được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 3 do chưa đủ bằng chứng dịch tễ trực tiếp trên người, các thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật đã chứng minh độc tính hình thành khối u rõ rệt khi phơi nhiễm kéo dài.

Nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 8-1:2011/BYT của Bộ Y tế Việt Nam và Quy định số 2023/915 của Liên minh Châu Âu (EU) đã ban hành mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL) của Patulin rất nghiêm ngặt: 50 µg/kg đối với nước ép táo, nước ép cô đặc và rượu táo; 25 µg/kg đối với các sản phẩm táo dạng rắn; và đặc biệt chỉ 10 µg/kg đối với các sản phẩm từ táo dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 36 tháng tuổi.

Tại Việt Nam, các phương pháp phân tích Patulin phổ biến hiện nay chủ yếu dựa trên kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò tử ngoại hoặc dãy diode quang (HPLC-UV/PDA). Các phương pháp này thường có giới hạn phát hiện chưa đủ nhạy cho các mức nồng độ vết, đồng thời dễ gặp hiện tượng dương tính giả do nền mẫu thực phẩm giàu đường, acid hữu cơ và polyphenol gây nhiễu tín hiệu. Trong khi đó, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) cho phép phân tích chọn lọc cao, độ nhạy vượt trội và xác nhận cấu trúc chính xác vẫn chưa được công bố nghiên cứu hoàn chỉnh tại Việt Nam cho đối tượng này.

Từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Nguyễn Thu Hường (Trường Đại học Dược Hà Nội, thực hiện tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc và Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 2024) tập trung giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
  2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Patulin trong một số mẫu táo và sản phẩm từ táo lưu thông trên thị trường.
  • Đối tượng nghiên cứu: Độc tố Patulin (chất chuẩn độ tinh khiết 99,0% từ Pribolab) và các nền mẫu thực phẩm gồm: quả táo tươi, sản phẩm táo dạng lỏng (nước ép táo, giấm táo, rượu táo) và sản phẩm táo dạng rắn/đặc (puree táo, dinh dưỡng đóng lọ cho trẻ em).
  • Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát tối ưu hóa điều kiện sắc ký, khối phổ, quy trình chiết tách xử lý mẫu; thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu phân tích theo hướng dẫn của AOAC (2016) và Ủy ban Châu Âu EC (2021/808); khảo sát thực tế trên 27 mẫu sản phẩm thu thập ngẫu nhiên tại các chợ, siêu thị trên địa bàn thành phố Hà Nội và các sàn thương mại điện tử năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng nguyên lý tách sắc ký pha đảo kết hợp kỹ thuật ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization - ESI) và hệ thống phân tích khối phổ ba tứ cực (Triple Quadrupole) vận hành ở chế độ theo dõi đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring - MRM). Đánh giá tính pháp lý và ngưỡng an toàn dựa trên QCVN 8-1:2011/BYT và Commission Regulation (EU) 2023/915. Quá trình thẩm định phương pháp phân tích tuân thủ nghiêm ngặt theo các tiêu chuẩn quốc tế:

  • Hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích dư lượng của Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức quốc tế (AOAC International, 2016).
  • Hướng dẫn thực hiện phương pháp phân tích và diễn giải kết quả của Ủy ban Châu Âu (Commission Implementing Regulation EU 2021/808), quy định số điểm nhận dạng (Identification Points - IP) đạt tối thiểu 5 điểm đối với hệ LC-MS/MS (1 điểm cho thời gian lưu LC, 1 điểm cho tiền ion mẹ và 1,5 điểm cho mỗi ion con).

Hóa chất, dung môi và trang thiết bị nghiên cứu

  • Hóa chất, dung môi: Chuẩn Patulin (Pribolab, độ tinh khiết 99,0%); Methanol (MeOH), Acetonitril (ACN), Amoni acetat ($CH_3COONH_4$) đạt tiêu chuẩn LC-MS (Merck); Ethyl acetat, Acid acetic ($CH_3COOH$), Natri carbonat ($Na_2CO3$), Natri sulfat khan ($Na_2SO_4$) loại tinh khiết phân tích (Merck); nước cất 2 lần.
  • Hệ thống thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu Prominence HPLC 20 AXL ghép nối đầu dò khối phổ Sciex Triple Quad 5500; thiết bị đuổi dung môi bằng dòng khí nitơ Organomation N-EVAP 112; máy ly tâm lạnh Hermle Z326K; máy lắc xoáy IKA Vortex Genius 3; bể siêu âm Elma S 180H; cân phân tích Mettler Toledo (độ chính xác 0,1 mg).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Xây dựng điều kiện MS/MS: Sử dụng kỹ thuật bơm dòng trực tiếp (Flow Injection Analysis - FIA) dung dịch chuẩn Patulin 1 µg/mL vào nguồn ion hóa ESI ở chế độ ion âm ESI(-) để quét tìm ion mẹ $[M-H]^-$, tối ưu hóa năng lượng va chạm (Collision Energy - CE) và thế thoát ô va chạm (Collision Cell Exit Potential - CXP) nhằm chọn 1 ion con định lượng và 1 ion con định tính.
  • Tối ưu hóa sắc ký lỏng: Khảo sát 3 loại cột sắc ký pha đảo C18 (Kinetex XB-C18 150 × 4,6 mm, 3,5 µm; Symmetry C18 150 × 2,1 mm, 3,5 µm; Symmetry C18 150 × 3,0 mm, 3,5 µm) và 5 hệ pha động với các chất biến đổi nồng độ acid formic, amoni format và amoni acetat trong môi trường nước/methanol/acetonitril.
  • Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu: Khảo sát phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) trên các biến số: dung môi chiết (Ethyl acetat so với Ethyl acetat: n-hexan 95:5), thể tích và số lần chiết (chiết 1 lần 50 mL so với 2 lần × 20 mL), phương pháp cô cắn dịch chiết (cô quay chân không so với thổi khí $N_2$), và dung môi hoàn nguyên ($CH_3COOH$ 0,1% trong nước, MeOH, hoặc hỗn hợp $CH_3COOH$ 0,1%/nước : MeOH tỉ lệ 1:1).
  • Thẩm định phương pháp: Đánh giá các thông số gồm độ thích hợp hệ thống (RSD thời gian lưu, diện tích pic qua 6 lần tiêm lặp lại), độ chọn lọc/đặc hiệu, độ tuyến tính và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD, S/N = 3), giới hạn định lượng (LOQ, S/N = 10), độ đúng (độ thu hồi trên mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ), độ chụm (độ lặp lại nội bộ và độ chính xác trung gian khác ngày).
  • Xử lý số liệu: Thu nhận dữ liệu trên phần mềm điều khiển thiết bị Analyst/Multiquant (Sciex) và xử lý thống kê trên Microsoft Excel 2016.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về Patulin và phương pháp phân tích

Chương này tổng kết cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, nguồn gốc sinh học và các nghiên cứu độc tính học của Patulin. Patulin có công thức phân tử $C_7H_6O_4$, phân tử lượng 154,12 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 111 °C, bền vững trong môi trường acid nhưng không bền trong môi trường kiềm. Về độc tính tế bào, Patulin có ái lực cao với nhóm thiol (-SH), ức chế hoạt tính của glutathion (GSH) và hàng loạt enzyme quan trọng như $Na^+/K^+$ ATPase, RNA polymerase.

Chương tổng quan phân tích chi tiết các quy định pháp lý của EU, WHO và Bộ Y tế Việt Nam về ngưỡng MRL. Đồng thời, tác giả khảo sát hệ thống tài liệu về các phương pháp định lượng Patulin trên thế giới và tại Việt Nam:

  • Phương pháp GC-MS đòi hỏi dẫn xuất hóa phức tạp do Patulin có độ phân cực cao.
  • Phương pháp HPLC-UV/PDA theo TCVN 9523:2012 có giới hạn định lượng tương đối cao, quy trình xử lý mẫu qua cột chiết pha rắn (SPE) phức tạp và tốn kém.
  • Phương pháp LC-MS/MS được khẳng định là công cụ vượt trội nhờ khả năng định danh dựa trên mảnh phân đoạn khối phổ đặc trưng, loại bỏ nguy cơ dương tính giả trên nền thực phẩm phức tạp.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị và thiết kế thực nghiệm. Tác giả xây dựng quy trình chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc (10 µg/mL), chuẩn trung gian (1 µg/mL) trong dung môi ACN bảo quản ở 2–8 °C bền trong 3 tháng; dãy chuẩn làm việc từ 30 ppb đến 2000 ppb pha trong hỗn hợp MeOH : $H_2O$ pH=4 (1:1, v/v) bền trong 7 ngày.

Quy trình xử lý mẫu sơ bộ được thiết lập gồm 5 bước: acid hóa mẫu bằng $CH_3COOH$ 2%, chiết lỏng - lỏng bằng ethyl acetat, làm sạch dịch chiết bằng dung dịch $Na_2CO_3$ 1,5% để loại bỏ acid hữu cơ và tạp phân cực, làm khan qua $Na_2SO_4$, cô cạn và hoàn nguyên. Các công thức toán học tính toán hiệu ứng nền ($ME%$), độ thu hồi, độ lệch chuẩn tương đối ($RSD%$), độ lệch tỉ số ion ($R_{diff}%$) và tiêu chuẩn nghiệm thu theo AOAC 2016, EC 2021/808 được quy định rõ ràng.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương này trình bày toàn bộ kết quả thực nghiệm tối ưu hóa và thẩm định phương pháp:

  1. Tối ưu hóa thông số MS/MS: Chế độ bắn ion âm ESI(-) tạo ra ion phân tử $[M-H]^-$ có tín hiệu mạnh nhất tại $m/z = 153$. Phân mảnh ion này thu được 2 ion con đặc trưng: ion định lượng $m/z = 81$ (CE = -23 eV, CXP = -30 V) và ion định tính $m/z = 109$ (CE = -21 eV, CXP = -15 V). Các thông số nguồn ion được ấn định: CUR = 20 psi, CAD = 8 psi, điện áp ion hóa IS = -4500 V, nhiệt độ nguồn TEM = 450 °C, GS1 = GS2 = 50 psi, EP = -9 V. Phương pháp đạt 5 điểm IP theo tiêu chuẩn Châu Âu.

  2. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Cột Symmetry C18 (150 × 3,0 mm, 3,5 µm) cho hình dạng pic đối xứng, nhọn và diện tích đáp ứng cao nhất so với các cột khảo sát. Hệ pha động tối ưu gồm Kênh A ($CH_3COONH_4$ 10 mM trong $H_2O$) và Kênh B ($CH_3COONH_4$ 10 mM trong MeOH) chạy theo chương trình gradient nồng độ (0–1,5 phút: 5% B; 4–7 phút: 100% B; 8–10 phút: 5% B) với tốc độ dòng 0,4 mL/phút, thể tích tiêm 20 µL, thời gian lưu của Patulin đạt khoảng 5,92 phút.

Thông số thiết bị Giá trị tối ưu
Cột sắc ký Symmetry C18 (150 mm × 3,0 mm × 3,5 µm)
Pha động Kênh A: $CH_3COONH_4$ 10 mM trong $H_2O$
Kênh B: $CH_3COONH_4$ 10 mM trong MeOH
Tốc độ dòng 0,4 mL/phút
Thể tích tiêm 20 µL
Nguồn ion hóa ESI âm, chế độ MRM
Cặp chuyển khối (MRM) $153 \rightarrow 81$ (Định lượng); $153 \rightarrow 109$ (Định tính)
Điện áp / Nhiệt độ nguồn IS = -4500 V; TEM = 450 °C

  1. Tối ưu hóa xử lý mẫu:

    • Dung môi chiết: Ethyl acetat cho đáp ứng pic cao hơn hỗn hợp Ethyl acetat : n-hexan (95:5).
    • Thể tích chiết: Chiết 2 lần × 20 mL cho hiệu suất thu hồi vượt trội so với chiết 1 lần × 50 mL.
    • Cô dung môi: Kỹ thuật thổi khô bằng dòng khí $N_2$ cho diện tích pic cao hơn cô quay chân không do hạn chế thất thoát và dễ hoàn nguyên hoàn toàn lượng cắn bám trên thành ống ly tâm 50 mL so với bình cầu 100 mL.
    • Dung môi hoàn nguyên: Hỗn hợp $CH_3COOH$ 0,1%/nước : MeOH (1:1, v/v) giúp hòa tan triệt để Patulin mà vẫn giữ pic sắc ký cân đối, không bị đổ đầu như khi dùng MeOH nguyên chất.

  2. Đánh giá ảnh hưởng nền (Matrix Effect - ME): Hiệu ứng nền trên nền mẫu rắn đạt $ME = 72,7%$ và nền mẫu lỏng đạt $ME = 113,6%$. Cả hai giá trị đều vượt ngưỡng $\pm 20%$, chứng tỏ nền mẫu gây tăng tín hiệu ion hóa rất lớn. Do đó, nghiên cứu bắt buộc phải sử dụng đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng (matrix-matched calibration curve) để định lượng chính xác.

  3. Kết quả thẩm định phương pháp:

    • Độ ổn định hệ thống: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn 100 ppb cho $RSD$ thời gian lưu = 0,13% và $RSD$ diện tích pic = 1,68% (đạt yêu cầu $\le 2,0%$).
    • Độ chọn lọc: Mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian lưu của Patulin. Độ lệch tỉ số ion ($R_{diff}%$) giữa mẫu thêm chuẩn và chuẩn dung môi đạt 5,5% (nền rắn) và 3,7% (nền lỏng), nằm trong giới hạn cho phép $\pm 20%$ của EC 2021/808.
    • Độ tuyến tính: Khoảng nồng độ 30–2000 ppb trên dịch (tương ứng 6–400 µg/kg trên mẫu) đạt độ tuyến tính tuyệt đối:
      • Nền rắn: $y = 0,0079x - 0,0115$ ($R^2 = 0,9997$), độ chệch từ -4,8% đến 2,7%.
      • Nền lỏng: $y = 0,0094x + 0,3211$ ($R^2 = 0,9996$), độ chệch từ -13,9% đến 3,4%.
    • LOD và LOQ: Giới hạn phát hiện của phương pháp là LOD = 2 µg/kg ($S/N = 5,2$ trên nền rắn; $3,3$ trên nền lỏng); giới hạn định lượng LOQ = 6 µg/kg ($S/N = 15,6$ trên nền rắn; $10,6$ trên nền lỏng).
Chỉ tiêu thẩm định Kết quả trên nền rắn Kết quả trên nền lỏng Yêu cầu AOAC / EC
Độ ổn định hệ thống $RSD_{t_R} = 0,13%$; $RSD_S = 1,68%$ - $RSD \le 2,0%$
Độ lệch tỉ số ion ($R_{diff}$) 5,5% 3,7% $\le \pm 20%$
Khoảng tuyến tính 6 – 400 µg/kg ($R^2 = 0,9997$) 6 – 400 µg/kg ($R^2 = 0,9996$) $R^2 \ge 0,995$; Độ chệch $\le \pm 15%$
LOD / LOQ 2 µg/kg / 6 µg/kg 2 µg/kg / 6 µg/kg $S/N \ge 3$ / $S/N \ge 10$
Độ thu hồi (mức 30–1000 ppb) 80,9% – 110,0% 89,1% – 106,0% 80% – 110%
Độ lặp lại ($RSD$, n=6) 5,4% – 9,5% 1,4% – 3,0% $< 11% – 21%$
Độ chính xác trung gian ($RSD$) 2,3% 6,1% $< 15%$
  1. Phân tích mẫu thực tế: Áp dụng phương pháp trên 27 mẫu thương mại:
Nhóm mẫu thực tế Ký hiệu mẫu Số lượng mẫu Số mẫu phát hiện (< LOQ) Số mẫu dương tính ($\ge$ LOQ) Hàm lượng Patulin cụ thể
Nước ép táo NET-1 đến NET-8 8 1 (NET-7) 0 NET-7 < 6 µg/kg
Quả táo tươi QT-1 đến QT-11 11 0 0 Âm tính (< 2 µg/kg)
Rượu táo RT-1, RT-2 2 2 (RT-1, RT-2) 0 < 6 µg/kg
Giấm táo GT-1, GT-2 2 0 0 Âm tính (< 2 µg/kg)
Thực phẩm trẻ em từ táo TE-1 đến TE-4 4 0 1 (TE-2) TE-2 = 15,1 µg/kg

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Đã thiết lập thành công quy trình phân tích định lượng Patulin bằng LC-MS/MS với quy trình chiết lỏng - lỏng tinh gọn (sử dụng Ethyl acetat, rửa $Na_2CO_3$ 1,5%, hoàn nguyên bằng hỗn hợp $CH_3COOH$ 0,1%/nước : MeOH 1:1).
  • Phương pháp có giới hạn định lượng thấp (LOQ = 6 µg/kg), đáp ứng đầy đủ yêu cầu kiểm nghiệm kiểm soát mức MRL khắt khe nhất hiện nay là 10 µg/kg đối với thực phẩm chế biến cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 36 tháng tuổi.
  • Phân tích 27 mẫu thực phẩm trên thị trường Hà Nội phát hiện 4/27 mẫu có chứa Patulin (tỉ lệ 14,8%), trong đó 3 mẫu phát hiện ở dạng vết dưới LOQ (NET-7, RT-1, RT-2) và 1 mẫu dinh dưỡng cho trẻ em (TE-2) phát hiện hàm lượng 15,1 µg/kg, vượt giới hạn cho phép của Bộ Y tế Việt Nam và EU (MRL = 10 µg/kg).

Đóng góp khoa học và thực tiễn

  • Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam công bố quy trình phân tích hàm lượng Patulin trong táo và sản phẩm từ táo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC-MS/MS.
  • Cung cấp giải pháp định lượng có độ chọn lọc và độ tin cậy pháp lý cao nhờ cơ chế nhận diện 2 mảnh ion phân đoạn (5 điểm IP theo tiêu chuẩn Châu Âu EC 2021/808), khắc phục hoàn toàn nhược điểm dương tính giả thường gặp ở phương pháp HPLC-UV truyền thống.
  • Quy trình xử lý mẫu sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng thay vì chiết pha rắn SPE nhiều bước, giúp tiết kiệm đáng kể chi phí hóa chất, cột chiết và thời gian phân tích mẫu, phù hợp cho việc triển khai thường quy tại các phòng kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu chưa sử dụng chất chuẩn nội đồng vị phóng xạ (như $^{13}C_5$-Patulin hay $^{13}C_7$-Patulin) do điều kiện kinh phí nghiên cứu hạn chế và giá thành chất chuẩn nội rất cao. Dù phương pháp thẩm định đạt độ đúng theo AOAC, việc không có nội chuẩn khiến quy trình bắt buộc phải xây dựng đường chuẩn trên từng loại nền mẫu trắng tương ứng để bù trừ hiệu ứng nền ($ME > 20%$).
  • Quy trình xử lý mẫu chiết lỏng - lỏng chưa loại bỏ hoàn toàn các chất đồng chiết, dẫn đến hiệu ứng nền còn khá cao ($ME = 72,7%$ trên nền rắn và $113,6%$ trên nền lỏng).
  • Số lượng mẫu khảo sát thực tế còn ở mức khiêm tốn (27 mẫu) và tập trung chủ yếu trên địa bàn thành phố Hà Nội.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng ứng dụng quy trình phân tích để kiểm tra giám sát Patulin trên số lượng mẫu lớn hơn tại nhiều vùng địa lý, các chợ đầu mối và kênh bán lẻ trực tuyến nhằm đánh giá toàn diện nguy cơ phơi nhiễm thực phẩm.
  • Tiếp tục nghiên cứu cải tiến các bước làm sạch dịch chiết (khảo sát các chất hấp phụ chọn lọc hoặc vật liệu làm sạch pha rắn thế hệ mới) nhằm giảm thiểu tối đa hiệu ứng nền mẫu ($ME \le \pm 20%$).
  • Phát triển và mở rộng phương pháp phân tích đồng thời Patulin trên các đối tượng nền mẫu phức tạp khác như sữa, rượu lên men, ngũ cốc và các loại trái cây nhiệt đới khác.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị cao đối với:

  • Sinh viên, học viên chuyên ngành: Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học (ngành Dược), Công nghệ thực phẩm, Kỹ thuật Hóa học và Đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm.
  • Cán bộ kỹ thuật phòng kiểm nghiệm: Cung cấp thông số vận hành chi tiết trên thiết bị LC-MS/MS (thông số MRM, thế CE, CXP, điều kiện ion hóa ESI âm) và quy trình xử lý mẫu thực phẩm tối ưu không cần qua cột SPE đắt đỏ.
  • Nghiên cứu phương pháp luận: Cung cấp quy trình bài bản về cách thức thẩm định phương pháp phân tích vết độc tố vi nấm theo chuẩn AOAC và EC (đặc biệt là cách tính điểm nhận dạng IP và đánh giá độ lệch tỉ số ion $R_{diff}$).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lựa chọn chế độ ion hóa ESI âm thay vì ESI dương để phân tích Patulin?

Trong phân tích khối phổ LC-MS/MS, Patulin có cấu trúc phân tử phân cực chứa các nhóm chức oxy hóa ($C_7H_6O_4$). Khi khảo sát bằng kỹ thuật FIA trên nguồn ion hóa phun điện tử ESI, chế độ bắn phá ion âm ESI(-) tạo ra ion phân tử dạng mất proton $[M-H]^-$ tại $m/z = 153$ có cường độ tín hiệu và độ ổn định cao vượt trội so với chế độ ESI(+). Ion mẹ này sau đó phân mảnh va chạm ổn định tạo ra 2 mảnh ion đặc trưng là $m/z = 81$ và $m/z = 109$.

2. Hai mảnh ion con của Patulin được lựa chọn cho mục đích gì và có thông số phân mảnh như thế nào?

Từ ion mẹ $m/z = 153$, nghiên cứu tối ưu hóa năng lượng va chạm thu được:

  • Mảnh ion con $m/z = 81$ (CE = -23 eV, CXP = -30 V): có cường độ tín hiệu cao nhất, được dùng làm ion định lượng.
  • Mảnh ion con $m/z = 109$ (CE = -21 eV, CXP = -15 V): có cường độ thấp hơn, được dùng làm ion định tính. Sự kết hợp giữa 1 ion mẹ và 2 ion con cùng kỹ thuật tách sắc ký lỏng LC đạt tổng điểm nhận dạng IP = 5, đáp ứng quy chuẩn EC 2021/808 để khẳng định chất phân tích mà không lo dương tính giả.

3. Vì sao tác giả chọn phương pháp chiết lỏng - lỏng thay vì chiết pha rắn (SPE)?

Mặc dù nhiều nghiên cứu quốc tế sử dụng đĩa hoặc cột chiết pha rắn (như Oasis HLB, MAX), tác giả lựa chọn chiết lỏng - lỏng bằng dung môi Ethyl acetat kết hợp rửa dịch chiết bằng $Na_2CO_3$ 1,5% vì quy trình này đơn giản, thao tác nhanh, chi phí thấp hơn rất nhiều và dễ triển khai trên diện rộng. Kết quả thẩm định chứng minh phương pháp chiết lỏng - lỏng vẫn đạt độ thu hồi rất cao (80,9% – 110,0%), hoàn toàn đáp ứng tiêu chuẩn AOAC.

4. Tại sao nghiên cứu phải dùng đường chuẩn pha trên nền mẫu trắng (matrix-matched standard) thay vì đường chuẩn pha trong dung môi tinh khiết?

Khi so sánh độ dốc của đường chuẩn trong dung môi ($a = 0,0044$) với đường chuẩn trên nền mẫu trắng dạng rắn ($a = 0,0076$) và dạng lỏng ($a = 0,0094$), hiệu ứng nền mẫu ($ME%$) được tính toán lần lượt là +72,7% và +113,6%. Do $ME%$ vượt xa giới hạn cho phép $\pm 20%$, nền mẫu làm tăng cường độ ion hóa rất mạnh. Để tránh sai số thừa khi định lượng mẫu thực, bắt buộc phải dùng đường chuẩn dựng trên chính nền mẫu trắng tương ứng.

5. Kết quả phân tích 27 mẫu thực tế cho thấy nguy cơ nhiễm Patulin như thế nào?

Trong 27 mẫu khảo sát, có 4 mẫu phát hiện có Patulin (chiếm 14,8%). Trong đó, 3 mẫu (2 mẫu rượu táo và 1 mẫu nước ép táo) phát hiện ở mức vết dưới ngưỡng định lượng (< 6 µg/kg), nằm trong giới hạn an toàn. Tuy nhiên, có 1 mẫu dinh dưỡng đóng lọ dành cho trẻ em làm từ táo (mẫu TE-2) có hàm lượng Patulin là 15,1 µg/kg, vượt quá ngưỡng MRL tối đa cho phép (10 µg/kg) theo quy định của Bộ Y tế và EU, gióng lên hồi chuông cảnh báo về việc kiểm soát nguyên liệu đầu vào trong chế biến thực phẩm cho trẻ nhỏ.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thu Hường đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng độc tố Patulin trong táo và các sản phẩm từ táo bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) kết hợp chiết lỏng - lỏng. Phương pháp đạt độ nhạy cao (LOQ = 6 µg/kg), độ chọn lọc tuyệt đối (IP = 5 điểm), độ thu hồi 80,9% – 110,0% và độ lặp lại cao, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn quốc tế AOAC (2016) và EC (2021/808). Kết quả khảo sát thực tế trên 27 mẫu thương mại đã phát hiện 1 mẫu thức ăn dặm cho trẻ em vượt ngưỡng an toàn cho phép (15,1 µg/kg), khẳng định tính thực tiễn và giá trị ứng dụng cao của phương pháp trong công tác kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm tại Việt Nam.