ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời đại công nghiệp hoá, hiện đại hoá ngày nay, cùng với sự gia tăng các bệnh mạn tính, sức khoẻ là một trong những mối quan tâm hàng đầu của mỗi chúng ta. Y học hiện đại có xu hướng tìm kiếm và phát triển các phương pháp điều trị bệnh tật, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên mà vẫn mang lại hiệu quả. Trong hành trình này, acid carnosic và carnosol là hai hợp chất được phân lập từ cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) - loại cây sử dụng như một loại gia vị nấu ăn, thảo mộc dân gian - đang thu hút sự chú ý lớn từ cộng đồng nghiên cứu y học và dược phẩm. Với đặc tính vượt trội về khả năng chống oxy hoá mạnh mẽ [6], [27], [31], tính kháng khuẩn [11], [23], chống viêm [21], [27], [28], acid carnosic và carnosol đã được nghiên cứu để điều trị nhiều bệnh, từ các bệnh nhiễm trùng đến ung thư [35].
Bên cạnh đó, xu hướng thị trường trên thế giới đang thay đổi, người tiêu dùng tập trung hơn vào sự an toàn và chất lượng của thực phẩm. Dư lượng các chất bảo quản luôn tiềm tàng tác dụng phụ gây hại cho sức khỏe con người. Vì vậy, việc thay thế chất phụ gia tổng hợp bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có nguồn gốc thực vật là xu hướng hiện nay trong ngành thực phẩm. Ở một số quốc gia, chiết xuất hương thảo (với hai hoạt chất chính là acid carnosic và carnosol) đã được sử dụng làm chất phụ gia trong công nghiệp thực phẩm do hoạt tính chống oxy hoá mạnh mẽ, tính kháng khuẩn tự nhiên, giúp ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại, kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm và giảm bớt ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người [47], [48].
Tại Việt Nam, hương thảo là dược liệu sẵn có, được trồng ở một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc, miền Trung, miền Nam, với hàm lượng acid carnosic và carnosol có thể thay đổi tùy theo giống cây, hoàn cảnh môi trường. Vì vậy, cần có phương pháp định lượng nhanh chóng, chính xác, đáng tin cậy để xác định hàm lượng hai hoạt chất này trong mẫu lá hương thảo. Từ đó, có thể kiểm soát nguồn nguyên liệu để lựa chọn các giống hương thảo chất lượng, làm tiền đề cho nghiên cứu thuốc mới và góp phần phát triển ngành công nghiệp thực phẩm. Chính vì vậy, với mục đích xây dựng một phương pháp định lượng hiệu quả, đáng tin cậy, chi phí thấp, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trong hương thảo bằng HPLC” được thực hiện với hai mục tiêu sau: - Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trong bột lá hương thảo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid carnosic và carnosol trong một số sản phẩm hương thảo thu thập trên thị trường. Tổng quan về acid carnosic và carnosol 1. Giới thiệu chung Acid carnosic và carnosol là hai diterpenoid (diterpen phenolic) được phân lập từ cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) và cây xô thơm (Salvia officinalis). Tuy nhiên, trong lá hương thảo (Rosmarinus officinalis), hàm lượng acid carnosic và carnosol cao hơn (∼3% tính theo trọng lượng lá phơi khô) [45].
Các giống hương thảo có hàm lượng acid carnosic và carnosol cao (4 - 10% trọng lượng của lá phơi khô trong không khí) đã được phát triển và các nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần trong dịch chiết hương thảo. Ngoài yếu tố di truyền, hàm lượng acid carnosic và carnosol cũng ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như khí hậu, khả năng chịu bức xạ UV-B, nước, độ mặn, ánh sáng. Acid carnosic và carnosol có chủ yếu ở các bộ phận trên mặt đất (lá, đài hoa, cánh hoa), trong đó hai hoạt chất này được tìm thấy nhiều nhất ở lá [11]. Công thức cấu tạo Hình 1.
Công thức cấu tạo của acid carnosic • Công thức phân tử: C20H28O4 • Tên IUPAC: (4aR,10aS)-5,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-1,3,4,9,10, 10a-hexahydrophenanthren-4a(2H)-carboxylic acid • Trọng lượng phân tử: 332,4 g/mol 1. Tính chất lý hoá • Bột kết tinh màu vàng nhạt đến be nhạt. • Độ tan: không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (chloroform, methanol, ethanol, acetonitril, aceton, ethyl acetat) [9], [43] và CO2 siêu tới hạn [13]. • Dễ bị oxy hoá, bảo quản ở nhiệt độ -200C.
• Tính khử mạnh nhờ 2 nhóm hydroxyl gắn vào nhân thơm (-OH phenol). • Tính acid do có nhóm carboxylic. Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức cấu tạo của carnosol • Công thức phân tử: C20H26O4 • Tên IUPAC: (4aR,9S,10aS)-5,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-1,3,4,9, 10,10a-hexahydro-2H-9,4a-(epoxymethano)phenanthren-12-one • Trọng lượng phân tử: 330,4 g/mol 1.
Tính chất lý hoá • Bột kết tinh màu trắng. • Độ tan: không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, aceton, acetonitril, ethyl acetat, DMSO, DMF) [43]. • Dễ bị oxy hoá, bảo quản ở nhiệt độ -180C ± 40C. • Tính khử mạnh nhờ 2 nhóm hydroxyl gắn vào nhân thơm (-OH phenol).
Tác dụng chống oxy hoá Acid carnosic và carnosol - có tác dụng bảo vệ, giúp chống oxy hóa, giảm stress nhờ cơ chế loại bỏ ROS (Reactive oxygen species - là các gốc tự do sinh ra trong cơ thể) hoặc ức chế quá trình oxy hóa lipid [6], [27], [31], [46]. Acid carnosic là một chất chống oxy hóa mạnh và có thể bảo vệ lipid khỏi bị oxy hóa trên cả in vitro (dung dịch lipid) và in vivo (màng sinh học). Hoạt động dọn gốc tự do thực hiện bởi hai nhóm hydroxyl O-phenolic được tìm thấy ở phân tử. Sau quá trình phản ứng với ROS, acid carnosic được oxy hóa thành các dẫn xuất khác nhau.
Điều thú vị là carnosol - chất chuyển hóa oxy hóa chính của acid carnosic - là chất chống oxy hóa và bảo vệ lipid hiệu quả như acid carnosic. Ngoài ra, các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ acid carnosic khác như rosmanol, epirosmanol hoặc rosemary diphenol cũng có khả năng chống oxy hóa. Vì vậy, khi loại bỏ ROS độc hại, acid carnosic có thể tạo ra nhiều loại chất chống oxy hóa thứ cấp, quá trình này làm tăng khả năng chống oxy hóa của acid carnosic và tạo thành một cơ chế bảo vệ hiệu quả [27], [31]. 3 Chức năng chống oxy hóa của carnosol còn dựa vào cơ chế khác, xảy ra trực tiếp trong quá trình oxy hóa lipid bằng cách ức chế quá trình peroxy hóa lipid.
Carnosol phản ứng trực tiếp với các gốc lipid nên ngăn chặn quá trình chuỗi peroxy hóa lipid [27], [31]. Carnosol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ do loại bỏ các gốc tự do α,α- diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH) và bảo vệ DNA khỏi phản ứng Fenton [26], [42]. Ngoài ra, acid carnosic có hoạt tính chống oxy hóa lớn hơn các chất chống oxy hóa tổng hợp đang được sử dụng rộng rãi như butylat hydroxytoluen (BHT), butylat hydroxyanisole (BHA) trong dầu hướng dương [16], dầu đậu nành [37], dầu hạt tara [25], acid carnosic và carnosol cũng có tác dụng làm tăng tính ổn định của tocopherol trong dầu ngô [22], [11], [12]. Tác dụng kháng khuẩn Chiết xuất hương thảo được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa phụ thuộc vào nồng độ, tính chất hóa học của các hợp chất phenolic (acid carnosic, carnosol) [23].
Đặc biệt khi các chất chiết xuất hòa tan trong dầu, với acid carnosic là hợp chất phenolic chính, vi khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn vi khuẩn Gram âm và hoạt tính kháng khuẩn cũng được cải thiện nhờ sự có mặt của carnosol [23]. Các vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus [30], Listeria [38], hoặc vi khuẩn Gram âm như Escherichia, Salmonella hoặc Campylobacter có phản ứng với acid carnosic. Mặc dù tác dụng với các vi khuẩn không quá nhạy nhưng acid carnosic tạo tác dụng hiệp đồng khi dùng với các thuốc kháng vi khuẩn khác. Trên Tetracyclin, Erythromycin hoặc Ethidium Bromid, tác dụng kháng khuẩn đã được cải thiện lên đến 8 lần với Staphylococcus aureus và 16 lần với Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis bằng cách thêm lần lượt 10 μg/ml và 8 μg/ml acid carnosic.
Bên cạnh đó, người ta cũng cho rằng cấu trúc thân dầu của các hợp chất này cho phép chúng xâm nhập vào màng vi khuẩn, các nhóm cho liên kết hydro của hoạt chất có thể tương tác với các nhóm phosphoryl hóa màng, hoặc acid carnosic hoạt động làm tăng tính thấm của màng [11]. Chiết xuất hương thảo có hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên trong các sản phẩm chăm sóc răng miệng giúp phòng ngừa sâu răng [10]. Hoạt tính kháng khuẩn này cũng được ứng dụng như một chất phụ gia thực phẩm tự nhiên để bảo quản thực phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng nhờ ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại trong thực phẩm, giảm bớt những tác động tiêu cực đến sức khỏe con người [47], [48]. Tác dụng chống ung thư Nghiên cứu tiền lâm sàng cho thấy acid carnosic và carnosol có tác dụng chống ung thư trên cả in vitro và in vivo.
Các thí nghiệm in vivo chỉ ra rằng hai chất này ức chế hình thành khối u, chống xâm lấn và di căn. Ở thử nghiệm in vivo, các thành phần của 4 dịch chiết hương thảo được chứng minh là có hiệu quả trong các loại ung thư: đối với acid carnosic là ung thư miệng, bệnh bạch cầu cấp tính tế bào tủy xương, ung thư đại tràng liên quan béo phì; đối với carnosol là ung thư tuyến tiền liệt [36], ung thư vú, ung thư da, ung thư đại trực tràng [32], khối u ác tính Fibrosarcoma [19], [35]. Tác dụng chống viêm Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ ra các cơ chế chống viêm của acid carnosic và carnosol [27], thể hiện nhiều đặc tính như chống viêm khớp, phổi, da, tim, ruột, thận, thần kinh, các bệnh nội mô cũng như các bệnh viêm liên quan đến tiểu đường và béo phì [21], [28]. Bên cạnh đó, carnosol có tác dụng chống viêm và ngăn ngừa ung thư thông qua cơ chế ngăn chặn sản xuất nitơ oxyd (NO) và hoạt động của gen NO synthase (iNOS) bằng cách ức chế hoạt hóa NF-κB [26].
Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Acid carnosic và carnosol được chứng minh có vai trò dược lý trong việc cải thiện tình trạng oxy hóa khử ở não của động vật có vú, giảm tình trạng viêm thần. Trên in vivo, acid carnosic là tác nhân bảo vệ thần kinh, chống lại căng thẳng do hóa chất gây ra [15]. Cả hai chất được sử dụng như một liệu pháp chống lại các rối loạn thoái hóa thần kinh mãn tính như bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson [41].