Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Trong bối cảnh y học hiện đại và ngành công nghiệp thực phẩm đang hướng tới các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm giảm thiểu tác dụng phụ của các chất bảo quản tổng hợp, cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) nổi lên như một nguồn dược liệu và phụ gia giàu tiềm năng. Hai thành phần diterpenoid phenolic chính trong lá hương thảo là acid carnosic và carnosol đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, kháng khuẩn, kháng viêm, bảo vệ tế bào thần kinh và ức chế sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư.
Tại châu Âu, chiết xuất hương thảo đã được Ủy ban Châu Âu (EC) cấp phép sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm chống oxy hóa với mã số E392 từ năm 2010, trong đó giới hạn sử dụng và tiêu chuẩn chất lượng được quy định dựa trên tổng hàm lượng của acid carnosic và carnosol. Tại Việt Nam, hương thảo được di thực và trồng tại một số vùng thuộc trung du miền núi phía Bắc, miền Trung và miền Nam. Do hàm lượng hai hoạt chất này biến động lớn theo điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu và giống cây, việc kiểm soát hàm lượng là yêu cầu cấp thiết. Tuy nhiên, trước thời điểm nghiên cứu, tại Việt Nam chưa có phương pháp tiêu chuẩn được công bố để định lượng đồng thời cả hai chất trên nền thực phẩm và dược liệu.
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Thanh Mai (Mã sinh viên: 1901430, Trường Đại học Dược Hà Nội, thực hiện năm 2024 tại Khoa Hóa phân tích & Kiểm nghiệm thuốc và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia) được triển khai nhằm giải quyết vấn đề trên, với hai mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trong bột lá hương thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid carnosic và carnosol trong một số sản phẩm hương thảo thu thập trên thị trường.
- Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất acid carnosic và carnosol.
- Đối tượng phân tích: Các sản phẩm từ hương thảo bao gồm bột lá hương thảo, lá hương thảo khô và trà thảo mộc hương thảo.
- Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Hà Nội, hoàn thành và nghiệm thu vào tháng 6 năm 2024; khảo sát trên 19 mẫu sản phẩm thương mại thu thập ngẫu nhiên tại thị trường Hà Nội.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận dựa trên cơ sở hóa học phân tích và hóa học các hợp chất thiên nhiên. Acid carnosic ($C_{20}H_{28}O_4$, phân tử lượng 332,4 g/mol) và carnosol ($C_{20}H_{26}O_4$, phân tử lượng 330,4 g/mol) đều mang khung diterpen phenolic với 2 nhóm -OH gắn vào nhân thơm, tạo nên tính khử mạnh và khả năng dọn gốc tự do (ROS). Carnosol là sản phẩm chuyển hóa oxy hóa trực tiếp từ acid carnosic nhưng vẫn duy trì hoạt tính chống oxy hóa tương đương. Do cả hai chất đều kém phân cực, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ và có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại, kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC) ghép nối đầu dò mảng diod quang (PDA) là công cụ được lựa chọn.
Quy trình nghiên cứu và thẩm định được thiết kế tuân thủ các hướng dẫn tiêu chuẩn của Hiệp hội các nhà phân tích hóa học chính thức (AOAC 2016) và các chỉ số thẩm định của Dược điển.
| Yếu tố thực nghiệm |
Chi tiết thông số / Phương pháp |
| Thiết bị phân tích |
Hệ thống HPLC Alliance Waters e2695, đầu dò PDA 2998, phần mềm Empower 3 |
| Pha tĩnh (Cột sắc ký) |
Cột Sunfire C18 (4,6 mm x 250 mm; kích thước hạt 5 µm) |
| Pha động |
Acid phosphoric ($H_3PO_4$) 0,1% trong nước - Acetonitril (40:60, tt/tt), chạy đẳng dòng |
| Điều kiện vận hành |
Tốc độ dòng 1,0 ml/phút; thể tích tiêm 10 µl; nhiệt độ cột: phòng; bước sóng phát hiện: 230 nm |
| Chất chuẩn sử dụng |
Acid carnosic (TRC, độ tinh khiết 95,0%); Carnosol (LGC, độ tinh khiết 96,8%) |
| Phương pháp xử lý mẫu |
Chiết lắc ngang trong 20 phút với dung môi $H_3PO_4$ 0,5% trong Methanol |
| Phương pháp thống kê |
Microsoft Excel (tính trung bình, SD, RSD%, hồi quy tuyến tính, F-test, t-test) |
| Nguồn dữ liệu thực tế |
19 mẫu sản phẩm hương thảo thương phẩm thu thập tại Hà Nội |
Nội dung chính theo từng chương
Tổng quan về acid carnosic và carnosol
Chương tổng quan hệ thống hóa các đặc điểm hóa lý, hoạt tính sinh học và các phương pháp phân tích đã được công bố trên thế giới về acid carnosic và carnosol. Tác giả phân tích cơ chế chống oxy hóa thông qua việc dọn gốc tự do của 2 nhóm phenolic hydroxyl và ngăn chặn chuỗi peroxy hóa lipid. Tổng quan cũng tổng hợp các nghiên cứu chứng minh tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Enterococcus), chống ung thư (vú, da, tuyến tiền liệt, đại trực tràng), chống viêm và cải thiện chức năng thần kinh.
Phần tổng quan phương pháp phân tích đã lập bảng đối chiếu các kỹ thuật HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-ELSD, LC-MS/MS và điện di mao quản (CE). Qua đó chỉ ra rằng kỹ thuật HPLC pha đảo với đầu dò PDA là giải pháp tối ưu cho phòng thí nghiệm nhờ tính sẵn có, độ nhạy cao, độ chọn lọc tốt, khoảng tuyến tính rộng và chi phí vận hành hợp lý hơn so với sắc ký khối phổ.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương này quy định chi tiết về đối tượng, nguyên vật liệu, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích và thiết bị phục vụ nghiên cứu. Tác giả xây dựng khung nội dung thực nghiệm gồm 3 bước:
- Xây dựng phương pháp (khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, bước sóng phát hiện và tối ưu quy trình xử lý mẫu).
- Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn AOAC 2016 trên các chỉ tiêu: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ đúng (độ thu hồi).
- Ứng dụng phương pháp định lượng trên 19 mẫu thương phẩm trên thị trường Hà Nội.
Thực nghiệm, kết quả và bàn luận
Chương thực nghiệm trình bày tuần tự quá trình tối ưu hóa các điều kiện phân tích, kết quả thẩm định và ứng dụng thực tế:
- Khảo sát điều kiện sắc ký: Pha động chứa $H_3PO_4$ 0,1% - ACN (40:60, tt/tt) được lựa chọn vì cho pic cân đối, đối xứng, đường nền ổn định và giảm áp suất cột so với hệ dung môi chứa methanol. Bước sóng phát hiện chọn 230 nm do cho tín hiệu đáp ứng hấp thụ quang và tỷ lệ tín hiệu/nhiễu ($S/N$) cao hơn so với bước sóng cực đại (284–285 nm).
- Tối ưu quy trình xử lý mẫu: Dung môi chiết $H_3PO_4$ 0,5% trong methanol ngăn chặn hiệu quả hiện tượng oxy hóa chuyển đổi từ acid carnosic sang carnosol. Thời gian chiết lắc ngang tối ưu là 20 phút (chiết 1 lần). Khối lượng mẫu được rút gọn từ 0,5 g xuống 0,12–0,13 g chiết trong 50 ml dung môi mà không cần pha loãng; kiểm định thống kê $t$-test ($t_{TN} < t_{LT} = 2,228$) khẳng định không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa hai khối lượng cân. Dung dịch mẫu chiết được chứng minh ổn định trong vial suốt 18 giờ ($RSD < 2%$).
Sơ đồ quy trình xử lý mẫu chuẩn hóa:
Mẫu hương thảo -> Xay nhỏ, đồng nhất -> Cân 0,12 - 0,13 g vào ống ly tâm 50 ml
-> Thêm 40 ml H3PO4 0,5% trong MeOH -> Lắc ngang 20 phút -> Ly tâm (6000 rpm, 5 phút, 20°C)
-> Gạn dịch chiết vào bình định mức 50 ml, tráng cắn và định mức vừa đủ -> Lọc qua màng 0,45 µm -> Tiêm HPLC
Kết quả và đóng góp
Kết quả thẩm định phương pháp phân tích theo AOAC 2016
Phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng mọi yêu cầu khắt khe của AOAC:
| Chỉ số thẩm định |
Carnosol |
Acid carnosic |
Yêu cầu (AOAC / Thực nghiệm) |
| Thời gian lưu trung bình ($t_R$) |
10,577 phút ($RSD = 0,2%$) |
18,091 phút ($RSD = 0,1%$) |
$RSD \le 2,0%$ |
| Độ lặp lại diện tích pic ($n=6$) |
$RSD = 1,1%$ |
$RSD = 1,0%$ |
$RSD \le 2,0%$ |
| Hệ số đối xứng pic ($A_S$) |
1,19 |
1,16 |
Đạt độ cân đối |
| Số đĩa lý thuyết ($N$) |
16.651 |
17.245 |
Hiệu lực cột cao |
| Độ đặc hiệu / Độ tinh khiết pic |
Purity factor $\ge 999,9$ |
Purity factor $\ge 999,9$ |
Không có pic tạp xen phủ |
| Giới hạn phát hiện (LOD) |
0,25 µg/ml |
0,30 µg/ml |
$S/N \ge 3$ |
| Giới hạn định lượng (LOQ) |
0,75 µg/ml |
1,00 µg/ml |
$S/N \ge 10$ |
| Khoảng tuyến tính |
2,5 – 200 µg/ml |
2,5 – 200 µg/ml |
7 mức nồng độ |
| Phương trình hồi quy & $R$ |
$y = 14813x - 15715$ ($R = 0,9999$) |
$R = 1,0000$ |
$R \ge 0,995$; Độ chệch $\le \pm 15%$ |
| Độ lặp lại hàm lượng ($n=6$) |
Trung bình 0,316% ($RSD = 1,1%$) |
Trung bình 2,078% ($RSD = 1,4%$) |
$RSD \le 2,7%$ (Carnosol); $\le 1,9%$ (Acid carnosic) |
| Độ chụm trung gian ($n=12$) |
Trung bình 0,310% ($RSD = 2,1%$) |
Trung bình 2,030% ($RSD = 2,8%$) |
$RSD \le 4,0%$ (Carnosol); $\le 3,0%$ (Acid carnosic) |
| Độ đúng (Độ thu hồi, 3 mức) |
97,5% – 102,2% (TB: 99,3% – 101,3%) |
98,8% – 100,6% (TB: 99,5% – 100,2%) |
97% – 103% (Carnosol); 98% – 102% (Acid carnosic) |
Kết quả phân tích mẫu thực tế trên thị trường
Phương pháp đã được ứng dụng để định lượng 19 mẫu sản phẩm hương thảo thu thập tại Hà Nội:
| Nhóm mẫu thực phẩm |
Số lượng mẫu |
Hàm lượng Acid carnosic (% kl/kl) |
Hàm lượng Carnosol (% kl/kl) |
Tổng hàm lượng 2 chất (% kl/kl) |
| Bột lá hương thảo (M1 – M9) |
9 |
2,070 – 3,933 |
0,299 – 0,597 |
2,385 – 4,530 |
| Lá hương thảo khô (L1 – L6) |
6 |
1,788 – 2,452 |
0,221 – 0,330 |
2,009 – 2,780 |
| Trà thảo mộc hương thảo (T1 – T4) |
4 |
2,118 – 2,287 |
0,293 – 0,310 |
2,411 – 2,595 |
Mẫu bột lá hương thảo M8 có hàm lượng hoạt chất cao nhất với 3,933% acid carnosic và 0,597% carnosol (tổng đạt 4,530%).
Đóng góp của đề tài
- Xây dựng hoàn chỉnh một quy trình phân tích đồng thời acid carnosic và carnosol trên nền mẫu hương thảo với điều kiện sắc ký đẳng dòng đơn giản, dễ vận hành, dung môi kinh tế.
- Tối ưu hóa quy trình chiết mẫu với dung môi có acid hóa ($H_3PO_4$ 0,5% trong MeOH) giúp kiểm soát tốt hiện tượng phân hủy và chuyển hóa oxy hóa của hai chất mà không cần bổ sung chất chống oxy hóa ngoại sinh.
- Đóng góp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về hàm lượng acid carnosic và carnosol trong các sản phẩm hương thảo lưu hành tại thị trường Hà Nội, tạo cơ sở cho việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu và phụ gia thực phẩm E392.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế được ghi nhận: Nghiên cứu chưa khảo sát hiệu suất chiết của hệ dung môi aceton và ethanol khi có bổ sung acid phosphoric; các giá trị LOD và LOQ mới được xác định trên dung dịch chất chuẩn pha loãng (đánh giá năng lực thiết bị) chứ chưa thực hiện trên nền mẫu trắng thực tế.
- Hướng mở rộng:
- Khảo sát mở rộng quy trình xử lý mẫu trên các nền mẫu thực phẩm phức tạp hơn có chứa phụ gia E392 như dầu ăn, nước sốt, sản phẩm chế biến từ thịt và cá.
- Xác định LOD, LOQ của phương pháp trên ma trận mẫu thực tế.
- Áp dụng phương pháp để đánh giá sự biến động hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ và vùng trồng hương thảo tại Việt Nam.
Giá trị tham khảo
Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và các kiểm nghiệm viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc, Quản lý chất lượng Dược phẩm và Khoa học Thực phẩm. Phần quy trình khảo sát tối ưu hóa dung môi chiết nhằm ngăn chặn sự chuyển hóa oxy hóa giữa acid carnosic và carnosol là kinh nghiệm thực nghiệm có giá trị cao cho những nghiên cứu về các hợp chất polyphenol kém bền.
Câu hỏi thường gặp
Tại sao tác giả chọn bước sóng 230 nm thay vì bước sóng hấp thụ cực đại 284–285 nm?
Mặc dù phổ hấp thụ UV-Vis cho thấy cực đại hấp thụ của carnosol ở 284 nm và acid carnosic ở 285 nm, nhưng tại bước sóng 230 nm, độ hấp thụ quang học của cả hai chất đều cao hơn đáng kể. Do đó, bước sóng 230 nm mang lại tín hiệu đáp ứng diện tích pic lớn hơn, tỷ lệ tín hiệu/nhiễu ($S/N$) cao hơn, hạn chế ảnh hưởng của nhiễu đường nền và tăng độ nhạy khi định lượng các mẫu có hàm lượng hoạt chất thấp.
Hiện tượng gì xảy ra khi sử dụng Methanol nguyên chất để chiết mẫu và giải pháp xử lý là gì?
Khi chiết bằng methanol nguyên chất không có acid, acid carnosic dễ bị oxy hóa chuyển hóa thành carnosol, làm giảm hàm lượng acid carnosic thực tế và làm tăng giả tạo hàm lượng carnosol. Tác giả đã giải quyết triệt để vấn đề này bằng cách sử dụng hệ dung môi acid phosphoric 0,5% trong methanol ($H_3PO_4$:MeOH tỷ lệ 0,5:99,5), giúp bảo vệ hoạt chất ổn định trong suốt 18 giờ mà không làm giảm hiệu suất chiết như khi bổ sung vitamin C.
Việc giảm khối lượng cân mẫu từ 0,5 g xuống 0,12 g có ảnh hưởng đến độ chính xác không?
Không. Kết quả phân tích lặp lại 6 lần độc lập ở cả hai mức khối lượng cân đều cho giá trị $RSD < 2%$. Kiểm định thống kê $t$-test cho thấy sự khác biệt về hàm lượng thu được giữa hai cách cân là không có ý nghĩa thống kê ($t_{TN} < t_{LT} = 2,228$). Mức cân 0,12–0,13 g giúp loại bỏ bước pha loãng 4 lần, tiết kiệm hóa chất, rút ngắn thời gian và giảm thiểu sai số thao tác.
Mẫu sản phẩm nào trong 19 mẫu khảo sát có hàm lượng hoạt chất cao nhất?
Mẫu bột lá hương thảo ký hiệu M8 có hàm lượng cao nhất trong toàn bộ 19 mẫu phân tích, với hàm lượng acid carnosic đạt 3,933% (kl/kl), carnosol đạt 0,597% (kl/kl) và tổng hàm lượng 2 hoạt chất đạt 4,530% (kl/kl).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thanh Mai đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trong lá hương thảo bằng HPLC-PDA ở điều kiện rửa giải đẳng dòng. Phương pháp đạt đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định khắt khe theo hướng dẫn của AOAC 2016 về tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ đúng. Việc ứng dụng phân tích trên 19 mẫu thương phẩm tại Hà Nội đã chứng minh tính khả thi, độ tin cậy và tiềm năng ứng dụng thực tiễn của quy trình trong công tác kiểm nghiệm dược liệu và kiểm soát chất lượng phụ gia thực phẩm.
