Giới thiệu dự án

Trong bối cảnh nền công nghiệp thực phẩm và dược phẩm hiện đại đang chuyển dịch mạnh mẽ sang xu hướng sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, việc thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp tiềm ẩn nguy cơ gây hại như butylated hydroxytoluene (BHT) hay butylated hydroxyanisole (BHA) trở thành một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất từ lá cây hương thảo (Rosmarinus officinalis) chứa hai hoạt chất diterpenoid phenolic chủ đạo là acid carnosic ($C_{20}H_{28}O_4$) và carnosol ($C_{20}H_{26}O_4$), vốn sở hữu hoạt tính dọn gốc tự do (Reactive Oxygen Species - ROS), kháng khuẩn Gram dương/Gram âm, chống viêm và bảo vệ tế bào thần kinh vượt trội. Năm 2010, Ủy ban Châu Âu (EU) đã chính thức phê duyệt chiết xuất hương thảo làm phụ gia thực phẩm chống oxy hóa dưới mã số E392, với hàm lượng quy định được tính trực tiếp dựa trên tổng nồng độ của acid carnosic và carnosol.

Tại Việt Nam, dược liệu hương thảo đang được di thực và phát triển tại nhiều vùng khí hậu khác nhau. Tuy nhiên, hàm lượng hoạt chất biến thiên lớn phụ thuộc vào thổ nhưỡng, điều kiện chiếu xạ UV-B và kỹ thuật thu hái. Thách thức lớn nhất hiện nay là:

  1. Thiếu một quy trình kiểm nghiệm chuẩn hóa, chi phí tối ưu và có độ tin cậy cao được thẩm định đầy đủ trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Acid carnosic có cấu trúc kém bền, rất dễ bị oxy hóa chuyển hóa thành carnosol trong quá trình xử lý mẫu nếu không kiểm soát tốt dung môi và nhiệt độ trích ly.
  3. Các phương pháp quốc tế sử dụng khối phổ (LC-MS/MS, GC-MS) có chi phí vận hành quá cao, khó triển khai đại trà tại các trung tâm kiểm nghiệm và nhà máy sản xuất trong nước.
                  [Khung phân tử Diterpene Phenolic]
   Acid Carnosic                                       Carnosol
   - C20H28O4 (MW: 332.4 g/mol)                        - C20H26O4 (MW: 330.4 g/mol)
   - Nhóm -COOH tự do + 2 nhóm -OH Phenol             - Vòng Lactone nội phân tử
   - Dễ bị oxy hóa chuyển hóa thành carnosol           - Dẫn xuất oxy hóa bền hơn

Mục tiêu dự án

  1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu tối ưu: Thiết lập điều kiện chiết xuất bảo toàn hoạt chất, ngăn chặn hiện tượng tự oxy hóa acid carnosic thành carnosol mà không làm suy giảm hiệu suất thu hồi.
  2. Thiết lập điều kiện sắc ký HPLC-PDA: Phát triển phương pháp rửa giải đẳng dòng (isocratic) trên cột pha đảo $C_{18}$, tối ưu hóa thời gian lưu và độ phân giải giữa hai pic hoạt chất chính và các hợp chất phenolic thứ cấp.
  3. Thẩm định toàn diện phương pháp theo tiêu chuẩn AOAC (2016): Đánh giá độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại, độ chụm trung gian và độ đúng (độ thu hồi).
  4. Ứng dụng định lượng thực tế: Khảo sát và xác định hàm lượng acid carnosic và carnosol trên 19 mẫu sản phẩm thương mại (bột lá, lá khô, trà thảo mộc hương thảo) lưu hành trên thị trường.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Nghiên cứu tổng quan các công bố quốc tế cho thấy nhiều kỹ thuật phân tích đã được áp dụng đối với diterpenoid trong hương thảo, tuy nhiên mỗi phương pháp đều tồn tại những rào cản kỹ thuật nhất định khi áp dụng tại Việt Nam:

Phương pháp Pha tĩnh & Pha động Xử lý mẫu Ưu điểm Nhược điểm / Hạn chế
HPLC-UV (Đẳng dòng) (Kozłowska et al.) Cột $C_{18}$ ($4.6 \times 150$ mm); $H_3PO_4$ 0.1% : ACN (40:60) Chiết bằng Acetone lạnh Rửa giải nhanh, thiết bị phổ thông Độ chọn lọc chưa tối ưu trên nền mẫu phức tạp
HPLC-PDA-MS (Cuvelier et al.) Cột $C_{18}$ ($3 \times 150$ mm); HCOOH 0.05% : ACN (Gradient) Chiết siêu âm bằng Acetone 100% Định danh cấu trúc chính xác, LOD cực thấp Chi phí thiết bị MS rất cao, bảo trì phức tạp
HPLC-ELSD (Zhang et al.) Cột $C_{18}$ ($4.6 \times 250$ mm); MeOH : Acid acetic 0.6% (Gradient) Chiết siêu âm với MeOH (40 min) Phát hiện được chất không có mang màu Tín hiệu detector ELSD phi tuyến, độ trôi nền lớn
CZE-DAD (Herrero et al.) Mao quản Silica nung chảy; Đệm Borate 40 mM, pH 9.6 Chiết siêu âm với MeOH (1 h) Tiêu tốn ít dung môi Độ lặp lại thời gian di chuyển kém hơn HPLC

Khoảng trống kỹ thuật (Gap Analysis):

  • Việc sử dụng sóng siêu âm trong thời gian dài (30–60 phút) sinh nhiệt cục bộ làm phân hủy acid carnosic.
  • Sử dụng methanol đơn thuần làm dung môi chiết gây chuyển hóa giả tạo acid carnosic thành carnosol.
  • Phương pháp rửa giải gradient tiêu tốn thời gian cân bằng lại cột ($> 15$ phút/mẫu), làm giảm công suất phân tích mẫu hàng loạt.

Thiết kế hệ thống phân tích HPLC-PDA

Giải pháp thiết kế tập trung vào việc chuẩn hóa hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao tích hợp đầu dò dãy diode quang (Photodiode Array Detector - PDA), cho phép đồng thời ghi nhận sắc ký đồ định lượng tại bước sóng tối ưu và kiểm tra độ tinh khiết quang phổ (spectral purity) của từng pic sắc ký.

Cấu hình công nghệ và thông số vận hành:

  • Hệ thống thiết bị: Alliance Waters e2695 HPLC System tích hợp đầu dò Waters 2998 PDA Detector.
  • Phần mềm điều khiển & xử lý tín hiệu: Empower 3 Software.
  • Cột sắc ký (Pha tĩnh): Sunfire $C_{18}$ ($4.6 \text{ mm} \times 250 \text{ mm}$; kích thước hạt $5\ \mu\text{m}$), kiểm soát nhiệt độ phòng ($25^\circ\text{C} \pm 2^\circ\text{C}$).
  • Thành phần pha động: Dung dịch Acid phosphoric ($H_3PO_4$) 0.1% trong nước siêu sạch : Acetonitrile (ACN) theo tỷ lệ thể tích 40:60 (v/v).
  • Chế độ rửa giải: Đẳng dòng (Isocratic Elution).
  • Tốc độ dòng (Flow rate): $1.0\ \text{mL/phút}$.
  • Thể tích tiêm mẫu (Injection volume): $10\ \mu\text{L}$.
  • Bước sóng phát hiện định lượng: $\lambda = 230\ \text{nm}$ (dải quét phổ PDA: $210 - 400\ \text{nm}$).

Quy trình xử lý mẫu chuẩn hóa

Quy trình chiết xuất được thiết kế nhằm tối giản hóa thao tác cơ học và loại bỏ hoàn toàn bước pha loãng trung gian gây sai số:

[Mẫu bột lá hương thảo (đồng nhất)]
[Cân chính xác 0.12 - 0.13 g vào ống ly tâm 50 mL]
[Thêm 40 mL dung môi H3PO4 0.5% trong Methanol]
[Ly tâm lạnh 6000 rpm trong 5 phút ở 20°C]
[Gạn dịch chiết vào bình định mức 50 mL + Tráng cắn + Định mức vừa đủ]
[Lọc qua màng lọc PTFE/RC 0.45 µm trực tiếp vào Autosampler Vial]

Implementation và kết quả

Quá trình thực nghiệm và tối ưu hóa

1. Khảo sát pha động và bước sóng

  • Lựa chọn acid pha động: Tiến hành khảo sát $H_3PO_4$ 0.1% : ACN, Formic acid 0.1% : ACN, và Acetic acid 1% : MeOH. Hệ dung môi $H_3PO_4$ 0.1% : ACN cho đường nền phẳng tuyệt đối, áp suất hệ thống ổn định ($< 1500\ \text{psi}$), hình dạng pic đối xứng cao nhất ($T_f = 1.16 - 1.19$).
  • Tỷ lệ pha động: Tỷ lệ 40:60 (v/v) được chọn vì tại tỷ lệ 30:70 và 35:65 pic carnosol bị xen phủ với tạp chất nền lá; trong khi tỷ lệ 45:55 kéo dài thời gian lưu làm doãng chân pic.
  • Bước sóng phát hiện: Phổ UV-Vis cho thấy cực đại hấp thụ của carnosol ở $284\ \text{nm}$ và acid carnosic ở $285\ \text{nm}$. Tuy nhiên, tại $\lambda = 230\ \text{nm}$, độ hấp thụ phân tử cao gấp 2.4 lần, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu ($S/N$) tăng vượt bậc, cho phép phát hiện chính xác ở dải nồng độ vết.

2. Kiểm soát sự ổn định hoạt chất trong dịch chiết

Thực nghiệm chứng minh khi dùng Methanol đơn thuần, hàm lượng carnosol tăng từ $0.342%$ lên $0.507%$ trong khi acid carnosic giảm từ $2.465%$ xuống $2.032%$ do hiện tượng tự oxy hóa. Bằng cách acid hóa dung môi chiết bằng $H_3PO_4$ 0.5% trong Methanol, hệ thống ngăn chặn hoàn toàn phản ứng phân hủy mà không cần bổ sung Vitamin C (vốn làm giảm hiệu suất trích ly xuống $20%$).

# Thuật toán tính toán hàm lượng hoạt chất từ dữ liệu tích phân sắc ký
def calculate_content(peak_area, slope_a, intercept_b, sample_weight_g, dilution_vol_ml=50.0):
    """
    Tính hàm lượng % (kl/kl) của Acid Carnosic và Carnosol trong mẫu dược liệu
    """
    # Nồng độ tính toán từ phương trình đường chuẩn (µg/mL)
    conc_ug_ml = (peak_area - intercept_b) / slope_a
    
    # Hàm lượng % khối lượng: HL (%) = [C (µg/mL) * V (mL)] / [m (g) * 10^6] * 100
    content_percent = (conc_ug_ml * dilution_vol_ml) / (sample_weight_g * 10000.0)
    return content_percent

Kết quả thẩm định phương pháp (Validation Results)

Phương pháp được thẩm định nghiêm ngặt theo hướng dẫn của AOAC International (2016):

                  KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH THEO AOAC 2016

Bảng thông số kỹ thuật sắc ký và kết quả thẩm định:

Chỉ số thẩm định Carnosol Acid Carnosic Tiêu chuẩn chấp nhận (AOAC) Kết luận
Thời gian lưu trung bình ($t_R$) $10.58\ \text{phút}$ $18.09\ \text{phút}$ $RSD \le 1.0%$ ($RSD_{thực} \le 0.2%$) Đạt
Hệ số đối xứng ($T_f$) $1.19 \pm 0.01$ $1.16 \pm 0.01$ $0.8 \le T_f \le 1.5$ Đạt
Số đĩa lý thuyết ($N$) $16,651 \pm 150$ $17,245 \pm 210$ $N > 2,000$ đĩa Đạt xuất sắc
Độ phân giải ($R_s$) $> 4.5$ $> 4.5$ $R_s \ge 1.5$ Tách hoàn toàn
Độ đặc hiệu / Độ tinh khiết pic $\text{Purity Angle} < \text{Threshold}$ $\text{Purity Angle} < \text{Threshold}$ Phổ đồng nhất 100% Đạt
Dải tuyến tính $2.5 - 200.0\ \mu\text{g/mL}$ $2.5 - 200.0\ \mu\text{g/mL}$ $R \ge 0.995$ Tuyệt đối
Phương trình hồi quy $y = 14813x - 15715$ $y = 14109x - 11847$ $R = 0.9999$ & $R = 1.0000$ Đạt
Độ chệch tuyến tính $-5.1% \text{ đến } +3.5%$ $-3.8% \text{ đến } +2.6%$ $\le \pm 15%$ Đạt
Giới hạn phát hiện (LOD) $0.25\ \mu\text{g/mL}$ $0.30\ \mu\text{g/mL}$ $S/N \ge 3$ Nhạy cao
Giới hạn định lượng (LOQ) $0.75\ \mu\text{g/mL}$ $1.00\ \mu\text{g/mL}$ $S/N \ge 10$ Nhạy cao
Độ lặp lại ($RSD%,\ n=6$) $1.1%$ $1.4%$ $RSD \le 2.7%$ & $RSD \le 1.9%$ Đạt
Độ chụm trung gian ($n=12$) $2.1%$ $2.8%$ $RSD \le 4.0%$ & $RSD \le 3.0%$ Đạt
Độ thu hồi trung bình ($R%$) $99.3% - 101.3%$ $99.5% - 100.2%$ $97.0% - 103.0%$ Đạt
Độ ổn định dung dịch trong Vial 18 giờ ($RSD = 0.7%$) 18 giờ ($RSD = 1.6%$) $RSD \le 2.0%$ sau 12h Bền vững

Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Phương pháp đã được ứng dụng phân tích định lượng thành công trên 19 mẫu sản phẩm thương mại tại Hà Nội:

Hàm lượng Acid Carnosic (%)
       Bột lá hương thảo (M1-M9)    Lá hương thảo khô (L1-L6)   Trà thảo mộc (T1-T4)
  • Bột lá hương thảo (M1 – M9): Hàm lượng acid carnosic dao động từ $2.070%$ đến $3.933%$; carnosol từ $0.299%$ đến $0.597%$. Tổng hàm lượng hoạt chất đạt cao nhất ở mẫu M8 ($4.530%$).
  • Lá hương thảo khô (L1 – L6): Hàm lượng acid carnosic đạt $1.788% - 2.452%$; carnosol đạt $0.221% - 0.330%$.
  • Trà thảo mộc hương thảo (T1 – T4): Hàm lượng acid carnosic đạt $2.118% - 2.287%$; carnosol đạt $0.293% - 0.310%$.

Đổi mới và đóng góp

  1. Đột phá trong kỹ thuật bảo vệ chất phân tích: Khám phá cơ chế ổn định hoạt chất bằng dung môi $H_3PO_4$ 0.5% trong Methanol. Giải pháp này loại bỏ hoàn toàn việc phải bổ sung Vitamin C hay các chất chống oxy hóa ngoại lai – vốn gây cản trở hấp thu quang phổ và làm suy giảm hiệu suất chiết xuất tới $20.9%$.
  2. Tối ưu hóa quy trình phân tích Xanh (Green Analytical Chemistry): Giảm khối lượng mẫu thử xuống $0.12 - 0.13\ \text{g}$, cho phép bỏ qua bước pha loãng thứ cấp. Cải tiến này giúp tiết kiệm $75%$ lượng dung môi hữu cơ tiêu thụ cho mỗi mẻ thử nghiệm, giảm thiểu chất thải độc hại ra môi trường.
  3. Hiệu năng tách sắc ký đẳng dòng vượt trội: Đạt số đĩa lý thuyết $N > 16,600$, hệ số phân giải $R_s > 4.5$ chỉ trong 20 phút chạy đẳng dòng, rút ngắn $40%$ tổng thời gian phân tích so với các chế độ gradient thông thường cần thời gian tái cân bằng cột.
  4. Cơ sở dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam: Cung cấp bộ dữ liệu hoàn chỉnh về hàm lượng chất chống oxy hóa tự nhiên E392 trên các sản phẩm lưu hành thực tế, làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng Dược điển và tiêu chuẩn cơ sở kiểm nghiệm phụ gia thực phẩm.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Khả năng ứng dụng thực tế

  • Kiểm soát chất lượng phụ gia E392: Ứng dụng trực tiếp tại các viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia để định lượng và cấp chứng nhận chất lượng cho chiết xuất hương thảo dùng trong dầu ăn, sản phẩm thịt chế biến và nước sốt.
  • Tiêu chuẩn hóa dược liệu đầu vào: Giúp các doanh nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm sàng lọc và tuyển chọn các giống hương thảo có hàm lượng hoạt chất cao ($> 3%$) phục vụ công nghệ chiết xuất quy mô công nghiệp.
  • Giám sát quy trình bảo quản: Theo dõi tỷ lệ chuyển hóa giữa acid carnosic và carnosol để đánh giá mức độ thoái hóa quang hóa và oxy hóa của sản phẩm trong quá trình lưu thông.
                      LỘ TRÌNH TRIỂN KHAI PHÒNG KIỂM NGHIỆM

Yêu cầu triển khai hệ thống:

  • Thiết bị: Hệ thống HPLC tương thích đầu dò UV/Vis hoặc PDA (Waters, Agilent, Shimadzu), bơm đẳng dòng áp suất tối đa $\ge 4000\ \text{psi}$.
  • Hóa chất & Pha tĩnh: Cột sắc ký $C_{18}$ kích thước $4.6 \times 250\ \text{mm}, 5\ \mu\text{m}$; Acetonitrile và Methanol đạt chuẩn HPLC Grade; Acid phosphoric tinh khiết phân tích ($\ge 85%$).
  • Chi phí ước tính: Giảm chi phí phân tích mẫu xuống chỉ còn khoảng 150.000 – 200.000 VNĐ/mẫu, thấp hơn 5–7 lần so với kỹ thuật LC-MS/MS.

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

  • Phương pháp hiện tại được tối ưu hóa chuyên sâu cho các nền mẫu thực vật khô (bột lá, trà thảo mộc). Khi áp dụng trên các nền mẫu thực phẩm giàu chất béo phức tạp (dầu thực vật, xúc xích, đồ hộp), cần bổ sung bước chiết tách lỏng - lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) để loại bỏ triệt để triglyceride nền.
  • Chưa khảo sát chiết xuất đồng thời các chất chuyển hóa thứ cấp ít phổ biến hơn như rosmanol, epirosmanol hoặc methyl carnosate.

Hướng phát triển tiếp theo

  • Mở rộng nền mẫu: Phát triển quy trình làm sạch mẫu bằng cột SPE $C_{18}$ để ứng dụng định lượng phụ gia E392 trực tiếp trong mẫu dầu chiên và bơ thực vật.
  • Rút ngắn thời gian phân tích: Chuyển giao phương pháp sang hệ thống siêu sắc ký lỏng hiệu năng cao (UHPLC) với cột kích thước hạt sub-$2\ \mu\text{m}$, rút ngắn thời gian phân tích xuống dưới 5 phút/mẫu.
  • Tự động hóa xử lý mẫu: Ứng dụng hệ thống chiết xuất tự động có hỗ trợ áp suất (ASE) nhằm chuẩn hóa hoàn toàn khâu chuẩn bị mẫu trong phòng lab công nghiệp.

Đối tượng hưởng lợi

                               ĐỐI TƯỢNG HƯỞNG LỢI
  • Sinh viên & Học viên ngành Dược/Hóa phân tích: Cung cấp tài liệu thực chứng hoàn chỉnh về phương pháp luận thẩm định phân tích theo chuẩn AOAC 2016, thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa dung môi và xử lý thống kê nâng cao ($F\text{-test}, t\text{-test}$).
  • Kiểm nghiệm viên & Kỹ thuật viên R&D: Sở hữu một quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP) có tính lặp lại cao, hóa chất phổ thông, độ bền dịch chiết lên tới 18 giờ giúp chủ động sắp xếp lịch tiêm mẫu tự động qua đêm.
  • Doanh nghiệp Sản xuất Thực phẩm & Dược phẩm: Giúp doanh nghiệp chủ động kiểm tra chất lượng nguồn nguyên liệu hương thảo, kiểm soát hàm lượng phụ gia chống oxy hóa tự nhiên E392 với chi phí kiểm nghiệm tối thiểu.
  • Cơ quan Quản lý Nhà nước: Cung cấp công cụ kỹ thuật tin cậy phục vụ công tác thanh tra, kiểm tra chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm và phòng chống gian lận thương mại.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao lại chọn bước sóng phát hiện 230 nm thay vì bước sóng cực đại 284 nm?

Mặc dù cực đại hấp thụ quang phổ của carnosol và acid carnosic nằm ở $284 - 285\ \text{nm}$, nhưng độ hấp thụ phân tử ở vùng tử ngoại sâu $230\ \text{nm}$ lớn hơn rất nhiều (tín hiệu chiều cao pic cao gấp hơn 2 lần). Bước sóng $230\ \text{nm}$ mang lại độ nhạy vượt trội, cải thiện đáng kể tỷ lệ $S/N$, giúp hạ thấp giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), cực kỳ thuận lợi khi định lượng mẫu có hàm lượng hoạt chất thấp.

2. Dung dịch mẫu sau khi chiết xuất có thể lưu trữ trong bao lâu trước khi chạy HPLC?

Khảo sát độ ổn định trong vial theo thời gian chứng minh rằng mẫu chuẩn và dịch chiết mẫu thử trong dung môi $H_3PO_4$ 0.5% : MeOH hoàn toàn ổn định trong vòng 18 giờ ở nhiệt độ phòng ($25^\circ\text{C}$) với độ lệch chuẩn tương đối $RSD < 1.6%$, không xảy ra hiện tượng chuyển hóa oxy hóa.

3. Phương pháp có phân tách được acid carnosic và carnosol khỏi các tạp chất nền lá không?

Có. Hệ pha động $H_3PO_4$ 0.1% : ACN (40:60) trên cột Sunfire $C_{18}$ mang lại độ phân giải $R_s > 4.5$. Đầu dò PDA đã kiểm tra độ tinh khiết pic với kết quả $\text{Purity Angle} < \text{Purity Threshold}$ và hệ số tương đồng phổ $\text{Match} \ge 0.998$, khẳng định pic sắc ký hoàn toàn đơn chất, không bị xen phủ bởi chlorophyll hay các polyphenol khác.

4. Tại sao không sử dụng bể rung siêu âm để chiết xuất hoạt chất?

Sóng siêu âm tạo ra hiệu ứng tạo hốc (cavitation) sinh nhiệt cục bộ rất nhanh trong ống nghiệm. Do acid carnosic là hợp chất mẫn cảm nhiệt và dễ bị oxy hóa, việc rung siêu âm ở $45 - 60^\circ\text{C}$ làm suy giảm đáng kể hàm lượng hoạt chất so với phương pháp lắc ngang cơ học 20 phút ở nhiệt độ phòng.

5. Yêu cầu về độ tinh khiết của hóa chất và chất chuẩn khi triển khai quy trình này?

Chất chuẩn acid carnosic và carnosol cần có chứng chỉ phân tích (COA) với độ tinh khiết $\ge 95.0%$, bảo quản nghiêm ngặt ở nhiệt độ $-18^\circ\text{C} \text{ đến } -20^\circ\text{C}$, tránh ánh sáng. Dung môi Acetonitrile và Methanol bắt buộc phải đạt tiêu chuẩn HPLC Grade để tránh gây nhiễu đường nền ở bước sóng thấp $230\ \text{nm}$.

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng và thẩm định toàn diện phương pháp định lượng đồng thời acid carnosic và carnosol trong dược liệu hương thảo bằng kỹ thuật HPLC-PDA. Với điều kiện rửa giải đẳng dòng đơn giản ($H_3PO_4$ 0.1% : ACN = 40:60), dung môi chiết xuất tối ưu ($H_3PO_4$ 0.5% trong MeOH) cùng thời gian xử lý nhanh (20 phút), phương pháp đáp ứng hoàn hảo toàn bộ các tiêu chí khắt khe của chuẩn AOAC 2016 về độ đặc hiệu, độ tuyến tính ($R \ge 0.9999$), độ lặp lại ($RSD \le 1.4%$) và độ đúng ($R% = 99.3 - 101.3%$). Kết quả phân tích 19 mẫu thương mại khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn to lớn của quy trình trong việc chuẩn hóa chất lượng phụ gia thực phẩm E392 và nâng cao giá trị chuỗi dược liệu hương thảo tại Việt Nam.