CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ CHẤT NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về acid azelaic 1. Công thức cấu tạo: Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid azelaic [17] Công thức phân tử: C9H16O4 Phân tử lượng: 188,22 g/mol Tên khoa học: nonanedioic acid [17] b.
Tính chất vật lý: Độ hòa tan trong nước: 2400 mg/L (ở 20 °C) Log P: 1,57 pKa: 4,55 [17] 1. Tác dụng dược lý Acid azelaic là một acid dicarboxylic bão hòa tự nhiên, khi bôi ngoài da, đã được chứng minh là có hiệu quả trong điều trị mụn trứng cá và mụn viêm, cũng như các loại mụn khác. rối loạn tăng sắc tố. Ngoài ra, acid azelaic có tác dụng chống tăng sinh và gây độc tế bào đối với tế bào hắc tố ác tính ở người, và những phát hiện mới đây còn cho thấy rằng nó có thể ngăn chặn sự tiến triển của khối u ác tính ở da.
Với đường dùng tại chỗ, acid azelaic được dung nạp tốt, với các tác dụng phụ rõ ràng chỉ giới hạn ở kích ứng da cục bộ nhẹ và thoáng qua. Do đó, acid azelaic tại chỗ, được sử dụng đơn trị liệu hoặc kết hợp với các phương pháp điều trị khác, có khả năng kiểm soát mụn trứng cá và một số rối loạn tăng sắc tố, đáng chú ý nhất là nám [6]. Với đường bôi ngoài da, sự hấp thu qua da của acid azelaic thấp, chỉ khoảng 3,6% hoạt chất được sử dụng được hấp thụ toàn thân. Khoảng 2% không bị chuyển hóa được đào thải qua nước tiểu trong khoảng thời gian 72 giờ.
Phần còn lại của acid azelaic được 2 hấp thụ qua da bị phân hủy bởi quá trình oxy hóa β thành các acid dicacboxylic có chiều dài chuỗi ngắn hơn (C7, C5), cũng được đào thải qua nước tiểu [15]. Tổng quan về Acid benzoic 1. Công thức cấu tạo: Hình 1.2: Công thức cấu tạo của Acid benzoic [18] Công thức phân tử: C7H6O2 Phân tử lượng: 112,12 g/mol Tên khoa học: benzoic acid [18] b. Tính chất vật lý: Độ hòa tan trong nước: 3400 mg/L (ở 25 °C) Log P:1,87 pKa: 4,207 [18] 1.
Tác dụng kháng khuẩn Acid benzoic là một acid carboxylic thơm có tự nhiên trong mô thực vật và động vật mà cũng có thể được sản xuất bởi các vi sinh vật. Acid benzoic và một loạt các dẫn xuấtvà các hợp chất benzenic có liên quan, chẳng hạn như muối, este alkyl, paraben, rượu benzyl, benzaldehyd và benzoyl peroxid, thường được sử dụng làm chất kháng khuẩn và kháng nấm chất bảo quản và làm chất tạo hương vị trong thực phẩm, mỹ phẩm, vệ sinh và dược phẩm [7]. Khả năng kháng khuẩn của acid benzoic này phụ thuộc rất nhiều vào độ pH. Tác dụng bảo quản chỉ có hiệu quả khi môi trường có độ pH dao động từ 2.
Độ pH càng thấp thì khả năng kháng khuẩn càng cao và ngược lại: pH = 2 – 2.5: Nồng độ acid benzoic cần sử dụng là 0,02 – 0,03% 3 pH = 3.5 – 4: Nồng độ acid benzoic cần sử dụng để tiêu diệt mốc là 0,08%, để diệt nấm men là 0.15% và để diệt vi khuẩn lactic là 0,15 – 0,2%. pH trung tính: Khả năng kháng khuẩn của acid bị giảm hiệu quả đi 300 lần so với pH = 3. Acid benzoic thường được sử dụng với nồng độ từ 0,02% đến 2,5%. Ở Châu Âu, nồng độ tối đa cho phép đối với acid benzoic được sử dụng làm chất bảo quản trong các sản phẩm mỹ phẩm là các sản phẩm rửa sạch, ngoại trừ các sản phẩm chăm sóc răng miệng (2,5%, dưới dạng acid), các sản phẩm chăm sóc răng miệng (1,7%, dưới dạng acid) và sản phẩm còn sót lại (0,5%, dưới dạng acid) [20].
Chính vì vậy cần kiểm soát hàm lượng acid benzoic phù hợp với các quy định và khuyến nghị. Một số phương pháp định lượng acid azelaic và acid benzoic bắng HPLC Qua tra cứu một số nghiên cứu, tôi tổng hợp được một số phương pháp định lượng acid azelaic và acid benzoic dưới đây: Bảng 1.1: Một số phương pháp đinh lượng acid azelaic và acid benzoic Tài liệu Pha tĩnh Pha động Điều kiện khác tham khảo Định lượng acid azelaic Cột Kromasil-C18 Acetonitril- dung dịch đệm Natri - Bước sóng phát hiện (250 x4,6 mm; 5 dihydrophosphat pH 3,5 206 nm - Tốc độ dòng 1,2 [10] µm) (25:75,tt/tt) ml/phút - Nhiệt độ cột 25oC Tiền cột C18 (kích Dung dịch đệm amoni acetat pH - Bước sóng phát hiện thước 4,6 mm x 60 4,5 230 nm - Tốc độ dòng 1,0 mm; 5 µm) Cách pha: Cân 1,0 gam amoni ml/phút acetat vào cốc 1000ml, thêm 500 - Nhiệt độ cột 40oC ml nước và 380 ml Methanol, [16] chỉnh pH đến 4,5±0,1 bằng acid acetic. Thêm nước vừa đủ 1000ml, trộn đều 4 Định lượng acid benzoic Cột C 18 (250 x - Dung môi pha động: -Dung môi pha mẫu 4,6 x 5µm) Kênh A: acid trifluoroacetic 0,1% MeOH-đệm acetat ph trong nước (tt/tt) 4,5±0,1 (1:2, tt/tt) Kênh B: acid trifluoroacetic 0,1% - Bước sóng phát hiện trong acetonitrile/tetrahydrofuran 227 nm tỷ lệ 5/1 (tt/tt) - Tốc độ dòng 1,0 [13] - Chương trình chạy sắc kí: 15 ml/phút phút đầu, kênh B tăng từ 10%- - Nhiệt độ cột 25oC 60%, 5 phút sau đẳng dòng kênh B 90%.6 mm) hydroxid 2,5 mM điều chỉnh bằng ml/phút acid phosphoric tới pH 7,0. - Nhiệt độ cột 40oC Cột sắc ký pha đảo Acetonitril - H2O (20:80, tt/tt) - Bước sóng 230 nm Vydac - Tốc độ dòng 0,5 [8] ml/phút Như vậy,qua các tài liệu trong nước và một số tài liệu nước ngoài, chưa có nhiều tài liệu định lượng đồng acid azelaic và acid benzoic trong gel.
Vì vậy, xây dựng và thẩm định một phương pháp định lượng đồng thời hai chất này sao cho phù hợp với điều kiện hiện có, cũng như tiết kiệm được chi phí là hết sức cần thiết.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.1 Khái niệm HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh sử dụng [4].2 Nguyên tắc Mẫu phân tích được hòa tan trong một dung môi. Pha này là một chất lỏng được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn.
Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và 5 chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng. Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định và là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: sắc ký phân bố, hấp phụ (hay sắc ký cột pha đảo), trao đổi ion và sắc ký rây phân tử.
Trong đó sắc ký cột pha đảo được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm thuốc do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký cột pha đảo [1,4].3 Sắc ký pha đảo Sắc ký cột pha đảo là phương pháp phân tách dựa trên ái lực của các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh [1]. a, Pha tĩnh Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không phân cực như octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5). b, Pha động Pha động là những dung môi phân cực như: nước, methanol (MeOH), acetonitril (ACN). Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký pha đảo là nước.
Những dung môi hòa lẫn được với nước như methanol, ethanol, acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran (THF) và dimethylformamid được thêm vào để điều chỉnh độ phân cực của pha động. Một số thành phần khác cũng có thể được thêm vào pha động như : các acid, base, đệm, chất diện hoạt [2]. Các cặp dung môi được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là: H2O - MeOH và H2O - ACN. Điều dễ nhận thấy, MeOH có nhược điểm là độ nhớt cao của nó có thể làm giảm hiệu lực cột.
Trong khi ACN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp hơn với các chất không phân cực vì thế nó thường được dùng nhiều hơn MeOH. Thời gian lưu sẽ ngắn hơn nếu nồng độ ACN bằng nồng độ MeOH [2]. Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một trong các kỹ thuật phân tích rất hiệu quả để phân tách và định lượng các hợp chất có cấu trúc hóa học gần như nhau trong một hỗn hợp. Vì vậy nó được dùng phổ biến khi mẫu phân tích có nguồn gốc tự nhiên hoặc sinh vật [1].
Các ứng dụng phổ biến của HPLC gồm: 1. Định tính và thử độ tinh khiết Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu cùng với điều kiện sắc ký là những thông tin định tính giúp ta khẳng định sự có mặt của chất phân tích trong mẫu.Với mẫu nhiều thành phần,sắc ký được sử dụng để tách các thành phần trước khi phân tích bằng quang phổ. Ngoài ra, sắc ký còn được dùng để kiếm tra tạp chất trong mẫu. Định lượng Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng các chất có trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Một số phương pháp định lượng hay được áp dụng trong HPLC [2]: - Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn , từ đó sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
• Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với mẫu thử, tiến hành sắc ký cả hai mẫu trong cùng điều kiện. Tính nồng độ mẫu thử theo công thức: 𝑆𝑥 CX = CS 𝑆𝑠 Trong đó: Cx : nồng độ mẫu thử Cs: nồng độ mẫu chuẩn Sx: diện tích của pic mẫu thử Ss: diện tích của pic mẫu chuẩn • Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thị tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiều cao (H) của pic với nồng độ chất chuẩn (C).
Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định [2].