CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về ethylen oxyd và 2-chloroethanol 1. Cấu trúc, tính chất hóa lý của EO và 2-CE Ethylen oxide 2-Chloroethanol Hình 1. Công thức cấu tạo của EO và 2-CE 1.
EO Ethylene Oxide (EO) là ete vòng đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 44,05 g/mol. EO có công thức phân tử là C2H4O. EO là một loại khí không màu,có mùi hơi ngọt, dễ cháy, hòa tan tốt trong nước, ethanol và ete. EO dễ dàng phản ứng với các hợp chất khác nhau khi mở vòng.
Các phản ứng điển hình của nó là với các nucleophile tiến hành theo cơ chế SN2 cả trong môi trường acit (nucleophile yếu: nước rượu) và môi trường kiềm (nucleophile mạnh: OH-, RO-, NH3, RNH2, RR’NH,…). Sơ đồ phản ứng chung là: Hình 1. Sơ đồ chuyển đổi của EO [11] 1. 2-CE 2-chloroethanol (2-CE) là chlorohydrin đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 80,51 g/mol.
2-CE có công thức phân tử là C2H5OCl. 2-CE là chất lỏng không màu, có mùi giống như ete, có thể trộn được với nước. Trong công nghiệp, 2-CE được sử dụng làm chất trung gian hóa học, sản xuất thuốc nhuộm, chất tạo dẻo và nó cũng được dùng làm dung môi trong một số quy trình công nghiệp[9]. 2 Do có 2 nhóm chức alcol và clorid nên chlorohydrin có các phản ứng hóa học đặc trưng của 2 nhóm này.
Phản ứng điển hình của nhóm chlorohydrin là phản ứng dehydroclorid hóa trong môi trường kiềm để tạo thành epoxid tương ứng: Hình 1. Sơ đồ phản ứng chuyển hóa của 2-CE và EO[9] 1. Sự hình thành EO hiếm khi được tìm thấy trong thực phẩm do nhiệt độ hóa hơi thấp (hóa hơi ở 10°C) hoặc phản ứng chuyển đổi thành 2-chloroethanol (2-CE), 2-bromoethanol và ethylene glycol (EG), nổi bật nhất trong số đó là 2-CE[11]. Với cấu trúc dạng vòng linh hoạt, sau khi tiếp xúc với thực phẩm, EO dễ dàng tạo thành các chất chuyển hóa với sự có mặt của phân tử nước, ion clorid và bromid.
Về mặt lý thuyết, ethylene cũng có thể phản ứng với hypochlorid (có trong nước được khử trùng bằng clo) để tạo thành 2-CE. Quá trình này có thể xảy ra ngay khi khử trùng hoặc trong suốt quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản nguyên liệu. Độc tính EO được sử dụng làm chất khử trùng trong công nghiệp do khả năng phản ứng của nó với các nhóm nucleophile và làm hỏng ADN như nhóm carboxyl, amino, phenolic hydroxit hoặc sulfohydryl[20]. Việc tiêu thụ sản phẩm chứa EO về lâu dài có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như ung thư máu, ung thư dạ dày và các loại ung thư khác.
Theo đánh giá của Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang Đức (BfR), không có mức độ an toàn nào cho EO trong thực phẩm, vì vậy ngay cả một lượng nhỏ cũng có thể gây nguy hiểm. EO nhanh chóng biến mất trong thực phẩm thông qua sự bay hơi hoặc phản ứng, vì vậyngười tiêu dùng tiếp xúc với dư lượng liên quan đến EO thông qua tiêu thụ thực phẩm sẽ chủ yếu liên quan đến các sản phẩm phản ứng EO, trong đó nổi bật nhất là 2-CE. Đối với 2-CE, khoảng trống dữ liệu còn quá lớn, dữ liệu về độc tính của 2-CE còn mâu thuẫn và chưa đầy đủ. Các nghiên cứu hiện có cho thấy nó có thể gây ta các tác dụng đột biến gen tương tự như EO.
Do đó, người ta đã quyết định đánh giá 2-CE tương tự như EO về mức độ nguy hiểm[8], [19]. Quy định hiện hành về EO và 2-CE EO được sử dụng do cơ chế gây đột biến ADN ở vi sinh vật, do đó cũng có khả năng gây độc, gây đột biến và gây ung thư ở người. Một số thí nghiệm đã chỉ ra rằng EO làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư hạch và ung thư vú[7],[20] và chất chuyển hóa 2-CE của nó cũng nên được đánh giá tương đương về độc tính[8], [19]. Hiện nay, nhiều quốc gia chưa có quy định về việc sử dụng cũng như dư lượng của EO trong nông nghiệp/thực phẩm.
Một số ít quốc gia và khu vực đã đưa ra quy định nhưng với sự chênh lệch rất lớn. Quốc gia/ khu vực Quy định giới hạn dư lượng trong các loại thực phẩm Liên minh Châu Âu Trong các loại chất phụ gia thực phẩm: 0,01-0,1 mg/kg đối với EO (tổng EO và 2-CE) Đối với hạt mè: 0,05 mg/kg [16] Hoa Kỳ Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng: 7 mg/kg đối với EO; 940 mg/kg đối với 2-CE Canada Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng: 7 mg/kg đối với EO; 940 mg/kg đối với 2-CE Hàn Quốc Giới hạn tạm thời đối với 2-CE: 30 mg/kg trong thực phẩm thông thường, 10 mg/kg đối với thực phẩm cho trẻ sơ sinh. Quy định giới hạn dư lượng EO và 2-CE trong các loại thực phẩm[14] Liên minh châu Âu (EU) từ năm 1991 đã cấm việc sử dụng các sản phẩm có thành phần EO trong khử trùng thực phẩm hay khu vực lưu trữ thực phẩm, tuy nhiên vẫn ghi nhận việc sản phẩm nhập khẩu từ các quốc gia khác có thể có dư lượng chất 4 này[21]. Tại châu Âu, hợp chất này được xếp vào nhóm 1B về khả năng gây ung thư, gây đột biến, độc tính sinh sản và trong nhóm 3 về độc tính cấp [15].
Hoa Kỳ và Canada hiện nay vẫn cho phép sử dụng EO trong khử trùng thảo mộc và rau củ khô. Ở Hàn Quốc, xuất hiện một số sản phẩm mà doanh nghiệp không sử dụng EO trong sản xuất nhưng lại phát hiện thành phần 2-CE. Từ vụ việc này, Hàn Quốc đã ban hành quy định tạm thời về giới hạn dư lượng cho phép đối với chỉ riêng 2-CE. Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định cho phép, cấm sử dụng EO trong sản xuất nông nghiệp hay giới hạn dư lượng EO trong thực phẩm.
Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các phương pháp đã được xây dựng và áp dụng để xác định EO trên thế giới chủ yếu là GC với các kỹ thuật khác nhau như ECD, FID, MS, MS/MS (bảng 1. Dưới đây là một số phương pháp dùng để xác định EO: 5 Kỹ Chất phân LoD/LoQ Tham Chuẩn bị mẫu Thực phẩm thuật tích (mg/ kg) khảo Chiết xuất gia vị khô & đồ GC-FID 2-CE 1 (LoD) [3] acetonitril/metanol gia vị Xử lý bằng NaCl/ [10] GC- Các loại thảo H2SO4, etylic EO + 2-CE 0,050 (LoD) ECD mộc, gia vị,… chiết xuất acetat GC-FID Head Space (HS) EO gia vị 1 (LoQ) [13] Xử lý bằng NaCl/ Tiêu (đen, 0,020 (LoD) GC-MS H2SO4, etylic EO + 2-CE trắng, xanh lá [12] 0,100 (LoQ) chiết xuất acetat cây), hạt tiêu Xử lý bằng NaCl/ Các loại thảo 0,010 (LoD) GC-MS H2SO4, etylic EO + 2-CE mộc, gia vị & [5] 0,050 (LoQ) chiết xuất acetat khô rau Chiết xuất GC-MS QuEChERS EO + 2-CE thực phẩm khô 0,050 (LoQ) [18] /MS và/hoặc QuOil Xử lý bằng NaCl/ GC- H2SO4, Chiết xuất EO + 2-CE Kem 0,01 (LOQ) [4] MS/MS QuEChERS Bảng 1. Một số nghiên cứu phân tích xác định EO Các tài liệu công bố trên đều phân tích EO và 2-CE bằng phương pháp GC với các detector khác nhau như ECD, FID, MS và MS/MS. Việc kiểm định EO trong thực phẩm được tiến hành dựa trên hai phương pháp chính: - Một là phương pháp phân tích GC-MS, dựa trên sự chuyển hóa của EO thành 2- CE, định lượng qui về 2-CE.
Ưu điểm của phương pháp này là khả năng ổn định, chính 6 xác cao, thết bị tương đối phổ biến dễ sử dụng nhưng nhược điểm là tốn thời gian, điều kiện chuyển hóa phức tạp. - Hai là sử dụng kỹ thuật GC-MS/MS phân tích đồng thời EO và 2-CE bằng phương pháp xử lý mẫu QuEChERS. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là xử lí mẫu đơn giản, nhanh chóng, tiết kiệm thời gian, phân tích đồng thời được cả hai chất (EO và 2-CE) với độ nhạy rất cao. Điểm đáng lưu ý là khi sử dụng phương pháp này là tính ổn định, tránh được sự nhầm lẫn giữa EO và acetaldehyde, một đồng phân của EO, dễ hình thành ở nhiệt độ cao từ EO và 2-CE.
Ngoài ra, còn có các phương pháp như không gian hơi (Headspce) hay định lượng EO bằng cách chuyển đổi 2-CE thành EO. Tuy nhiên, các phương pháp này tỏ ra kém hiệu quả do quy trình xử lý mẫu phức tạp, tốn thời gian và có độ nhạy thấp. Tại Việt Nam đã có 2 đề tài nghiên cứu xác định đồng thời EO và dẫn chất của nó 2-CE trong thực phẩm (mỳ, thực phẩm giàu chất béo) bằng GC-MS/MS, mỗi đề tài cho ta thấy những cách tiếp cận xử lý mẫu khác nhau đối với từng loại thực phẩm để có thể tận dụng được ưu nhược điểm của phương pháp phân tích GC-MS/MS. Phương Đối tượng LOQ Nền Chuẩn bị mẫu pháp phân Tham khảo phân tích (mg/kg) tích GC- MS/MS Vtiêm: 4µl Cột TG- QuOil kết hợp WAX (60m chất chuẩn nội x 0,32mm x Dầu EO+2-CE 0,01 [6] và bi thép 1µm) không gỉ TR(phút): EO: 5,87 2-CE: 12,3 2-CE-d4: 12,3 GC- MS/MS Vtiêm: 1µl Cột DB- Gia 624 (60m x vị QuEChERS EO+2-CE 0,01 [1] 0,32mm x mỳ 1,8µm) TR(phút): EO: 4,78 2-CE: 9,27 Bảng 1.
Một số phương pháp ở Việt Nam 7 1. Giới thiệu về GC – MS/MS 1. Sắc ký khí Sắc ký khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dựng trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt, dựa vào ái lực khác nhau của chất phân tích với pha tĩnh và pha động. Pha động trong sắc ký khí là chất khí, được gọi là khí mang.
Khí mang trong GC cần phải có độ tinh khiết cao, trơ về mặt hóa học, phù hợp với detector sử dụng và không gây cháy nổ. Tuy nhiên, khí mang vẫn có lẫn các khí tạp khác và những khí này làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích. Do đó trước khi vào cột, thường có các bộ phận giữ các khí trên lại, còn gọi là bẫy khí. Khí mang trong GC cũng cần phải được kiểm soát về áp suất và tốc độ dòng khí.
Độ chính xác của tốc độ dòng là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ lặp lại của kết quả. Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn và sắc ký khí lỏng. Ngoài ra, trong sắc ký khí còn có các yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình phân tích như là nhiệt độ cột hay cách tiêm mẫu. Tùy thuộc vào chất phân tích và loại cột sử dựng mà ta chọn nhiệt độ cột và cách tiêm mẫu khác nhau.
Chất phân tích được pha động đưa vào trong cột dưới dạng hơi, van điều áp đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột tới bộ phận phát hiện là detector.