Luận văn thạc sĩ hus xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp pcr đa mồi

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật phân tích hus xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề

• Tác giả: Đào Thanh Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Tất Trung
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người
• 1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới
• 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người
• 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
• 1.2.2. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
• 1.2.3. Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh
• 1.2.4. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn
• 1.2.5. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn
• 1.2.5.1. Kỹ thuật PCR
• 1.2.5.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi)
• 1.2.6. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người
• 1.2.7. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết
• 1.2.8. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người “làm giàu” ADN vi khuẩn
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
• 2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm
• 2.3.2. Các máy và thiết bị chính
• 2.4. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi
• 2.5. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.6. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm
• 2.7. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
• 2.8. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi
• 2.9. Giải trình tự gen
• 2.10. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi
• 2.11. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN
• 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh
• 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ
• 3.1.3. Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh
• 3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae
• 3.1.5. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella
• 3.1.6. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
• 3.1.7. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis
• 3.1.8. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E.
• 3.1.9. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae
• 3.1.10. Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh
• 3.1.11. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương
• 3.1.12. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương
• 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘LÀM GIÀU’ ADN VI KHUẨN
• 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau
• 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn
• 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp tách chiết
• 3.2.4. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp tách ADN không qua xử lý
• 3.2.5. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử dụng kit thương mại MolYsis
• 3.2.6. Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu
• 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn Enterobacteriaceae và bệnh nhiễm trùng

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là một trong những tác nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng ở người. Chúng thường gây ra các bệnh lý như nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, và nhiễm trùng đường tiết niệu. Việc phát hiện sớm và chính xác các vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc điều trị và quản lý bệnh nhân. Phương pháp PCR đa mồi đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn này.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh

Các vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Salmonella thường có khả năng gây bệnh cao. Chúng có thể gây ra các bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học và dịch tễ học của các vi khuẩn này là cần thiết để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

1.2. Tình hình nhiễm trùng do Enterobacteriaceae ở Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm trùng do các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae đang gia tăng. Nghiên cứu cho thấy rằng Escherichia coli là tác nhân phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn huyết. Việc phát hiện sớm và chính xác các vi khuẩn này sẽ giúp cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán hiện có, nhưng việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh vẫn gặp nhiều thách thức. Phương pháp cấy khuẩn truyền thống thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ nhạy cao. Hơn nữa, sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho các phản ứng PCR, dẫn đến kết quả dương tính giả.

2.1. Hạn chế của phương pháp cấy khuẩn truyền thống

Phương pháp cấy khuẩn truyền thống thường yêu cầu thời gian từ 18-72 giờ để có kết quả. Trong thời gian này, tình trạng của bệnh nhân có thể xấu đi. Hơn nữa, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể được nuôi cấy thành công, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí.

2.2. Vấn đề với ADN người trong mẫu bệnh phẩm

Sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho phản ứng PCR, làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Do đó, việc loại bỏ ADN người trước khi thực hiện PCR là rất cần thiết để nâng cao chất lượng chẩn đoán.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện vi khuẩn

Phương pháp PCR đa mồi cho phép phát hiện nhiều loại vi khuẩn trong cùng một phản ứng. Điều này giúp tiết kiệm thời gian và tăng độ nhạy của phương pháp chẩn đoán. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Nguyên lý hoạt động của PCR đa mồi

PCR đa mồi hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại các đoạn ADN mục tiêu bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau. Điều này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại vi khuẩn trong một mẫu bệnh phẩm, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

Để đạt được kết quả tốt nhất từ phương pháp PCR đa mồi, cần tối ưu hóa các điều kiện như nồng độ mồi, nhiệt độ phản ứng và thời gian khuếch đại. Việc này giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng, giảm thiểu khả năng dương tính giả.

IV. Ứng dụng thực tiễn của PCR đa mồi trong chẩn đoán

Việc áp dụng phương pháp PCR đa mồi trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp PCR đa mồi có thể phát hiện đồng thời nhiều loại vi khuẩn gây bệnh trong một mẫu bệnh phẩm. Điều này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

4.2. Tác động của PCR đa mồi đến điều trị bệnh

Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh giúp bác sĩ có thể chỉ định kháng sinh phù hợp ngay từ đầu, từ đó cải thiện kết quả điều trị và giảm thiểu tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Phương pháp PCR đa mồi đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của phương pháp này trong chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng khác.

5.1. Tương lai của phương pháp PCR trong chẩn đoán

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, phương pháp PCR có thể được cải tiến hơn nữa để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu. Điều này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của PCR đa mồi trong các tình huống lâm sàng khác nhau. Việc này sẽ giúp xác định rõ hơn vai trò của phương pháp này trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhiễm trùng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm khuẩn huyết là một trong những bệnh lý cấp tính nguy hiểm hàng đầu trong y khoa với tỷ lệ tử vong và biến chứng lâm sàng đặc biệt nghiêm trọng. Theo các thống kê y tế quốc tế, chỉ riêng tại Hoa Kỳ mỗi năm ghi nhận khoảng 750.000 ca nhiễm khuẩn huyết, trong đó số ca tử vong đã gia tăng từ 18.500 lên hơn 31.000 trường hợp, chiếm khoảng 2% tổng số bệnh nhân nhập viện và chiếm tới 75% các ca điều trị tại các đơn vị Hồi sức tích cực. Tại khu vực Nam Á và Đông Nam Á, các nghiên cứu dịch tễ học tổng hợp chỉ ra rằng nhóm trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae chiếm tới 60,6% tổng số ca nhiễm khuẩn huyết, trong đó ở người trưởng thành tỷ lệ này lên tới 77,4%. Các mầm bệnh phổ biến hàng đầu được ghi nhận bao gồm Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica và Proteus mirabilis.

Vấn đề cốt lõi trong thực hành lâm sàng hiện nay là việc áp dụng phương pháp cấy máu truyền thống thường mất thời gian kéo dài từ 18 đến 72 giờ. Sự chậm trễ này tác động tiêu cực trực tiếp đến khả năng sống sót của bệnh nhân, bởi nguy cơ tử vong do nhiễm khuẩn huyết ước tính tăng thêm khoảng 10% sau mỗi giờ trì hoãn dùng kháng sinh thích hợp. Mặt khác, cấy máu thường đòi hỏi thể tích bệnh phẩm lớn từ 3 đến 5 ml và rất dễ cho kết quả âm tính giả nếu bệnh nhân đã được xử lý kháng sinh phổ rộng trước đó. Dù kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng chuỗi trùng hợp thông thường mang lại độ nhạy cao, việc triển khai trong chẩn đoán máu gặp hai rào cản lớn: hiện tượng ức chế phản ứng do lượng thừa ADN người trong máu cao gấp hàng nghìn lần so với ADN vi sinh vật, và sự bắt cặp chéo của mồi vào các trình tự bảo tồn tiến hóa.

Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết đó, đề tài nghiên cứu được thực hiện với hai mục tiêu cụ thể: xây dựng thành công quy trình kỹ thuật PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người kết hợp thiết lập công nghệ ly giải chọn lọc để loại bỏ ADN người làm giàu ADN vi khuẩn; đồng thời bước đầu đánh giá giá trị ứng dụng của hệ thống kỹ thuật này trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn từ tháng 01/2014 đến tháng 12/2014. Kết quả của luận văn mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc khi rút ngắn thời gian phát hiện mầm bệnh xuống dưới 6 giờ, đồng thời mở ra giải pháp chẩn đoán phân tử có chi phí tối ưu, sẵn sàng phục vụ công tác hồi sức cấp cứu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử về phản ứng chuỗi trùng hợp đa mồi, cho phép khuếch đại đồng thời nhiều trình tự gen đích đặc hiệu trong cùng một ống phản ứng thông qua các cặp mồi oligonucleotide chuyên biệt. Kỹ thuật này kế thừa nguyên lý biến tính nhiệt ở 94°C đến 95°C, gắn mồi đặc hiệu trong dải nhiệt độ tối ưu và kéo dài chuỗi ở 72°C dưới sự xúc tác của enzyme chịu nhiệt DNA polymerase, tạo ra sự gia tăng hàm lượng vật chất di truyền lên tới 10 mũ 6 lần sau 30 chu kỳ phản ứng.

Khung lý thuyết then chốt thứ hai là cơ sở sinh hóa về sự khác biệt cấu trúc màng tế bào giữa sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ. Màng tế bào bạch cầu người có bản chất là lớp màng phospholipid kép mềm dẻo, rất dễ bị phá hủy bởi các dung môi phân cực, chất diện hoạt như SDS, Triton X-100 và môi trường kiềm tính. Ngược lại, màng tế bào vi khuẩn có cấu trúc vách peptidoglycan liên kết chéo vững chắc kết hợp mạng lưới phân tử glycan phức tạp, có khả năng chống chịu bền bỉ trước các điều kiện đệm kiềm và chất tẩy rửa trong một khoảng thời gian nhất định. Nguyên lý này cho phép dung dịch đệm MCLB1 phá vỡ có chọn lọc tế bào máu người và làm đứt gãy hệ gen vật chủ mà vẫn giữ nguyên vẹn tế bào vi khuẩn để phục vụ quá trình ly tâm thu hồi và làm giàu.

Hệ thống nghiên cứu tập trung vào 5 khái niệm phân tử và gen chỉ thị cốt lõi:

1. Enterobacteriaceae: Họ vi khuẩn đường ruột Gram âm kỵ khí tùy tiện với vùng gen bảo tồn 16S ribosomal RNA kích thước 424 bp.
2. Escherichia coli: Xác định thông qua gen đích S-uidA kích thước 773 bp mã hóa enzyme beta-D-glucuronidase.
3. Klebsiella pneumoniae: Nhận diện đặc hiệu qua gen đích aldA kích thước 324 bp mã hóa aldehyde dehydrogenase A.
4. Proteus mirabilis: Phát hiện bằng gen đích ureR kích thước 406 bp mã hóa protein điều hòa tổng hợp enzyme urease.
5. Salmonella sp.: Xác định thông qua đoạn gen flagellin kích thước 254 bp mã hóa protein cấu trúc lông roi. Hệ thống sử dụng thêm đoạn gen nội chuẩn β-globin kích thước 180 bp từ hệ gen người để kiểm soát chất lượng tách chiết và hiệu quả loại bỏ tế bào lympho.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực nghiệm phân tích đối chứng, thực hiện tại Khoa Sinh học phân tử phối hợp cùng Khoa Vi sinh thuộc Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm tổng cộng 74 mẫu vi sinh vật chuẩn và đối chứng lâm sàng. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng để thiết lập hai hệ thống bảng mẫu độc lập:

• Nhóm mẫu chuẩn dương gồm các chủng E. coli, K. pneumoniae, Salmonella sp., P. mirabilis đã biết trước nồng độ và được pha loãng theo gradient từ 10 mũ 4 CFU/ml đến 10 mũ 0 CFU/ml trong máu toàn phần của người khỏe mạnh.
• Nhóm mẫu chứng âm nhằm đánh giá phản ứng chéo gồm ADN tách chiết từ các vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae), vi khuẩn Gram âm ngoài họ (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii), các loại virus huyết thanh học (HBV, EBV, HSV), nấm và ADN người khỏe mạnh.

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích tin sinh học kết hợp giải trình tự chu kỳ kết thúc huỳnh quang là nhằm đảm bảo tính chính xác tuyệt đối trong thiết kế mồi. Tác giả sử dụng phần mềm Vector NTI 11.0 và công cụ BLAST của NCBI để thiết kế các cặp mồi có nhiệt độ nóng chảy tương đồng dao động quanh 56°C đến 60°C, kiểm soát triệt để hiện tượng primer-dimer và đảm bảo sản phẩm khuếch đại có độ chênh lệch kích thước tối thiểu từ 80 đến 100 bp, hỗ trợ phân tách rõ ràng trên bản điện di agarose 2%. Toàn bộ các sản phẩm PCR đơn mồi sau đó đều được tinh sạch và khẳng định trình tự bằng hệ thống giải trình tự tự động CEQ 8800 của hãng Beckman Coulter.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tách chiết và đo độ hấp thụ quang phổ trên 74 mẫu ADN vi sinh vật thu nhận được nồng độ trung bình đạt 89,18 ± 30,05 ng/µl, giá trị thấp nhất là 59,13 ng/µl và cao nhất đạt 119,22 ng/µl. Độ tinh sạch A260/A280 của 100% mẫu phân tích đạt giá trị trung bình 1,82 ± 0,093, nằm hoàn toàn trong ngưỡng tiêu chuẩn từ 1,73 đến 1,92, khẳng định chất lượng mẫu ADN đáp ứng tối đa yêu cầu phản ứng nhân gen.

Quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi xác định được điều kiện phản ứng lý tưởng tại nhiệt độ gắn mồi 56°C, nồng độ ion Mg2+ đạt 3 mM và nồng độ dNTP đạt 200 µM. Trên bản điện di gel agarose 2%, bộ mồi EPKS cùng mồi nội chuẩn phân tách thành các băng vạch huỳnh quang sắc nét tương ứng từng kích thước lý thuyết: S-uidA (773 bp), họ Enterobacteriaceae (424 bp), ureR (406 bp), aldA (324 bp), flagellin (254 bp) và β-globin (180 bp), không xuất hiện bất kỳ sản phẩm phụ hay dimer mồi nào.

Kết quả giải trình tự gen và đối chiếu ngân hàng dữ liệu GenBank thông qua thuật toán BLAST xác nhận độ tương đồng rất cao giữa sản phẩm khuếch đại thực nghiệm với trình tự chuẩn quốc tế: đoạn gen aldA của K. pneumoniae đạt độ tương đồng 99%, gen ureR của P. mirabilis đạt 98%, gen 16S rRNA của họ Enterobacteriaceae đạt 96% và gen flagellin của Salmonella sp. đạt 94%.

Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm máu bằng dung môi phân cắt hồng cầu và bạch cầu MCLB1 kết hợp đệm trung hòa pH 4.0 chứng minh khả năng loại bỏ tới hơn 99% lượng ADN người tồn dư, đưa nồng độ ADN vật chủ trong dịch chiết xuống dưới ngưỡng 10 ng/ml. Khả năng loại bỏ ADN người thông qua theo dõi tín hiệu Realtime PCR gen β-globin cho thấy dung môi tự pha chế đạt hiệu suất tương đương với kit thương mại MolYsis đắt tiền của châu Âu, đồng thời duy trì nguyên vẹn nồng độ ADN vi khuẩn mục tiêu ở ngưỡng phát hiện từ 10 mũ 0 đến 10 mũ 1 CFU/ml máu.

Thảo luận kết quả

Khi xem xét hiệu quả chẩn đoán, trong thực tế lâm sàng tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 giai đoạn 2010-2013, tỷ lệ cấy máu dương tính chỉ đạt 11,7% trên tổng số 8.134 ca nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết. Sự hạn chế này bắt nguồn từ việc vi khuẩn bị ức chế sau các đợt điều trị kháng sinh ban đầu hoặc nồng độ vi khuẩn trong tuần hoàn thấp dưới 100 CFU/ml. Việc ứng dụng quy trình PCR đa mồi phối hợp kỹ thuật làm giàu mẫu giải quyết triệt để vấn đề âm tính giả của nuôi cấy và dương tính giả do bắt chéo của PCR thông thường.

Toàn bộ các dữ liệu thực nghiệm trong luận văn được hệ thống hóa và trình bày khoa học thông qua các bảng biểu và đồ thị trực quan:

• Các chỉ số quang phổ nồng độ và tỷ lệ A260/A280 được mô tả chi tiết qua bảng thống kê giá trị trung bình kèm độ lệch chuẩn.
• Các vạch điện di sản phẩm PCR đơn mồi và đa mồi được minh họa sắc nét qua các hình ảnh chụp dưới ánh sáng tử ngoại trên máy Gel-Doc Dolphin, thể hiện rõ thang chuẩn DNA ladder 50 bp và 100 bp làm đối chứng kích thước.
• Mức độ loại bỏ tế bào lympho và ADN người được minh chứng sinh động bằng các biểu đồ đường cong khuếch đại Realtime PCR chu kỳ ngưỡng Ct của gen β-globin, làm nổi bật sự chênh lệch rõ rệt giữa mẫu máu toàn phần chưa qua xử lý với mẫu máu đã được làm sạch bằng dung môi MCLB1 và kit MolYsis.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kỹ thuật tách chiết thương mại MolYsis của hãng Molzym tuy có thể làm giàu ADN vi sinh vật tới 40.000 lần nhưng lại có mức giá cao khoảng 10 bảng Anh cho mỗi lượt xét nghiệm. Do đó, việc xây dựng thành công dung dịch MCLB1 từ các hóa chất cơ bản nội địa không chỉ đảm bảo độ nhạy phân tích đạt từ 10 mũ 0 đến 10 mũ 2 CFU/ml mà còn giảm thiểu chi phí xét nghiệm xuống mức phù hợp với điều kiện kinh tế tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm, nghiên cứu đưa ra 4 khuyến nghị hành động cụ thể:

1. Triển khai tích hợp quy trình PCR đa mồi EPKS vào phác đồ chẩn đoán song hành cùng phương pháp cấy máu tại các khoa Xét nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử thuộc các bệnh viện tuyến trung ương. Đơn vị thực hiện: Các bệnh viện đa khoa hạng đặc biệt và chuyên khoa truyền nhiễm. Mục tiêu: Rút ngắn thời gian xác định căn nguyên vi khuẩn xuống dưới 4-6 giờ cho trên 95% bệnh nhân cấp cứu nghi ngờ sốc nhiễm khuẩn trong lộ trình 12 tháng tới.
2. Chuẩn hóa quy trình pha chế và tiến hành sản xuất thử nghiệm dung môi ly giải MCLB1 thành bộ sinh phẩm chẩn đoán in-vitro hoàn chỉnh. Đơn vị thực hiện: Các viện nghiên cứu y sinh học phối hợp cùng các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và sinh phẩm y tế trong nước. Mục tiêu: Giảm thiểu hơn 80% chi phí hóa chất so với việc nhập khẩu kit MolYsis trong vòng 18 đến 24 tháng.
3. Mở rộng hệ thống mồi PCR đa mồi nhằm phát hiện thêm các gen chỉ thị cơ chế kháng kháng sinh nguy hiểm như gen tiết men ESBL (blaCTX-M, blaTEM), gen kháng carbapenem (blaKPC, blaNDM-1). Đơn vị thực hiện: Nhóm nghiên cứu Di truyền học vi sinh vật tại Đại học Khoa học Tự nhiên và Bệnh viện 108. Thời gian thực hiện: Giai đoạn 24 tháng tiếp theo với mục tiêu kiểm soát chính xác 100% tình trạng kháng thuốc của các chủng phân lập.
4. Xây dựng chương trình đào tạo kỹ thuật viên và chuẩn hóa ngân hàng mẫu kiểm chuẩn ngoại kiểm cho các phòng xét nghiệm phân tử trên toàn quốc. Đơn vị thực hiện: Cục Quản lý Khám chữa bệnh thuộc Bộ Y tế kết hợp cùng các trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm. Thời gian triển khai: Kế hoạch 3 năm với mục tiêu nâng cao năng lực chẩn đoán phân tử cho ít nhất 50 bệnh viện tuyến tỉnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn thạc sĩ này là nguồn tư liệu học thuật và thực tiễn giá trị cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ chuyên khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm và Xét nghiệm lâm sàng: Luận văn cung cấp căn cứ phân tử vững chắc giúp các bác sĩ hiểu rõ cơ chế phát hiện tác nhân Enterobacteriaceae từ mẫu máu, hỗ trợ tối ưu hóa phác đồ điều trị kháng sinh sớm trong "giờ vàng" mà không cần phụ thuộc hoàn toàn vào kết quả cấy máu kéo dài 72 giờ.
2. Học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử và Vi sinh vật học: Tài liệu là cẩm nang hướng dẫn chi tiết từ khâu tra cứu ngân hàng gen, thiết kế mồi bằng phần mềm Vector NTI, kiểm soát nhiệt độ gắn mồi Tm, cho tới kỹ thuật giải trình tự huỳnh quang Sanger trên hệ thống tự động CEQ 8800.
3. Các nhà nghiên cứu và phát triển sản phẩm y sinh tại các công ty thiết bị y tế: Luận văn cung cấp toàn bộ công thức đệm ly giải MCLB1, tỷ lệ chất diện hoạt SDS, Triton X-100 và cơ chế chuyển đổi bước nhảy pH kiềm tính nhằm thay thế các quy trình tách chiết thương mại đắt tiền.
4. Giảng viên và sinh viên các trường Đại học Y Dược và Đại học Khoa học Tự nhiên: Luận văn là tài liệu tham khảo trực quan, chuẩn mực về phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong y sinh học, ứng dụng hiệu quả các công cụ tin sinh học vào giải quyết các bài toán bệnh truyền nhiễm thực tế.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần phải ứng dụng kỹ thuật loại bỏ ADN người trước khi chạy phản ứng PCR mẫu máu? Trong 1 ml máu toàn phần của bệnh nhân, số lượng tế bào bạch cầu người tạo ra hàm lượng ADN vật chủ khổng lồ (thường vượt quá hàng triệu lần so với lượng ADN vi sinh vật có mật độ thấp từ 10 đến 100 CFU/ml). Lượng thừa ADN người không chỉ ức chế hoạt tính của enzyme DNA polymerase mà còn gây ra hiện tượng mồi bắt cặp chéo vào các đoạn gen tương đồng tiến hóa, dẫn đến nguy cơ rất cao bị âm tính giả hoặc dương tính giả.

Bộ mồi EPKS trong nghiên cứu được thiết kế để nhận diện những loài vi khuẩn cụ thể nào? Bộ mồi đa mồi EPKS được thiết kế tối ưu để nhận diện chính xác 4 loài vi khuẩn nguy hiểm hàng đầu gây nhiễm khuẩn huyết gồm Escherichia coli (gen S-uidA, 773 bp), Proteus mirabilis (gen ureR, 406 bp), Klebsiella pneumoniae (gen aldA, 324 bp) và Salmonella sp. (gen flagellin, 254 bp), đồng thời kết hợp cặp mồi 16S rRNA đặc hiệu cho toàn bộ họ Enterobacteriaceae (424 bp).

Kỹ thuật PCR đa mồi này có thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu truyền thống không? Phương pháp PCR đa mồi không nhằm mục đích thay thế hoàn toàn mà đóng vai trò là giải pháp bổ trợ cấp thiết và đắc lực cho cấy máu. PCR đa mồi cung cấp kết quả định danh tác nhân chỉ trong 4-6 giờ giúp định hướng kháng sinh cấp cứu ngay từ đầu, trong khi cấy máu vẫn giữ vai trò tiêu chuẩn vàng để phân lập chủng vi khuẩn sống và thực hiện kháng sinh đồ định lượng sau 48-72 giờ.

Hiệu quả loại bỏ ADN người của dung môi tự chế MCLB1 có tương đương với các kit thương mại ngoại nhập không? Kết quả đo độ tinh sạch quang phổ và định lượng Realtime PCR đối chứng gen β-globin chứng minh dung môi MCLB1 có khả năng giảm nồng độ ADN người xuống dưới 10 ng/ml, đạt hiệu suất ly giải tương đương với kit thương mại MolYsis của hãng Molzym (Đức), trong khi chi phí nguyên vật liệu sản xuất thấp hơn nhiều lần so với mức giá khoảng 10 bảng Anh mỗi test nhập khẩu.

Điều kiện tối ưu của chu trình nhiệt trong phản ứng PCR đa mồi được thiết lập như thế nào? Phản ứng PCR đa mồi được tối ưu hóa đồng bộ ở nồng độ dNTP 200 µM, nồng độ Mg2+ 3 mM và nhiệt độ gắn mồi chính xác là 56°C. Chu trình phản ứng gồm 30 chu kỳ lặp lại liên tiếp với giai đoạn biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 56°C trong 45 giây và kéo dài chuỗi ở 72°C trong 1 phút, đảm bảo khuếch đại đồng đều cả 5 đoạn gen đích mà không tạo ra sản phẩm phụ.

Kết luận

• Thiết kế và chuẩn hóa thành công bộ mồi PCR đa mồi EPKS phát hiện chính xác họ Enterobacteriaceae và 4 loài gây bệnh chính (E. coli, K. pneumoniae, Salmonella sp., P. mirabilis) với kích thước phân tách rõ ràng từ 180 bp đến 773 bp.
• Độ chính xác sinh học phân tử được chứng minh tuyệt đối qua giải trình tự chu kỳ kết thúc huỳnh quang với độ tương đồng BLAST trên ngân hàng gen GenBank đạt từ 94% đến 99%.
• 100% trong số 74 mẫu ADN thử nghiệm đạt tiêu chuẩn quang phổ với tỷ số A260/A280 đạt 1,82 ± 0,093 và nồng độ trung bình 89,18 ± 30,05 ng/µl.
• Xây dựng thành công dung môi ly giải tế bào MCLB1 giúp loại bỏ trên 99% ADN người, hạ nồng độ ADN vật chủ xuống dưới 10 ng/ml và phát hiện nhạy bén vi khuẩn ở mật độ từ 10 mũ 0 đến 10 mũ 4 CFU/ml máu.
• Đóng góp khoa học then chốt của luận văn là đã hoàn thiện một quy trình chẩn đoán phân tử tích hợp hoàn chỉnh từ xử lý bệnh phẩm máu phức tạp đến khuếch đại đa mồi, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết từ 72 giờ xuống dưới 6 giờ với chi phí nội địa tối ưu.

Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2016 đến 2020, nghiên cứu cần được tiếp tục mở rộng thử nghiệm trên cỡ mẫu bệnh phẩm lâm sàng quy mô lớn hơn tại nhiều trung tâm y tế, đồng thời nâng cấp tích hợp các chỉ thị kháng thuốc đa kháng nhằm phục vụ toàn diện công tác điều trị nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Các cơ sở y tế và đơn vị nghiên cứu quan tâm có thể tiếp cận khai thác quy trình kỹ thuật này nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm và năng lực cấp cứu điều trị bệnh truyền nhiễm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người 1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong những bệnh lý được quan tâm bởi tỷ lệ mắc bệnh, tử vong cao. Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao đó là do các vi khuẩn đa kháng kháng sinh.

Triệu chứng lâm sàng của NKH không đặc hiệu và không khẳng định, thường chỉ biểu hiện rõ trong giai đoạn trễ. Các marker sinh học - đặc biệt là các cytokin có vai trò quan trọng, giúp phát hiện và đánh giá mức độ nặng của tình trạng viêm, phân biệt tác nhân là vi khuẩn, góp phần giúp thầy thuốc chẩn đoán và điều trị kịp thời NKH trong giai đoạn “giờ vàng”, rút ngắn thời gian nằm viện và giảm tỉ lệ tử vong của bệnh nhân. NKH có xu hướng gia tăng và do các nguyên nhân xác định. Trong đó, bệnh lý nhiễm trùng đường hô hấp luôn là nguyên nhân phổ biến dẫn tới NKH hay sôc nhiễm khuẩn [30].

Nhìn chung, nhiễm trùng đường hô hấp chiếm khoảng một nửa số ca NKH. Ngoài ra, còn có các nguyên nhân khác như nhiễm khuẩn đường sinh dục, nhiễm khuẩn ổ bụng. Với các nguyên nhân gây bệnh khác nhau nhưng việc sử dụng kháng sinh sớm là điều tiên quyết trong điều trị khỏi bệnh cho bệnh nhân. Nghiên cứu của Houck PM ở những bệnh nhân viêm phổi và bệnh nhân NKH chỉ ra rằng việc sử dụng kháng sinh chậm trễ trong điều trị kháng sinh nguy cơ dẫn tới tử vong tăng lên đáng kể.

Đặc biệt với nhiễm khuẩn, nguy cơ tử vong tăng lên khoảng 10% trong mỗi giờ chậm trễ [21]. Song song với việc sử dụng kháng sinh sớm thì việc lựa chọn kháng sinh thích hợp cũng rất quan trọng. Cùng với đó, việc điều trị kháng sinh hiện nay nếu chờ đợi dựa vào kết quả cấy máu thì quá lâu nên nhiều khi các bác sỹ lâm sàng buộc phải điều trị bệnh nhân theo kinh nghiệm tích lũy. Như vậy mặt tích cực là sử dụng kháng sinh sớm nhưng lại trở nên gặp khó khăn trong việc lựa chọn sử dụng kháng sinh thích hợp để điều trị.

Do vậy, nhờ sự phát triển của nền sinh học phân tử hiện đại, 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] những kỹ thuật tiên tiến nhất để phát hiện vi khuẩn gây NKH được đề xuất đáp ứng nhu cầu chẩn đoán nhanh tác nhân vi sinh gây bệnh. Tỷ lệ NKH thay đổi theo từng quốc gia, theo mùa, theo từng cơ quan xâm nhập và tùy từng đối tượng bệnh nhân. Vào những thập niên 1970 tại Mỹ hàng năm xảy ra khoảng 164000 ca NKH/năm. Tuy nhiên 15 năm gần đây đã có 750000 ca NKH/năm, số ca tử vong tăng từ 18500 ca lên 31000 ca NKH/năm chiếm khoảng 2% số bệnh nhân nhập viện và chiếm 75% các trường hợp nằm ở khoa Hồi sức tích cực [40]; Một nghiên cứu tại Hàn Quốc thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Gram âm trên tổng số ca NKH là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn Gram dương.

Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Tần suất bắt gặp các mầm bệnh ở các khu vực là khác nhau. Khi phân tích trên từng khu vực người ta thấy Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae là phổ biến nhất ở Châu Phi, trong khi đó Klebsiella gặp tỷ lệ cao nhất ở Đông Nam Á, đồng thời tỷ lệ kháng thuốc gặp nhiều nhất ở Klebsiella [41]. Một nghiên cứu đa trung tâm tại Hàn Quốc gần đây cho thấy trong số 1192 bệnh nhân NKH là người lớn được điều trị tại 22 đơn vị hồi sức cấp cứu từ 2005 đến 2009 thì có 740 (62,1%) bệnh nhân bị shock nhiễm khuẩn.

Về tỷ lệ phân bố các mầm bệnh phụ thuộc vào vùng địa lý, đặc điểm, điều kiện kinh tế, xã hội. Trong nghiên cứu tại Hàn Quốc, một nước phát triển thấy tỷ lệ vi khuẩn gram âm là 43%, trong khi đó chỉ có 20,4% là vi khuẩn gram dương. Người ta cũng ghi nhận nhiễm hơn một mầm bệnh là 3,6%; nhiễm nấm là 0,7% và vi khuẩn kỵ khí là 0,6%. Các vi khuẩn nhiễm nhiều nhất là Escherichia coli (22,1%), tiếp theo là Klebsiella sp (12,6%) và Staphylococcus aureus (8,4%) [32].

Nghiên cứu của Deen và cộng sự về sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 là báo cáo tổng hợp của 17 nghiên cứu khác nhau tại khu vực Nam và Đông Nam Châu Á lại cho thấy tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất là loài Salmonella enteric serotype Typhi với 532/1798 tổng số ca dương tính (chiếm 30%) ở người lớn và 432/1723 tổng số ca dương tính (chiếm 25%) ở trẻ em. Ngoài ra, các 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] mầm bệnh vi sinh khuẩn khác thường gặp ở người lớn như S. coli và nhóm vi khuẩn Gram âm khác. Vi khuẩn thường gặp ở trẻ em như S.

Kết quả được thể hiện ở Bảng 1 dưới đây: Bảng 2. Sự phân bố các mầm bệnh gây NKH từ năm 1990 đến 2010 của 17 nghiên cứu khác nhau ở khu vực gần Việt Nam (Nam và Đông Nam Châu Á) [12] Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Enterobacteriaceae Gram âm 2132 (60,6) 1392 (77,4) 740 (42,9) Salmonella enteric S enterica serotype Typhi 964 (27,4) 532 (29,6) 432 (25,1) Non-typhoidal Salmonella 170 (4,8) 148 (8,2) 22 (1,3) Non-Salmonella Enterobacteriaceae Escherichia coli 240 (6,8) 215 (12,0) 25 (1,5) Klebsiella sp 156 (4,4) 137 (7,6) 19 (1,1) Enterobacter sp 29 (0,8) 26 (1,4) 3 (0,2) Proteus sp 10 (0,3) 8 (0,4) 2 (0,1) Citrobacter sp 8 (0,2) 8 (0,4) 0 (0) Shigella sp 3 (0,1) 1 (0,1) 2 (0,1) Other Enterobacteriaceae 11 (0,3) 5 (0,3) 6 (0,3) Các VK Gram âm khác, Haemophilus influenzae 144 (4,1) 0 (0) 144 (8,4) Acinetobacter sp 18 (0,5) 6 (0,3) 12 (0,7) Burkholderia pseudomallei 15 (0,4) 13 (0,7) 2 (0,1) Pseudomonas sp 209 (5,9) 183 (10,2) 26 (1,5) Neisseria sp 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) Aeromonas hydrophilia 6 (0,2) 5 (0,3) 1 (0,1) 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Tính chung Người lớn Trẻ em (n; %) (n; %) (n; %) Moraxella catarrhalis 24 (0,7) 0 (0) 24 (1,4) Các Gram âm khác 7 (0,2) 1 (0,1) 6 (0,3) Không xác định 111 (3,2) 103 (5,7) 8 (0,5) Gram dương 626 (17,8) 305 (17,0) 321 (18,6) Staphylococcus aureus 298 (8,5) 227 (12,6) 71 (4,1) Streptococcus pneumoniae 235 (6,7) 15 (0,8) 220 (12,8) Group A streptococcus (S 12 (0,3) 3 (0,2) 9 (0,5) pyogens) Group B streptococcus (S 1 (<0·1) 1 (0,1) 0 (0) agalactiae) Enterococcus spp (group D 24 (0,7) 22 (1,2) 2 (0,1) streptococcus) Other streptococci 27 (0,8) 10 (0,6) 17 (1,0) Các Gram dương khác 17 (0,5) 16 (0,9) 1 (0,1) Không xác định 12 (0,3) 11 (0,6) 1 (0,1) Nấm 43 (1,2) 43 (2,4) 0 (0) Cryptococcus spp 33 (0,9) 33 (1,8) 0 (0) Candida spp 2 (0,1) 2 (0,1) 0 (0) Histoplasma capsulatum 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) Penicillium marneffei 4 (0,1) 4 (0,2) 0 (0) Mycobacteria 57 (1,6) 57 (3,2) 0 (0) Mycobacterium 27 (0,8) 27 (1,5) 0 (0) tuberculosis complex Mycobacterium avium complex 24 (0,7) 24 (1,3) 0 (0) Other mycobacteria 6 (0,2) 6 (0,3) 0 (0) Nguyên nhân khác 663 (18,8) 1 (0,1) 662 (38,4) 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Như vậy, các nghiên cứu trên cũng đã phản ánh rõ ràng về tần suất xuất hiện các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm cao hơn nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là họ vi khuẩn Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella spp, Enterobacter spp, Proteus spp, Salmonella sp và Enterobacteriaceae khác là những tác nhân hàng đầu gây bệnh lý NKH. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về các căn nguyên vi sinh vật gây bệnh ở người trên các thể bệnh khác nhau như viêm tiết niệu, nhiễm trùng vết mổ, NKH. Nhìn chung các vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng, tuy nhiên các loài vi khuẩn thường gặp gây bệnh được thống kê vẫn phổ biến nhất là các loài thuộc họ Enterobacteriaceae.

Tác giả Trần Thị Ngọc Anh năm 2007, tại Viện Nhi Đồng 2 phân lập được 2738 chủng vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Vi khuẩn thường gặp nhất là: E. Trong đó, hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được có tính kháng với nhóm kháng sinh betalactam, kháng và nhạy với carbapenem, tỷ lệ tụ cầu vàng kháng methiciline là 33,5% trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được [1]. Do vậy, trong thực hành lâm sàng, việc xác định căn nguyên vi khuẩn gây bệnh nhanh chóng và xác định tính kháng kháng sinh sẽ trở nên hữu ích và cần thiết cho các bác sĩ trong việc điều chỉnh phác đồ điều trị cho bệnh nhân.

Thống kê của chương trình giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của vi khuẩn năm 1996 thu được 1082 chủng từ các đơn vị tham gia trên toàn quốc chỉ ra rằng tỷ lệ NKH chiếm 21,6% trong số các loại bệnh phẩm thu được [7]. Phạm Văn Ca nghiên cứu trong thời gian 5 năm tại Bệnh viện Bạch Mai (1989-1993), tỷ lệ bệnh nhân cấy máu dương tính là 11,8 % ; Phạm Hùng Vân và cộng sự trong kết quả nghiên cứu từ 16 bệnh viện trên toàn quốc thu được 1602 chủng từ nhiều nguồn bệnh phẩm khác nhau trong đó có 188 bệnh phẩm máu chiếm tỷ lệ 11.7% [3]; Nghiên cứu của 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Thanh Liêm và cs tại Bệnh viện Nhi đồng I từ năm 1999 đến 2004 nhóm vi khuẩn gây bệnh Gram âm chiếm tới (61.3%), trong đó hàng đầu là Klebsiella spp (44%), E. Một nghiên cứu về các căn nguyên gây NKH tại Bệnh viện TƯQĐ 108 do tác giả Bùi Thanh Thuyết trên 8.134 mẫu máu từ năm 2010 đến năm 2013 có 952 mẫu cấy máu dương tính (chiếm 11,7%). Trong đó, các vi khuẩn thường gặp là E.và hầu hết các vi khuẩn này là vi khuẩn đa kháng thuốc, chúng kháng lại với đa số các kháng sinh thường dùng trong bệnh viện [6].

Như vậy, không chỉ ở trên thế giới mà cả ở Việt Nam, dịch tễ học các căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp nhất, mức độ gây hại lớn vẫn tập trung vào nhóm vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Điều này cho thấy, trong thực hành lâm sàng tại Bệnh viện, việc chẩn đoán xác định chính xác và nhanh chóng chúng là việc làm rất cần thiết. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người. Enterobacteriaceae là các chi vi khuẩn đường ruột Gram âm có hình que, chiều dài điển hình từ 1 μm đến 5 μm kị khí không nghiêm ngặt, lên men đường thành acid lactic.