Luận văn thạc sĩ: Xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng PCR đa mồi

• Tác giả: Đào Thanh Quyên
• Người hướng dẫn: TS. Ngô Tất Trung
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người bằng phương pháp PCR đa mồi
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: Dịch tễ học của các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết ở người
• 1.1. Dịch tễ học của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh nhiễm khuẩn huyết trên thế giới
• 1.2. Đặc điểm của một số loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh ở người
• 1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
• 1.2.2. Nhóm các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
• 1.2.3. Phương pháp chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh
• 1.2.4. Kỹ thuật xét nghiệm truyền thống phát hiện vi khuẩn
• 1.2.5. Phương pháp sử dụng sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn
• 1.2.5.1. Kỹ thuật PCR
• 1.2.5.2. Kỹ thuật PCR đa mồi (PCR đa mồi)
• 1.2.6. Tách chiết ADN sử dụng công nghệ loại bỏ ADN người
• 1.2.7. Sự cần thiết của công nghệ loại bỏ ADN người trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn huyết
• 1.2.8. Cơ sở lý thuyết của công nghệ loại bỏ ADN người “làm giàu” ADN vi khuẩn
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
• 2.3.1. Các hoá chất, sinh phẩm
• 2.3.2. Các máy và thiết bị chính
• 2.4. Thiết kế các cặp mồi sử dụng trong PCR và PCR đa mồi
• 2.5. Quy trình tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
• 2.6. Tách chiết ADN từ các mẫu bệnh phẩm
• 2.7. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
• 2.8. Kỹ thuật PCR và PCR đa mồi
• 2.9. Giải trình tự gen
• 2.10. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng PCR đa mồi
• 2.11. Phương pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN
• 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN trên chủng vi sinh
• 3.1.2. Kết quả PCR đơn mồi từ các mầm bệnh đơn lẻ
• 3.1.3. Kết quả giải trình tự gen các mầm bệnh
• 3.1.4. Kết quả xác định trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của họ Enterobacteriaceae
• 3.1.5. Kết quả xác định trình tự đoạn gen flagellin của vi khuẩn Salmonella
• 3.1.6. Kết quả xác định trình tự gen aldehyde dehydrogenase của vi khuẩn K.
• 3.1.7. Kết quả xác định trình tự gen UreR của vi khuẩn Proteus mirabilis
• 3.1.8. Kết quả xác định trình tự gen S-uidA của vi khuẩn E.
• 3.1.9. Kết quả PCR đa mồi phát hiện một số vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae
• 3.1.10. Kết quả PCR đa mồi phát hiện đồng thời các tác nhân gây bệnh
• 3.1.11. Đánh giá hiệu quả và tính ứng dụng của phương pháp trên panel chuẩn dương
• 3.1.12. Độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu chứng âm và chuẩn dương
• 3.2. THIẾT LẬP CÔNG NGHỆ LOẠI BỎ ADN NGƯỜI KẾT HỢP ‘LÀM GIÀU’ ADN VI KHUẨN
• 3.2.1. So sánh hiệu suất tách và chất lượng ADN cũng như khả năng loại bỏ ADN người bằng các dung môi khác nhau
• 3.2.2. Kết quả so sánh nồng độ ADN tách chiết bằng phương pháp thông thường so với phương pháp phá bạch cầu làm giàu ADN vi khuẩn
• 3.2.3. Kết quả realtime PCR định lượng nồng độ ADN so sánh các phương pháp tách chiết
• 3.2.4. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp tách ADN không qua xử lý
• 3.2.5. So sánh tính chất loại ADN bằng dung môi MCLB1 với phương pháp sử dụng kit thương mại MolYsis
• 3.2.6. Kiểm chứng hàm lượng ADN vi khuẩn thu nhận sau khi xử lý bằng dung môi phá bạch cầu
• 3.3. KẾT QUẢ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về vi khuẩn Enterobacteriaceae và bệnh nhiễm trùng

Vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là một trong những tác nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng ở người. Chúng thường gây ra các bệnh lý như nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, và nhiễm trùng đường tiết niệu. Việc phát hiện sớm và chính xác các vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc điều trị và quản lý bệnh nhân. Phương pháp PCR đa mồi đã được chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn này.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn Enterobacteriaceae gây bệnh

Các vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae như Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Salmonella thường có khả năng gây bệnh cao. Chúng có thể gây ra các bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là ở những bệnh nhân có hệ miễn dịch yếu. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học và dịch tễ học của các vi khuẩn này là cần thiết để phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả.

1.2. Tình hình nhiễm trùng do Enterobacteriaceae ở Việt Nam

Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm trùng do các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae đang gia tăng. Nghiên cứu cho thấy rằng Escherichia coli là tác nhân phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn huyết. Việc phát hiện sớm và chính xác các vi khuẩn này sẽ giúp cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

II. Thách thức trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh

Mặc dù có nhiều phương pháp chẩn đoán hiện có, nhưng việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh vẫn gặp nhiều thách thức. Phương pháp cấy khuẩn truyền thống thường mất nhiều thời gian và không đảm bảo độ nhạy cao. Hơn nữa, sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho các phản ứng PCR, dẫn đến kết quả dương tính giả.

2.1. Hạn chế của phương pháp cấy khuẩn truyền thống

Phương pháp cấy khuẩn truyền thống thường yêu cầu thời gian từ 18-72 giờ để có kết quả. Trong thời gian này, tình trạng của bệnh nhân có thể xấu đi. Hơn nữa, không phải tất cả các vi khuẩn đều có thể được nuôi cấy thành công, đặc biệt là các vi khuẩn kỵ khí.

2.2. Vấn đề với ADN người trong mẫu bệnh phẩm

Sự hiện diện của ADN người trong mẫu bệnh phẩm có thể gây cản trở cho phản ứng PCR, làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Do đó, việc loại bỏ ADN người trước khi thực hiện PCR là rất cần thiết để nâng cao chất lượng chẩn đoán.

III. Phương pháp PCR đa mồi trong phát hiện vi khuẩn

Phương pháp PCR đa mồi cho phép phát hiện nhiều loại vi khuẩn trong cùng một phản ứng. Điều này giúp tiết kiệm thời gian và tăng độ nhạy của phương pháp chẩn đoán. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.

3.1. Nguyên lý hoạt động của PCR đa mồi

PCR đa mồi hoạt động dựa trên nguyên lý khuếch đại các đoạn ADN mục tiêu bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau. Điều này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại vi khuẩn trong một mẫu bệnh phẩm, giúp rút ngắn thời gian chẩn đoán.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

Để đạt được kết quả tốt nhất từ phương pháp PCR đa mồi, cần tối ưu hóa các điều kiện như nồng độ mồi, nhiệt độ phản ứng và thời gian khuếch đại. Việc này giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng, giảm thiểu khả năng dương tính giả.

IV. Ứng dụng thực tiễn của PCR đa mồi trong chẩn đoán

Việc áp dụng phương pháp PCR đa mồi trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh đã cho thấy nhiều kết quả khả quan. Nghiên cứu cho thấy phương pháp này có thể phát hiện nhanh chóng và chính xác các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

4.1. Kết quả nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp PCR đa mồi có thể phát hiện đồng thời nhiều loại vi khuẩn gây bệnh trong một mẫu bệnh phẩm. Điều này không chỉ giúp tiết kiệm thời gian mà còn nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán.

4.2. Tác động của PCR đa mồi đến điều trị bệnh

Việc phát hiện nhanh chóng các vi khuẩn gây bệnh giúp bác sĩ có thể chỉ định kháng sinh phù hợp ngay từ đầu, từ đó cải thiện kết quả điều trị và giảm thiểu tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Phương pháp PCR đa mồi đã chứng minh được hiệu quả trong việc phát hiện các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae gây bệnh. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình và mở rộng ứng dụng của phương pháp này trong chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng khác.

5.1. Tương lai của phương pháp PCR trong chẩn đoán

Với sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học, phương pháp PCR có thể được cải tiến hơn nữa để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu. Điều này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của PCR đa mồi trong các tình huống lâm sàng khác nhau. Việc này sẽ giúp xác định rõ hơn vai trò của phương pháp này trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhiễm trùng.