MỞ ĐẦU Vi khuẩn tả Vibrio cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [27]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử vong. Ở Việt Nam, bệnh tả cũng đã xuất hiện từ năm 1850 và bùng phát thành dịch ở nhiều tỉnh, thành trong nhiều năm khiến hàng trăm ngƣời tử vong. Năm 2007 dịch lại bùng phát ở 19 tỉnh/thành phố phía Bắc và có hàng ngàn trƣờng hợp mắc bệnh.
Ngày nay, vi khuẩn này cũng là một trong những tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm và nƣớc uống. Hàng năm, trên thế giới ƣớc tính khoảng 3 - 5 triệu trƣờng hợp mắc bệnh và 100.000 trƣờng hợp tử vong do bệnh tả [51]. Thời gian ủ bệnh ngắn khoảng từ 2 giờ đến 5 ngày, nhiều khả năng bùng phát dịch bệnh. Bệnh tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao.) ở vùng cửa sông và ven biển.
Vi khuẩn tả gây tiêu chảy cấp tính, nếu không phát hiện và chữa trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong. Vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc và thực phẩm là hết sức cần thiết. Hiện nay ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới có rất nhiều phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn tả nhƣ: soi tƣơi, phân lập vi khuẩn, xét nghiệm huyết thanh học, PCR, ELISA, sắc ký miễn dịch.
Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu nhƣợc điểm riêng. Trong đó phƣơng pháp PCR là phƣơng pháp đƣợc áp dụng khá phổ biến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay trên thị trƣờng đã có các bộ kit phát hiện vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp PCR nhƣ bộ kit của hãng: VeTeKTM, Genesig.
Tuy nhiên, phƣơng pháp này đòi hỏi máy móc, trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao, khó áp dụng ngoài hiện trƣờng. Mặt khác, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có nguy cơ xảy ra rất cao và ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con ngƣời do thực phẩm ô nhiễm ngày càng nhiều và việc kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm còn chƣa thực sự chặt chẽ. Chính vì vậy, những phƣơng pháp đơn giản, có thể áp dụng trực tiếp ngay tại hiện trƣờng hay các 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com bếp ăn để phát hiện các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm nói chung và vi khuẩn tả nói riêng là rất cần thiết. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này vẫn phải đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Do đó, sắc ký miễn dịch là phƣơng pháp phù hợp. Một số công trình nghiên cứu đã chế tạo thành công que thử phát hiện V. cholerae trong các mẫu nƣớc dựa trên phƣơng pháp sắc ký miễn dịch. Que thử cho phép phát hiện vi khuẩn ở nồng độ 106 - 107 CFU/ml với độ nhạy và độ đặc hiệu cao [12, 21].
Tuy nhiên, ở Việt Nam chƣa có công trình nghiên cứu nào về việc tạo que thử phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae bằng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch, đây là lý do để chúng tôi lựa chọn và thực hiện đề tài này nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn tả V. cholerae trong nguồn nƣớc sinh hoạt. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Giới thiệu chung về Vibrio cholerae 1. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học Vị trí phân loại Vibrio cholerae thuộc: Giới (regnum): Bacteria Ngành (phylum): Proteobacteria Lớp (class): Gamma Proteobacteria Bộ (ordo): Vibrionales Họ (familia): Vibrionaceae Chi (genus) Vibrio Hình 1.1: Hình ảnh tế bào vi khuẩn Vibrio cholerae [57] Loài (species): Vibrio cholerae Vibrio cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, là vi khuẩn gram âm, có hình que hơi cong nhƣ dấu phẩy (Hình 1.1), có kích thƣớc khoảng 0,3 x 3 µm, di chuyển nhanh nhờ roi ở đầu, không có vỏ và không sinh bào tử. Vibrio cholerae có khả năng chuyển hóa hô hấp và lên men, các xét nghiệm sinh hóa và các nghiên cứu tƣơng đồng DNA về V. cholerae đã đƣợc xác định rõ [8].
Vi khuẩn này có phản ứng oxidase dƣơng tính, làm giảm nitrat, lên men không sinh hơi glucose, saccharose, D-mannitol, maltose, không lên men arabinose, phản ứng indol dƣơng tính. Vi khuẩn tả rất hiếu khí, sự phát triển của chúng đƣợc kích thích khi bổ sung NaCl 1%. Tuy nhiên, một sự khác biệt quan trọng của V. cholerae so với các vi khuẩn thuộc cùng một chi là khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng dinh dƣỡng không thêm NaCl [56].
Vì vậy, vi khuẩn tả mọc đƣợc dễ dàng trong môi trƣờng nuôi cấy bình thƣờng ở phòng thí nghiệm, không đòi hỏi các yếu tố tăng trƣởng đặc biệt, ƣa pH từ 8 - 9,5, sống ở nhiệt độ 16 - 42 oC, nhiệt độ tối ƣu là 37 oC. Thông thƣờng các môi trƣờng nhƣ pepton pH 8,5, thạch TCBS (thiosulfate - Citrate - Bile salt) pH 8,6 hay TTGA (Taurocholate - Tellurite - Gelatin Agar) pH 8,5 đƣợc dùng để nuôi cấy phân lập vi khuẩn tả [15]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Vi khuẩn tả chết ở nhiệt độ 100 oC hoặc 80 oC trong 5 phút và dễ bị tiêu diệt bởi các chất tẩy uế nhƣ cloramin, cresyl, vôi cục., chết rất nhanh trong môi trƣờng acid, đặc biệt nhạy cảm với sự khô hanh và ánh nắng mặt trời cũng làm vi khuẩn dễ chết, chỉ tồn tại 10 phút ở 55 oC. Tuy nhiên có thể sống 4-7 ngày trên rau trái tƣơi để nơi mát và ẩm, trong nƣớc đá, nƣớc biển, nƣớc ao hồ vi khuẩn sống đƣợc vài ngày.
cholerae có khoảng 200 nhóm huyết thanh và đƣợc chia thành V. Vibrio cholerae O1: thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố ruột và gây ra bệnh dịch tả. cholerae O1 bao gồm type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor. Các sinh type này ngƣng kết với kháng huyết thanh nhóm O1.
Trong nhóm này có 3 type huyết thanh là Ogawa, Inaba và Hikojima [36]. Vibrio cholerae non-O1/ non-O139: bao gồm các nhóm huyết thanh từ O2 - O138 không có khả năng gây dịch tả. Có tính chất sinh hóa tƣơng tự nhƣ V. cholerae O1 nhƣng không ngƣng kết với kháng huyết thanh O1.
Các nhiễm trùng do nhóm này thƣờng liên quan đến viêm ruột cấp nhƣng cơ chế gây bệnh vẫn chƣa đƣợc giải thích [36]. Vibrio cholerae O139: là tác nhân gây ra bệnh dịch tả đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1992 tại Ấn Độ và Bangladesh [36]. Khả năng gây bệnh Trong điều kiện tự nhiên bình thƣờng, V. cholerae chỉ gây bệnh tả cho ngƣời và là một trong số tác nhân gây bệnh phổ biến.
Bệnh tả là một bệnh nhiễm trùng, nhiễm độc cấp tính, lây lan rất nhanh, gây bùng phát các trận dịch tiêu chảy. Vi khuẩn tả dễ truyền nhiễm qua phân và chất nôn của ngƣời bệnh hoặc từ các ổ chứa thiên nhiên nhƣ một số động vật thủy sinh, nhất là các loài nhuyễn thể (cá, cua, trai sò, ngao.) ở vùng cửa sông và ven biển. Thời gian ủ bệnh ngắn từ 2 đến 5 ngày. Dấu hiệu đặc trƣng của thời kỳ toàn phát của bệnh là tiêu chảy và nôn, phân lỏng và trắng nhƣ nƣớc vo gạo.
Bệnh nhân mất nƣớc, mất muối rất nhanh, có thể mất 1 lít nƣớc trong 1 giờ do đó chỉ vài giờ là xuất hiện hội chứng mất nƣớc cấp tính làm cho 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com toàn thân sút đi rất nhanh và nguy hiểm. Nếu không đƣợc điều trị, tỷ lệ chết rất cao (50% đến 60%). Bệnh tả có nhiều biểu hiện lâm sàng rất khác nhau từ thể nhẹ dễ bỏ qua cho đến thể nặng với hội chứng tả điển hình [52]. Các vi khuẩn tả xâm nhập cơ thể bằng đƣờng tiêu hóa, chúng phải vƣợt qua hàng rào dịch vị của dạ dày có pH axit để xuống ruột non là nơi có pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn.
Độ axit bình thƣờng của dịch vị là một cản trở rất lớn đối với quá trình sinh bệnh của vi khuẩn tả. Vào đến ruột non, V. cholerae bám dính vào tế bào niêm mạc ruột nhờ có các yếu tố bám dính nhƣ kháng nguyên TCP, kháng nguyên ngƣng kết hồng cầu nhạy cảm với mannose., vi khuẩn nhân lên và tiết ra độc tố ruột. Các vi khuẩn không xâm nhập vào trong các tế bào niêm mạc ruột.
Độc tố ruột của vi khuẩn tả (Cholera toxin viết tắt là CTX, Ctx hoặc CT) (Hình 1.2) là một protein gồm 2 tiểu phần A (Active_28 kDa) và B (Binding_11 kDa) có chức năng riêng biệt, có cấu trúc tƣơng tự nhƣ ngoại độc tố chịu nhiệt của E. coli gây tiêu chảy, chỉ bị phá vỡ cấu trúc khi đun nóng ở 121oC trong 30 phút [34]. Tiểu phần A có hai tiểu đơn vị A1 và A2, tiểu phần B có 5 tiểu đơn vị B1, B2, B3, B4 và B5. Tiểu phần B có chức năng gắn độc tố ruột vào thụ thể ganglioside GM1 ở trên màng của tế bào niêm mạc ruột, còn tiểu phần A mà chủ yếu là A1 xâm nhập vào bên trong tế bào hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng nồng độ AMP vòng nội bào làm cho tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nƣớc và Cl-, gây ra ỉa chảy cấp tính (Hình 1.
Nếu không đƣợc điều trị tích cực bệnh nhân sẽ chết vì kiệt nƣớc và mất các chất điện giải. Độc tố tả còn gây nên ức chế miễn dịch tế bào bằng cách tác động trực tiếp lên macrophage và tế bào lympho T [58]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2: Cấu tạo độc tố của Vibrio cholerae [44] Hình 1.3: Cơ chế gây bệnh của Vibrio cholerae [58] 1. Tình hình dịch bệnh tả Vi khuẩn tả V.
cholerae đƣợc Robert Koch tìm ra năm 1884 ở Đức [27]. Thế kỷ XIX đã xảy ra 6 vụ dịch lớn ở châu Á, Âu, Phi, Mỹ làm hàng triệu ngƣời tử vong. Năm 2011, các trƣờng hợp mắc bệnh tả đã đƣợc công bố từ tất cả các nƣớc trên thế giới. Tổng cộng có 58 quốc gia xuất hiện dịch bệnh tả với tổng số tích luỹ 589.854 trƣờng hợp mắc bệnh trong đó 7.816 ngƣời tử vong (tỷ lệ tử vong là 1,3%), số trƣờng hợp mắc bệnh tăng 85% so với năm trƣớc.
Châu Phi là một trong số 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com những khu có số ca tử vong do bệnh tả chiếm tỷ lệ cao nhất (Bảng 1. Sự gia tăng nhanh chóng số trƣờng hợp mắc bệnh trên toàn cầu so với năm 2010 là kết quả của một đợt dịch lớn, bắt đầu vào tháng 10 năm 2010 tại Haiti (một quốc gia thuộc Châu Mỹ) và vẫn đang tiếp diễn [51].