Khảo Sát Sự Phát Hiện Các Loại Vi Khuẩn Bacillus Trong Phân Vi Sinh

Khóa luận khảo sát sự phát hiện vi khuẩn bacillus trong phân vi sinh bằng cặp mồi tự thiết kế, góp phần nâng cao hiểu biết về công nghệ sinh học.

• Tác giả: Đặng Thị Lan
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Bảo Quốc
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Sự Phát Hiện Một Số Loại Vi Khuẩn Bacillus Trong Phân Vi Sinh
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2018-2022
• Địa điểm: Thành Phố Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. TÓM TẮT
• 1.2. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.3. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
• 1.4. NỘI DUNG THỰC HIỆN
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tình hình sản xuất phân vi sinh
• 2.2. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus
• 2.2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
• 2.2.2. Vi khuẩn Bacillus licheniformis
• 2.2.3. Vi khuẩn Bacillus megaterium
• 2.3. Tổng quan về vi khuẩn Lactobacillus
• 2.3.1. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
• 2.3.2. Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
• 2.4. Kỹ thuật PCR
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Thiết bị và dụng cụ
• 3.4. Phương pháp tiến hành
• 3.4.1. Thiết kế mồi chuyên biệt
• 3.4.2. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram
• 3.4.3. Phương pháp bảo quản
• 3.4.4. Xác định các vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus bằng sinh học phân tử
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập phân vi sinh và phân lập mẫu
• 4.2. Kết quả kiểm tra sinh hóa
• 4.2.1. Kết quả nhuộm Gram
• 4.2.2. Kết quả kiểm tra hoạt tính catalase
• 4.2.3. Kết quả kiểm tra sự phân giải tinh bột và CaCO3
• 4.3. Kết quả thiết kế mồi chuyên biệt
• 4.3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA
• 4.3.2. Xác định sự hiện diện của các vi khuẩn Bacillus subtilis
• 4.3.3. Xác định sự hiện diện của các vi khuẩn Bacillus licheniformis
• 4.3.4. Xác định sự hiện diện của các vi khuẩn Bacillus megaterium
• 4.3.5. Xác định sự hiện diện của các vi khuẩn Lactobacillus plantarum
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Bacillus Trong Phân Vi Sinh

Nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại. Vi khuẩn Bacillus có khả năng cải thiện chất lượng đất và tăng năng suất cây trồng. Việc phát hiện và phân tích các loài Bacillus trong phân vi sinh không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất nông nghiệp mà còn đảm bảo an toàn cho môi trường.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Vi Khuẩn Bacillus Trong Nông Nghiệp

Vi khuẩn Bacillus đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì nhiêu của đất. Chúng giúp phân giải các chất dinh dưỡng, làm tăng khả năng hấp thụ của cây trồng. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng phân vi sinh chứa Bacillus có thể làm tăng năng suất cây trồng lên đến 30%.

1.2. Các Loại Vi Khuẩn Bacillus Thường Gặp Trong Phân Vi Sinh

Các loài vi khuẩn Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, và Bacillus megaterium thường được tìm thấy trong phân vi sinh. Mỗi loài có những đặc điểm và ứng dụng riêng, giúp cải thiện chất lượng đất và tăng trưởng cây trồng.

II. Vấn Đề Trong Việc Phát Hiện Vi Khuẩn Bacillus

Việc phát hiện các loại vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh gặp nhiều thách thức. Các phương pháp truyền thống thường tốn thời gian và không đảm bảo độ chính xác cao. Do đó, cần có những phương pháp hiện đại hơn để xác định nhanh chóng và chính xác các loài vi khuẩn này.

2.1. Thách Thức Trong Phân Tích Vi Khuẩn

Một trong những thách thức lớn nhất là sự đa dạng của các loài Bacillus. Việc phân lập và xác định chính xác các loài này đòi hỏi kỹ thuật cao và thiết bị hiện đại. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp PCR có thể giúp giải quyết vấn đề này.

2.2. Tác Động Của Môi Trường Đến Vi Khuẩn Bacillus

Môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn Bacillus. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và độ ẩm đều có thể làm thay đổi sự hiện diện và hoạt động của chúng trong phân vi sinh.

III. Phương Pháp Phát Hiện Vi Khuẩn Bacillus Hiệu Quả

Để phát hiện các loại vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh, các phương pháp hiện đại như PCR đang được áp dụng rộng rãi. Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng và chính xác các loài vi khuẩn, từ đó nâng cao chất lượng sản phẩm phân vi sinh.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phát Hiện Vi Khuẩn

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản DNA của vi khuẩn, giúp xác định sự hiện diện của các loài Bacillus trong mẫu phân vi sinh. Phương pháp này nhanh chóng và có độ chính xác cao, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí.

3.2. Thiết Kế Mồi Đặc Hiệu Cho Vi Khuẩn Bacillus

Việc thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu cho từng loài Bacillus là rất quan trọng. Các đoạn mồi này giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR, từ đó nâng cao khả năng phát hiện vi khuẩn trong mẫu phân.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Vi Khuẩn Bacillus Trong Nông Nghiệp

Vi khuẩn Bacillus không chỉ có vai trò trong việc cải thiện chất lượng đất mà còn có thể được ứng dụng trong sản xuất phân bón sinh học. Việc sử dụng phân vi sinh chứa Bacillus giúp tăng cường sức đề kháng cho cây trồng và giảm thiểu sử dụng phân bón hóa học.

4.1. Tác Động Tích Cực Đến Năng Suất Cây Trồng

Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng phân vi sinh chứa Bacillus có thể làm tăng năng suất cây trồng lên đến 20-30%. Điều này không chỉ giúp nông dân tăng thu nhập mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của nông nghiệp.

4.2. Giảm Thiểu Tác Động Môi Trường

Sử dụng phân vi sinh chứa vi khuẩn Bacillus giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phân bón hóa học. Việc này không chỉ bảo vệ sức khỏe con người mà còn bảo vệ hệ sinh thái tự nhiên.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Vi Khuẩn Bacillus

Nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh đang mở ra nhiều cơ hội mới cho nông nghiệp bền vững. Việc phát hiện và ứng dụng các loài Bacillus không chỉ giúp nâng cao năng suất cây trồng mà còn bảo vệ môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành nông nghiệp.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Vi Khuẩn Bacillus

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, nghiên cứu về vi khuẩn Bacillus sẽ tiếp tục được mở rộng. Các phương pháp mới sẽ giúp nâng cao hiệu quả phát hiện và ứng dụng vi khuẩn trong nông nghiệp.

5.2. Định Hướng Phát Triển Nông Nghiệp Bền Vững

Nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh sẽ góp phần vào việc phát triển nông nghiệp bền vững. Điều này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Theo Báo cáo Tình trạng Dân số Thế giới năm 2019 của Quỹ Dân số Liên Hợp Quốc (UNFPA), dân số toàn cầu đạt 7,7 tỷ người năm 2018 và dự báo sẽ tăng lên 8 tỷ người vào năm 2030, chạm mốc 9 tỷ người vào năm 2050. Sự gia tăng dân số đặt ra áp lực lớn đối với an ninh lương thực và sản xuất nông nghiệp. Việc lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong thời gian dài nhằm gia tăng sản lượng đã làm suy thoái tính chất lý hóa của đất, tồn dư hóa chất độc hại và gây ô nhiễm môi trường. Do đó, việc ứng dụng phân bón vi sinh (PVS) chứa các vi sinh vật có ích nhằm nâng cao năng suất cây trồng, cải tạo độ phì nhiêu của đất và hướng đến nền nông nghiệp bền vững trở thành xu thế tất yếu.

Thị trường phân bón sinh học toàn cầu năm 2018 đạt giá trị hơn 1,8 tỷ USD với tỷ lệ tăng trưởng kép hàng năm (CAGR) là 14,3% giai đoạn 2011–2018; năm 2019 đạt 1,0 tỷ USD và dự báo đạt CAGR 12,8% giai đoạn 2020–2027. Trong đó, các quốc gia như Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Argentina, Canada và khu vực Châu Âu chiếm đến 80% doanh thu. Tại Việt Nam, nghiên cứu về PVS bắt đầu từ những năm 1960 và sản xuất thành công chế phẩm Nitragin trên chất mang than bùn vào năm 1987. Tuy nhiên, quy mô sản xuất công nghiệp vẫn còn ở giai đoạn đầu. Tính đến tháng 12/2017, cả nước có 713 sản phẩm phân bón hữu cơ công nghiệp (chiếm 5%) và 182 sản phẩm phân bón sinh học (chiếm 1,3%). Đến hết năm 2019, tổng số phân bón được công nhận lưu hành là 23.097 sản phẩm. Năm 2020, tổng lượng phân bón sử dụng đạt 10,23 triệu tấn (gồm 7,6 triệu tấn phân vô cơ và 2,63 triệu tấn phân hữu cơ) từ 814 nhà máy sản xuất (576 nhà máy phân vô cơ đạt công suất 28,8 triệu tấn/năm, 265 nhà máy phân hữu cơ đạt công suất 3,47 triệu tấn/năm).

Thực trạng lưu thông đa dạng các chế phẩm PVS đòi hỏi công tác quản lý và kiểm tra chất lượng phải có các phương pháp kiểm định thành phần vi sinh vật nhanh chóng, chính xác và chuyên biệt, thay thế cho các quy trình phân lập truyền thống tốn nhiều thời gian. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu là công cụ đáp ứng yêu cầu trên. Khóa luận tập trung giải quyết vấn đề kiểm định sự hiện diện của các chủng vi khuẩn hữu ích trong phân bón thương mại bằng kỹ thuật sinh học phân tử.

Mục tiêu nghiên cứu:

• Thiết kế và đánh giá các cặp mồi chuyên biệt phục vụ xác định các loài vi khuẩn Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium) và Lactobacillus (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus).

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Thu thập sản phẩm phân bón vi sinh thương mại trên thị trường và phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc tương ứng của từng chi.
2. Kiểm tra các đặc tính hình thái, sinh hóa của các chủng phân lập theo cẩm nang phân loại vi khuẩn Bergey.
3. Thiết kế và đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi bằng công cụ tin sinh học (in silico) và thực nghiệm PCR trên các chủng đối chứng dương.
4. Ly trích DNA tổng số từ khuẩn lạc đơn và từ mẫu phân bón vi sinh (mẫu thô và mẫu qua làm giàu).
5. Thực hiện phản ứng PCR để phát hiện sự hiện diện của các loài vi khuẩn mục tiêu trong sản phẩm phân bón vi sinh thương mại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium) và chi Lactobacillus (L. plantarum, L. acidophilus); sản phẩm phân bón vi sinh thương mại lưu thông trên thị trường.
• Thời gian thực hiện: Từ tháng 03/2022 đến tháng 12/2022.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng Chẩn đoán bệnh học người (RIBE 302-304), Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Mẫu phân bón vi sinh thương mại được thu thập tại thành phố Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của nghiên cứu dựa trên các đặc tính sinh học, phân loại học của vi khuẩn theo hệ thống phân loại Bergey và nguyên lý phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phát minh bởi Kary Mullis (1985):

• Chi Bacillus: Trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt, catalase dương tính. Các loài B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium có vai trò kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), hòa tan phosphate khó tan, cố định nitơ, tiết enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) và sản sinh kháng sinh polypeptide (bacitracin, polymyxin) ức chế mầm bệnh.
• Chi Lactobacillus: Vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí hoặc vi hiếu khí, catalase âm tính, lên men tạo axit lactic. Các loài L. plantarum, L. acidophilus có khả năng tổng hợp phytohormone (IAA), hỗ trợ hấp thu dinh dưỡng và kháng nấm bệnh rễ.
• Kỹ thuật PCR: Khuếch đại đoạn DNA mục tiêu qua 3 giai đoạn nhiệt (biến tính ở 94–95°C, bắt cặp mồi theo nhiệt độ nóng chảy $T_m$, kéo dài ở 72°C) với sự tham gia của DNA khuôn, enzyme Taq polymerase chịu nhiệt, dNTPs (20–200 µM), dung dịch đệm và cặp mồi đặc hiệu (chu kỳ tối ưu $\le 40$).

Phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Phương pháp phân lập và nuôi cấy: Sử dụng môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) và Luria Bertani (LB) lỏng cho vi khuẩn Bacillus; môi trường Man Rogosa Sharpe (MRS agar bổ sung 0,5% $CaCO_3$) và MRS lỏng cho vi khuẩn Lactobacillus. Phân lập bằng phương pháp cấy trải dịch pha loãng bậc 10 ($10^{-1}$ đến $10^{-8}$) và cấy ria tạo dòng thuần ở 37°C trong 48 giờ.
• Phương pháp giám định sinh hóa: Nhuộm Gram (quan sát kính hiển vi quang học vật kính 100X với dầu soi), thử nghiệm hoạt tính catalase ($H_2O_2$ 10%), thử nghiệm phân giải tinh bột trên thạch tinh bột, thử nghiệm hòa tan $CaCO_3$, và thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) trên môi trường Clark-Lubs với thuốc thử $\alpha$-naphthol và KOH 40%.
• Phương pháp tin sinh học: Thiết kế mồi cho L. acidophilus trên vùng trình tự nhiễm sắc thể bằng phần mềm PRIMER 3. Kiểm tra tính chuyên biệt in silico bằng phần mềm In silico PCR amplification và công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
• Phương pháp tách chiết DNA:
  1. Tách chiết DNA tổng số từ khuẩn lạc thuần và mẫu PVS tăng sinh bằng quy trình Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (PCI 25:24:1) kết hợp dung dịch đệm STE (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8), Lysis buffer, tủa bằng Isopropanol và rửa tủa bằng Ethanol 70%.
  2. Tách chiết DNA từ mẫu phân vi sinh thô trực tiếp bằng bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific).
• Phương pháp PCR và điện di: Kiểm tra chất lượng DNA khuôn bằng cặp mồi phổ biến khuếch đại gen 16S rRNA (63F và 1489R). Phản ứng PCR chuyên biệt thực hiện trên thể tích 13,5 µL (gồm 6 µL Taq Mix 2X, 5 µL $H_2O$ khử ion, 0,5 µL mồi xuôi 10 µM, 0,5 µL mồi ngược 10 µM, 1,5 µL DNA khuôn). Chu trình nhiệt: 95°C trong 3 phút; 35 chu kỳ (95°C trong 15 giây, 54°C trong 15 giây, 72°C trong 15 giây); 72°C trong 7 phút; giữ ở 4°C. Điện di trên gel agarose 1% trong đệm TBE 0,5X ở hiệu điện thế 100V trong 25 phút, nhuộm màu bằng GelRed và chụp ảnh bản gel dưới tia UV 302 nm bằng hệ thống UVP MultiDoc-It.

Nguồn dữ liệu và chủng đối chứng:

• Mẫu PVS thương mại thu thập tại thành phố Thủ Đức có công bố thành phần gồm: Bacillus subtilis ($10^8$ CFU/g), Bacillus licheniformis ($10^7$ CFU/g), Bacillus megaterium ($10^7$ CFU/g), Lactobacillus plantarum ($10^8$ CFU/g), Lactobacillus acidophilus ($10^8$ CFU/g), Streptomyces sp. ($10^7$ CFU/g), Saccharomyces cerevisiae ($10^7$ CFU/g).
• Chủng đối chứng dương: B. subtilis DV048, B. licheniformis (cung cấp bởi PTN Vi sinh - Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM), B. megaterium chuẩn ATCC, L. plantarum DC2 (đã giải trình tự), L. acidophilus chuẩn ATCC.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này trình bày bối cảnh gia tăng dân số toàn cầu và nhu cầu cấp thiết về việc phát triển phân bón vi sinh phục vụ nông nghiệp bền vững. Tác giả nêu bật thực trạng thị trường phân bón tại Việt Nam cùng tính cấp bách của công tác quản lý chất lượng vi sinh vật trong các chế phẩm thương phẩm. Mục tiêu tổng quát và các nội dung thực hiện cụ thể của đề tài được thiết lập nhằm xây dựng công cụ phát hiện nhanh các loài Bacillus và Lactobacillus bằng kỹ thuật PCR sử dụng mồi chuyên biệt.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp hệ thống cơ sở lý thuyết gồm 5 nội dung chính:

• Tình hình sản xuất và thương mại hóa phân vi sinh trên thế giới và tại Việt Nam, nêu rõ cơ sở pháp lý theo Nghị định số 113/2003/NĐ-CP và Nghị định số 108/2017/NĐ-CP của Chính phủ về quản lý phân bón.
• Đặc điểm hình thái, sinh hóa, phân loại học Bergey và tiềm năng ứng dụng nông nghiệp của chi Bacillus cùng 3 loài đại diện (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium).
• Đặc điểm phân loại, sinh lý và vai trò kích thích tăng trưởng rễ, đối kháng vi sinh vật gây hại của chi Lactobacillus và 2 loài mục tiêu (L. plantarum, L. acidophilus).
• Nguyên lý kỹ thuật PCR, các giai đoạn phản ứng chuỗi nhiệt và các yếu tố công nghệ chi phối hiệu quả khuếch đại (chất lượng DNA khuôn, nồng độ mồi, Taq polymerase, dNTPs, đệm phản ứng).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng (TSA, LB, MRS, Clark-Lubs, thạch tinh bột) và thiết bị thí nghiệm. Tác giả mô tả chi tiết các quy trình thao tác chuẩn:

• Quy trình phân lập vi khuẩn từ phân bón vi sinh qua dãy pha loãng nồng độ $10^{-1}$ đến $10^{-8}$.
• Quy trình kiểm tra các chỉ tiêu hình thái (nhuộm Gram) và sinh hóa (catalase, thủy phân tinh bột, tạo vòng tan $CaCO_3$, phản ứng VP).
• Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn thuần khiết trong glycerol 70% ở nhiệt độ lạnh sâu -20°C.
• Quy trình thiết kế mồi bằng PRIMER 3, kiểm tra độ đặc hiệu in silico bằng BLAST và In silico PCR amplification.
• Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp PCI thủ công và bằng kit tách cột silica.
• Thông số thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt cho từng cặp mồi chuyên biệt cùng quy trình điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp số liệu thực nghiệm chi tiết qua các giai đoạn:

• Phân lập thu được 16 mẫu nghi ngờ Bacillus trên môi trường TSA và 10 mẫu nghi ngờ Lactobacillus trên môi trường MRS.
• Kết quả kiểm tra sinh hóa khẳng định 11/16 mẫu Bacillus đạt tiêu chuẩn trực khuẩn Gram dương, catalase (+), phân giải tinh bột (+) và VP (+). Đối với Lactobacillus, 4/10 mẫu đạt tiêu chuẩn trực khuẩn Gram dương, catalase (+), tạo vòng phân giải $CaCO_3$ (+).
• Kết quả kiểm tra mồi in silico và thực nghiệm trên các chủng chuẩn: Mồi của B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium và L. plantarum cho thấy độ chuyên biệt tuyệt đối khi chỉ khuếch đại duy nhất một băng sáng trên chủng đối chứng dương tương ứng. Ngược lại, cặp mồi của L. acidophilus xuất hiện nhiều băng phụ không đặc hiệu trên cả mẫu đối chứng và các loài khác.
• Kiểm tra chất lượng DNA tổng số bằng mồi 16S rRNA đều xuất hiện băng rõ kích thước khoảng 1200–1700 bp.
• Kết quả phát hiện trên mẫu phân bón vi sinh:
  • Cặp mồi BsF-BsR khuếch đại thành công đoạn DNA 206 bp trên mẫu PVS và trên 8/11 chủng phân lập.
  • Cặp mồi BmF-BmR khuếch đại đoạn DNA 202 bp trên DNA tổng số của PVS, nhưng không xuất hiện trên các chủng phân lập thuần.
  • Cặp mồi BlF-BlR khuếch đại đoạn DNA 206 bp trên mẫu PVS (cả mẫu không ủ và ủ 24h, 72h) và trên 3/11 chủng phân lập (mẫu 1.2).
  • Cặp mồi LpF-LpR khuếch đại đoạn DNA 226 bp trên chủng đối chứng dương nhưng không phát hiện được băng sản phẩm trên mẫu PVS thương mại và các chủng phân lập.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng hợp về tính khả thi của việc sử dụng các cặp mồi tự thiết kế để định danh nhanh các loài vi khuẩn trong phân bón vi sinh. Đồng thời, tác giả đề xuất 3 kiến nghị kỹ thuật nhằm hoàn thiện quy trình.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp các thông số kỹ thuật của các cặp mồi và hiệu quả khuếch đại thực nghiệm qua các bảng số liệu sau:

Tên mồi	Trình tự mồi (5' - 3')	$T_m$ (°C)	Loài mục tiêu	Kích thước sản phẩm (bp)	Kết quả kiểm tra in silico	Độ đặc hiệu thực nghiệm
BsF / BsR	Trình tự chuyên biệt B. subtilis	53,2 / 54,6	Bacillus subtilis	~206	11/13 chủng	Đặc hiệu (chỉ lên băng đối chứng dương)
BmF / BmR	Trình tự chuyên biệt B. megaterium	56,4 / 54,9	Bacillus megaterium	~202	3/3 chủng	Đặc hiệu (chỉ lên băng đối chứng dương)
BlF / BlR	Trình tự chuyên biệt B. licheniformis	55,1 / 53,6	Bacillus licheniformis	~206	3/3 chủng	Đặc hiệu (chỉ lên băng đối chứng dương)
LpF / LpR	Trình tự chuyên biệt L. plantarum	55,2 / 55,4	Lactobacillus plantarum	~226	6/6 chủng	Đặc hiệu (chỉ lên băng đối chứng dương)
LaF / LaR	Trình tự chuyên biệt L. acidophilus	59,4 / 58,4	Lactobacillus acidophilus	Chưa xác định	2/3 chủng	Chưa đặc hiệu (xuất hiện nhiều băng không mong muốn)

Kết quả sàng lọc hình thái và thử nghiệm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập:

Nhóm vi khuẩn	Số mẫu phân lập ban đầu	Nhuộm Gram (Hình que, Gram +)	Hoạt tính Catalase (+)	Thủy phân tinh bột (+)	Phân giải $CaCO_3$ (+)	Hoạt tính VP (+)	Số mẫu đạt chuẩn sử dụng
Bacillus spp.	16	11	11	11	Không áp dụng	11	11 / 16 mẫu
Lactobacillus spp.	10	4	4	Không áp dụng	4	Không áp dụng	4 / 10 mẫu

Kết quả phát hiện các loài vi khuẩn từ mẫu phân bón vi sinh thương mại bằng PCR:

Loài vi khuẩn mục tiêu	Phát hiện trên DNA mẫu PVS	Phát hiện trên các chủng phân lập	Ghi chú thực nghiệm
Bacillus subtilis	Dương tính (Băng ~206 bp)	8/11 chủng	Xác định có hiện diện và sống trong mẫu
Bacillus licheniformis	Dương tính (Băng ~206 bp)	3/11 chủng (Mẫu 1.2)	Xác định có hiện diện trong PVS thô và PVS ủ
Bacillus megaterium	Dương tính (Băng ~202 bp)	0/11 chủng	Có DNA trong PVS nhưng chưa phân lập được khuẩn lạc sống
Lactobacillus plantarum	Âm tính	0/4 chủng	Mồi đặc hiệu trên đối chứng nhưng không bắt được mẫu PVS

Các đóng góp khoa học và giải pháp của tác giả:

• Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật PCR một bước phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn quan trọng (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium) trong phân bón vi sinh mà không nhất thiết phải trải qua toàn bộ quy trình nuôi cấy - phân lập kéo dài nhiều ngày.
• Đánh giá thực nghiệm tính khả dụng của hai phương pháp ly trích DNA (phương pháp tách chiết PCI truyền thống kết hợp làm giàu mẫu và phương pháp dùng kit tách chiết trực tiếp từ phân bón thô), chứng minh DNA tổng số thu nhận đều đạt độ tinh sạch đáp ứng khuếch đại gen 16S rRNA.
• Cung cấp dẫn liệu thực tế chứng minh sự tồn tại của vi khuẩn sống trong chế phẩm thương mại thông qua sự kết hợp giữa kỹ thuật nuôi cấy làm giàu sinh khối và phân tích phân tử PCR.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Các hạn chế được văn bản đề cập:

• Mẫu khảo sát thực nghiệm còn hạn chế (chỉ thu thập và kiểm tra trên 01 sản phẩm phân bón vi sinh thương mại tại thành phố Thủ Đức).
• Cặp mồi LaF-LaR thiết kế cho loài Lactobacillus acidophilus chưa đạt độ đặc hiệu thực nghiệm, tạo ra nhiều băng sản phẩm không mong muốn trên cả đối chứng dương lẫn các loài đối chứng khác.
• Chưa phát hiện được sự hiện diện của loài Lactobacillus plantarum trong mẫu phân bón thương mại dù cặp mồi LpF-LpR đã chứng minh tính đặc hiệu trên chủng chuẩn.
• Đối với Bacillus megaterium, PCR chỉ phát hiện được từ DNA tổng số của phân bón mà chưa bắt gặp trên các chủng đơn phân lập được từ đĩa cấy.

Hướng nghiên cứu tiếp theo (do tác giả đề xuất):

• Tiến hành thiết kế lại cặp mồi chuyên biệt cho loài vi khuẩn Lactobacillus acidophilus.
• Thực hiện ly trích DNA từ phân bón vi sinh với thời gian ủ và tăng sinh mẫu kéo dài hơn nhằm tối ưu lượng sinh khối vi khuẩn thu nhận.
• Mở rộng phạm vi thử nghiệm quy trình PCR và các cặp mồi đã tối ưu trên nhiều loại sản phẩm phân bón vi sinh thương phẩm khác nhau đang lưu hành trên thị trường.

Giá trị tham khảo

Tài liệu này hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Khoa học Cây trồng và Quản lý Nông nghiệp nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ (PGPR) và công nghệ sản xuất phân bón sinh học.
• Cán bộ kỹ thuật tại các trung tâm kiểm định chất lượng phân bón, viện nghiên cứu nông nghiệp cần quy trình PCR nhanh để định danh vi sinh vật trong các chế phẩm thương phẩm.
• Các nhà nghiên cứu phát triển sản phẩm men vi sinh, chế phẩm probiotic phục vụ chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và xử lý môi trường.

Các phần có giá trị tham khảo cao trong văn bản:

• Quy trình ly trích DNA tổng số từ mẫu phân bón có chất mang phức tạp (phương pháp PCI cải tiến và quy trình dùng kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification).
• Thông số chi tiết về thành phần phản ứng PCR (thể tích 13,5 µL) và chu trình nhiệt biến tính - bắt cặp - kéo dài chuẩn hóa cho từng cặp mồi Bacillus.
• Trình tự nhiệt độ bắt cặp ($T_m$) và phương pháp đối chiếu kiểm tra độ chuyên biệt mồi bằng công cụ tin sinh học (In silico PCR amplification và BLAST GenBank).

Câu hỏi thường gặp

1. Những cặp mồi nào trong nghiên cứu đã đạt độ đặc hiệu thực nghiệm để phát hiện vi khuẩn? Các cặp mồi BsF-BsR (định danh B. subtilis), BmF-BmR (định danh B. megaterium), BlF-BlR (định danh B. licheniformis) và LpF-LpR (định danh L. plantarum) đạt độ đặc hiệu cao, chỉ khuếch đại duy nhất một băng kích thước mong muốn trên chủng đối chứng dương tương ứng. Cặp mồi LaF-LaR (L. acidophilus) chưa đạt độ đặc hiệu do xuất hiện nhiều băng phụ khác nhau.

2. Kích thước đoạn khuếch đại PCR mong muốn của các loài vi khuẩn mục tiêu là bao nhiêu? Kích thước sản phẩm PCR đặc hiệu bao gồm: Bacillus subtilis đạt khoảng 206 bp; Bacillus megaterium đạt khoảng 202 bp; Bacillus licheniformis đạt khoảng 206 bp; Lactobacillus plantarum đạt khoảng 226 bp; và đoạn gen đối chứng chất lượng 16S rRNA đạt kích thước khoảng 1200–1700 bp.

3. Số lượng mẫu vi khuẩn phân lập được kiểm tra sinh hóa và tỷ lệ đạt chuẩn là bao nhiêu? Tác giả phân lập được 16 mẫu nghi ngờ Bacillus và 10 mẫu nghi ngờ Lactobacillus. Sau các thử nghiệm nhuộm Gram, catalase, thủy phân tinh bột, phân giải $CaCO_3$ và thử nghiệm VP, có 11/16 mẫu Bacillus (chiếm 68,75%) và 4/10 mẫu Lactobacillus (chiếm 40%) đạt đầy đủ các đặc tính sinh hóa chuẩn theo phân loại học Bergey.

4. Hai phương pháp tách chiết DNA trong nghiên cứu được áp dụng cho những đối tượng mẫu nào? Phương pháp tách chiết Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (PCI) kết hợp đệm STE được áp dụng cho sinh khối vi khuẩn nuôi cấy từ khuẩn lạc đơn và mẫu phân bón vi sinh đã qua bước nuôi ủ tăng sinh trong môi trường LB/MRS lỏng. Phương pháp sử dụng bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification (Thermo Scientific) được áp dụng để ly trích trực tiếp DNA từ mẫu phân bón vi sinh thô không qua bước nuôi cấy tăng sinh.

5. Kết quả phát hiện vi khuẩn trong mẫu phân bón thương mại giữa phương pháp PCR và phân lập truyền thống có điểm gì khác nhau? Bằng PCR, tác giả phát hiện trực tiếp được 3 loài vi khuẩn Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium) từ DNA tổng số của phân bón. Tuy nhiên, qua phương pháp phân lập tạo khuẩn lạc sống, chỉ có 2 loài được thu hồi và xác nhận là B. subtilis (8 mẫu) và B. licheniformis (3 mẫu), trong khi B. megaterium và L. plantarum không phân lập được khuẩn lạc sống từ mẫu phân bón khảo sát.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Đặng Thị Lan đã thiết kế và thử nghiệm thành công hệ thống các cặp mồi PCR chuyên biệt để phát hiện các loài Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium và Lactobacillus plantarum. Nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật PCR trong việc kiểm định nhanh thành phần vi sinh vật trực tiếp từ mẫu phân bón thương mại và từ các dòng phân lập. Kết quả thực nghiệm cung cấp cơ sở khoa học và quy trình kỹ thuật đáng tin cậy phục vụ công tác quản lý chất lượng, giám định các chế phẩm phân bón vi sinh trên thị trường nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Theo Báo cáo Tinh trạng Dân số Thế giới năm 2019 của UNFPA, dân số thế giới sẽ ngày càng tăng lên, có lẽ dân số thế giới sẽ trở thành 8 tỷ người vào năm 2030 và 9 tỷ người vào năm 2050, kéo theo đó nhu cầu dinh dưỡng cũng tăng cao. Điều đó thách thức việc phát triển sản xuất nông nghiệp dé cung cấp nhu cầu lương thực ngày càng tăng. Một giải pháp mang tính an toàn dé giải quyết van đề đó là nâng cao năng suất cây trồng thông qua cải tiến giống (tạo giống cây trồng) và sử dụng các loại phân bón an toàn với con người, môi trường và cây trồng dé hấp thụ hơn. Hiện nay, thị trường phân bón sinh học toàn cầu đang phát triển mở rộng, phân bón sinh học được ưa chuộng hơn phân bón hóa học vì chúng tiết kiệm chỉ phí, thân thiện với môi trường và đảm bảo được mục tiêu sản xuất nông nghiệp bền vững.

Ở Việt Nam, sự phát triển của ngành này còn hạn hẹp, cho đến năm 1991 mới chỉ có hơn 10 bộ phận theo hướng nghiên cứu này. Mặc dù phân bón vi sinh vật đã được nghiên cứu từ lâu, song do nhiều yếu tố chủ quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay còn hết sức hạn chế. Hiện nay việc sản xuất phân vi sinh vật ở Việt Nam đang được đầy mạnh nghiên cứu, triển khai và thử nghiệm dưới dạng pilot. Sản xuất quy mô công nghiệp đang ở giai đoạn đầu.

Nhưng nhìn chung phân bón vi sinh đang ngày càng phát triển trên thị trường Việt Nam do đó phải tăng cường công tác quản lý, kiểm tra chất lượng của những sản phẩm đó. Bên cạnh đó, với sự tiễn bộ của khoa học kỹ thuật đòi hỏi phải có những phương pháp hiện đại, nhanh chóng, tiết kiệm thời gian, tài nguyên nhưng vẫn đạt được kết quả chất lượng. Trong đó, PCR là một phương pháp nhân bản trình tự DNA thông qua các đoạn môi cụ thé một cách nhanh, nhạy và hiệu quả. Vì vậy việc xác định các thành phan vi sinh vật và chat lượng nhiều sản phẩm thương mai đang lưu thông trên thị trường một cách nhanh chóng và tiện lợi đang là yêu cầu cấp thiết.

Vì sự cấp thiết và ý nghĩa thực tiễn đó đề tài “ Khảo sát sự phát hiện một số loài vi khuẩn Bacillus trong phân vi sinh bằng các cặp mồi tự thiết kế ” đã được thực hiện. Mục tiêu đề tài Mục đích của nghiên cứu này là thiệt kê các đoạn môi cụ thê dé xác định các loài Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium va Lactobacillus plantarum. Nội dung thực hiện - Tim kiếm va thu thập sản phẩm phân bón vi sinh chứa thành phan là Bacillus subtilis, Bacillus lichenifomis, Bacillus megaterium, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus acidophilus có trên thị trường và phân lập các vi khuẩn trên môi trường chọn lọc của từng chi. - Ly trích DNA từ khuẩn lạc don và từ phân vi sinh.

- Định danh các vi khuân bằng phương pháp PCR. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Tình hình sản xuat phân vi sinh 2. Phân vi sinh (PVS) PVS được phát triển và sản xuất bởi Noble Hiltner tại Đức năm 1896 được Fred đặt tên là Nitragin, sau đó tiếp tục phát triển sản xuất ở một số nước như Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Dién (1914) (Schilling, 1988).

Theo Báo cáo Tình trạng Dân số Thế giới năm 2019 của UNFPA, thé giới có 7,7 tỷ người, tăng gần 100 triệu người so với năm 2018, có lẽ dân số thế giới sẽ trở thành 8 tỷ người vào năm 2030 và 9 tỷ người vào năm 2050. Dân số thế giới ngày càng tăng kéo theo nhu cầu dinh dưỡng cũng tăng cao. Một số cách giải quyết thách thức của việc phát triển sản xuất nông nghiệp dé cung cấp nhu cầu lương thực ngày càng tăng, chang hạn như: tăng diện tích cây trồng, sử dụng phân bón hóa học, thuốc trừ sâu trên quy mô rộng, cải tiến giống hay sử dụng PVS dé thúc đây năng suất cây trồng. Nhưng giải pháp tăng diện tích trồng cây có thé sẽ ảnh hưởng đến khối lượng lớn rừng và khu bảo ton thiên nhiên.

Giải pháp sử dụng quá mức với quy mô rộng trong thời gian ngắn phân bón hóa học và các loại thuốc trừ sâu gây tốn kém, tồn dư chất hóa học cùng với những tác động tiêu cực làm thay đổi tính chất lý hóa của đất. Hậu quả dẫn đến ô nhiễm môi trường gây nguy hại cho sức khỏe cộng đồng. Còn một giải pháp mang tính khả thi hơn đó là nâng cao năng suất cây trồng thông qua cải tiến giống (tạo giống cây trồng) và sử dụng các loại phân bón an toàn với con người, môi trường và cây trồng dễ hấp thụ hơn (Ahmad va ctv, 2021). Hiện nay, thị trường phân bón sinh học toàn cầu đang phát triển mở rộng, phân bón sinh học được ưa chuộng hơn phân bón hóa học vì chúng tiết kiệm chi phí, thân thiện với môi trường và đảm bảo được mục tiêu sản xuất nông nghiệp bền vững (Raimi và ctv, 2021).

Theo nghị định số: 113/2003/NĐ-CP của Chính phủ về quản lý sản xuất, kinh doanh phân bón, phân vi sinh (còn được gọi theo nghĩa rộng là chế phẩm sinh học hoặc chế pham vi sinh) được định nghĩa là: “loại phân có chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sông có ích với mật độ phù hợp với tiêu chuẩn đã ban hành”. Trong Nghị định 108/2017/NĐ-CP về quản lý phân bón có định nghĩa: “PVS là phân bón có chứa vi sinh vật có ích có khả năng tạo ra các chất dinh dưỡng hoặc chuyền hóa thành các chất dinh dưỡng trong đất mà cây trồng có thé sử dung được hoặc các vi sinh vật đối kháng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây hại cây trồng”. Phân bón vi sinh còn được định nghĩa là: “các sản phẩm sinh học có chứa các vi sinh vật sông mà khi bón vào hạt giống, bề mặt cây trồng hoặc đất sẽ thúc đây cây trồng tăng trưởng bằng một số cơ chế như tăng cung cấp chất dinh dưỡng như cố định đạm, hòa tan kali, phốt pho, silicat và ức chế vi sinh vật gây bệnh, tăng sinh khối của rễ hay diện tích rễ và tăng khả năng hút dinh dưỡng của cay” (Dasgupta và ctv, 2021). Tinh hình sản xuất PVS trên thé giới Với nhận thức ngày càng cao về vai trò của vi sinh trong việc cải tạo, duy trì độ phì nhiêu của đất, tăng năng suất cây trồng một cách tiết kiệm và thân thiện với môi trường, phân vi sinh đang được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trên toàn thế giới.

Thị trường phân bón vi sinh toàn cầu hiện nay đang phát triển, và các nước dẫn đầu như Argentina, Canada, Trung Quốc, Châu Âu, Ấn Độ và Hoa Kỳ chiếm đến 80% doanh thu PVS (Raimi và ctv, 2021). Năm 2018 thị trường PVS toàn cầu trị giá hơn 1,8 tỷ đô la Mỹ, mức tăng trưởng CAGR (mức tăng trưởng kép hàng năm) khoảng 14,3% trong giai đoạn 2011-2018 (Kumawat va ctv, 2021). Với sự quan tâm và xu hướng sử dụng phân vi sinh ngày càng tăng, cho đến năm 2019 quy mô thị trường PVS toàn cầu đạt 1,0 tỷ USD và được dự đoán sẽ chứng kiến tốc độ CAGR là 12,8% từ năm 2020 đến năm 2027. Một số công ty lớn trên thế giới hoạt động trong thị trường PVS, là những bảo tàng giống vi sinh vật sử dụng cho nông nghiệp như CBF China Biofertilizers AG (Đức), Novozyme A / S (Đan Mach), Mapleton Agribiotec PTY Ltd.

(Uc), Antibiotice SA, Biomax, Mapleton Agribiotec, Labiofam SA, Nutramax Laboratories Inc. (Mỹ), Growing Power Hairy Hill L. (Canada) va Rizobacter Argentina S. Tinh hinh san xuat PVS 6 Viét Nam Ở Việt Nam, các PVS đã được nghiên cứu từ những năm 1960 như PVS có định đạm và phân giải lân.

Năm 1987 mới sản xuất thành công Nitragin với chất mang là than bùn. Nhưng sự phát triển của ngành nay còn hạn hẹp, cho đến 1991 mới chỉ có hơn 10 bộ phận theo hướng nghiên cứu này. Nhu cầu về PVS rất lớn nhằm giảm bớt các tác hại của việc sử dụng không hợp lý các loại phân hóa học, làm ô nhiễm môi trường và tốn kém trong nhập khâu phân vô cơ. Tại hội nghị “Phát triển phân bón hữu cơ” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ngày 9/3/2018 bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Nguyễn Xuân Cường đã chỉ ra việc sử dụng phân bón hóa học trong thời gian qua đã gây thoái hóa đất, ô nhiễm, và chất lượng nông sản thấp.

Dé thúc day sản xuất nông nghiệp sạch theo hướng tiết kiệm, bền vững, hiệu quả thì xu hướng sử dụng phân bón hữu cơ, phân sinh học là tat yếu. Hiện nay trên toàn quốc tông công suất của các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ là 2,5 triệu tấn/năm chỉ bang gần 1/10 so với công suất sản xuất phân bón vô cơ (26,7 triệu tan/nam). Tính đến tháng 12/2017, số lượng sản phẩm phân bón hữu cơ sản xuất công nghiệp đã đăng ký là 713 sản pham, chiếm 5% so với tong số sản phẩm phân bón đã đăng ký và phân bón sinh học chỉ chiếm 1,3% (182 sản phẩm). Theo Bộ Nông nghiệp va Phát triển nông thôn, đến hết năm 2019, số lượng phân bón đã được công nhận lưu hành ở Việt Nam là 23.097 sản phẩm, trong đó phân bón vô cơ: 19.

Hiện nay, cả nước có tông số 814 nhà máy sản xuất phân bón trong đó, 576 nhà máy sản xuất phân bón vô cơ (công suất 28,8 triệu tắn/năm, chiếm 89,3%), 265 nhà máy sản xuất phân bón hữu cơ (công suất 3,47 triệu tắn/năm, chiếm 10,7%). Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2020, sử dụng 10,23 triệu tan phân bón, trong đó 7,6 triệu tan phân bón vô cơ và 2,63 triệu tan phân bón hữu cơ. Mặc dù phân bón vi sinh vật đã được nghiên cứu từ lâu, tuy nhiên do nhiều yếu tố ảnh hưởng khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay còn hết sức hạn chế. Hiện nay việc sản xuất phân vi sinh vật ở Việt Nam đang đây mạnh ở mức nghiên cứu, triển khai và thử nghiệm dưới dạng pilot.

Sản xuất quy mô công nghiệp đang ở giai đoạn đầu, vì thế việc xác định các thành phần vi sinh vật trong phân bón đang là yêu cầu cấp thiết trong công tác quản lý, kiểm tra chất lượng nhiều sản phâm thương mại đang lưu thông trên thị trường. Tống quan về vi khuẩn Bacillus. Năm 1935 Ehrenberg phát hiện vi khuẩn "Vibrio subtilis". Năm 1872 Ferdinand Cohn đặt tên chung cho các vi khuân hình que phát triển ở dạng sợi là Bacillus sp và ông đã đổi tên "Vibrio subtilis" thành Bacillus subtilis.