Phân Lập và Phát Hiện Vi Khuẩn Bacillus cereus Gây Ngộ Độc Thực Phẩm Tại Việt Nam

Nghiên cứu phân lập và phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Hoa
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Cảnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân Lập, Phát Hiện Vi Khuẩn Bacillus cereus Gây Ngộ Độc Thực Phẩm Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
• 1.1.1. Khái niệm ngộ độc thực phẩm
• 1.1.2. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm
• 1.2. Đặc điểm chung về Bacillus cereus
• 1.2.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus
• 1.2.2. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus
• 1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.2.4. Đặc điểm sinh hóa
• 1.2.5. Đặc điểm huyết thanh học
• 1.2.6. Đặc điểm gen Bacillus cereus
• 1.2.6.1. Hệ gen của Bacillus cereus
• 1.3. Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus
• 1.3.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus
• 1.3.2. Nguồn gốc lây nhiễm
• 1.3.3. Triệu chứng lâm sàng
• 1.3.4. Các yếu tố gây độc của Bacillus cereus. Cơ chế gây ngộ độc và liều lượng
• 1.4. Phương pháp phát hiện Bacillus cereus
• 1.4.1. Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa
• 1.4.2. Phương pháp miễn dịch
• 1.4.3. Phương pháp dựa trên đặc điểm gen
• 1.4.4. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu về Bacillus cereus
• 1.4.4.1. Kỹ thuật PCR
• 1.4.4.2. Giải mã trình tự gen (Sequencing)
• 1.4.4.3. Kỹ thuật khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA đa hình (RAPD)
• 1.4.4.4. Kỹ thuật RFLP (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)
• 1.5. Vật liệu và phương pháp
• 1.5.1. Vật liệu nghiên cứu
• 1.5.2. Hóa chất và môi trường
• 1.5.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.5.3.1. Phương pháp phân lập Bacillus cereus
• 1.5.3.2. Phương pháp kiểm tra các chủng phân lập bằng đặc điểm hình thái và một số phản ứng sinh hóa
• 1.5.3.3. Định danh chủng vi khuẩn
• 1.5.3.4. Xác định một số gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR
• 1.5.3.5. Xác định độ nhạy trong phát hiện các gen mã hóa độc tố của chủng vi khuẩn bằng phương pháp PCR
• 1.5.3.6. Bacillus cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định
• 2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 2.1. PHÂN LẬP Bacillus cereus
• 2.1.1. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn được chọn lọc
• 2.1.1.1. Khả năng sinh Catalase
• 2.1.1.2. Khả năng sinh axetoin (Phản ứng V-P)
• 2.1.1.3. Khả năng sinh gelatinase
• 2.1.1.4. Khả năng phân giải thạch huyết
• 2.1.2. Định danh chủng D1.7 bằng phân tích trình tự 16S rDNA
• 2.1.3. Phát hiện gen mã hóa độc tố của chủng B.
• 2.1.3.1. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR
• 2.1.3.2. Phát hiện Bacillus cereus chứa gen mã hóa độc tố trên thực phẩm giả định
• 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Ngộ độc thực phẩm và Nguyên nhân gây Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]. Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh. Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh.

1.1. Khái niệm Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6].

1.2. Nguyên nhân gây Ngộ độc thực phẩm

Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5]. Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất. Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2].

II. Đặc điểm chung về Bacillus cereus

Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29]. Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm. Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B. cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ tại Việt Nam.

2.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus

Phân loại quốc tế B. cereus: • Thuộc giới Bacteria • Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus • Loài (species) B. cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887. Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn. Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B. cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25].

2.2. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus

Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B. cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B. cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động. cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng. Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18].

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Mỗi năm tại Việt Nam ghi nhận trung bình từ 250 đến 500 vụ ngộ độc thực phẩm, khiến hơn 7.000 người mắc và làm từ 100 đến 200 trường hợp tử vong. Trong số các nguyên nhân được xác định, ngộ độc do vi sinh vật chiếm tỷ lệ áp đảo từ 33% đến 49%. Vi khuẩn Bacillus cereus là một trong những tác nhân nguy hiểm hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc tập thể, đặc biệt qua các thực phẩm giàu tinh bột như cơm nguội, bún và bánh phở. Do có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt và tồn tại trong đất với mật độ 10^3 đến 10^5 bào tử trên một gram, vi khuẩn này dễ dàng xâm nhiễm vào chuỗi cung ứng thực phẩm và sống sót qua quá trình nấu nướng thông thường. Khi gặp điều kiện thuận lợi, tế bào sinh dưỡng phát triển và sản sinh các loại độc tố gây nôn hoặc tiêu chảy cấp tính khi đạt ngưỡng mật độ từ 10^5 đến 10^8 tế bào trên một gram.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là phân lập các chủng Bacillus cereus từ nguồn mẫu thực phẩm và đất tại Việt Nam, định danh chính xác bằng phương pháp sinh học phân tử và xây dựng quy trình kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR) nhằm phát hiện nhanh các gen mã hóa độc tố đường ruột. Đề tài được triển khai thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam trong thời gian từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.

Ý nghĩa thực tiễn của công trình thể hiện ở việc nâng cao năng lực giám sát an toàn thực phẩm. Quy trình PCR được tối ưu hóa cho phép rút ngắn thời gian kiểm nghiệm từ 3 đến 5 ngày theo phương pháp vi sinh truyền thống xuống còn dưới 6 giờ, đồng thời đạt độ nhạy phát hiện vi khuẩn ở ngưỡng 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit, hỗ trợ đắc lực cho công tác điều tra dịch tễ và phòng ngừa ngộ độc thực phẩm diện rộng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng phân loại học vi sinh vật hiện đại kết hợp với cơ chế bệnh sinh phân tử của nhóm trực khuẩn Bacillus. Về mặt phân loại, chi Bacillus thuộc ngành Firmicutes, trong đó nhóm Bacillus cereus bao gồm các loài có quan hệ di truyền rất gần gũi như Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis và Bacillus mycoides. Do trình tự gen 16S rRNA giữa các loài này có độ tương đồng vượt trên 99%, việc phân loại đòi hỏi sự kết hợp chặt chẽ giữa kiểu hình sinh hóa và các chỉ thị phân tử đặc hiệu.

Cơ chế gây ngộ độc của Bacillus cereus được chia thành hai hội chứng bệnh lý rõ rệt. Hội chứng gây nôn do độc tố Cereulide, một peptide vòng có trọng lượng phân tử 1,2 kDa rất bền với nhiệt độ (chịu được 126°C trong 90 phút) và pH dạ dày, được hình thành trực tiếp trong thực phẩm trước khi ăn. Hội chứng tiêu chảy do các độc tố ruột protein được tiết ra trong ruột non, bao gồm phức hợp độc tố ly giải hồng cầu HBL (mã hóa bởi operon hblA, hblC, hblD), phức hợp độc tố không ly giải hồng cầu NHE (mã hóa bởi operon nheA, nheB, nheC), độc tố tế bào CytK và độc tố ruột BceT cùng EntFM. Các độc tố ruột này nhạy cảm với nhiệt độ, bị bất hoạt ở 56°C sau 5 phút và dễ bị phân hủy bởi enzyme tiêu hóa.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành thu thập 25 mẫu thực nghiệm bao gồm các mẫu đất và thực phẩm giàu tinh bột (bún, bánh phở, cơm) tại các khu vực chợ và quán ăn quanh Học viện Nông nghiệp Việt Nam theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên có chủ đích. Việc lựa chọn các loại thực phẩm nguồn gốc từ gạo xuất phát từ thực tế đây là môi trường dinh dưỡng lý tưởng để bào tử Bacillus cereus nảy mầm và sản sinh độc tố.

Quy trình phân tích kết hợp giữa phương pháp nuôi cấy vi sinh cổ điển và sinh học phân tử tiên tiến. Các mẫu được làm giàu trong môi trường lỏng pepton ở 37°C trong 24 giờ, sau đó phân lập trên môi trường chọn lọc Mannitol Egg Yolk Polymyxin (MYP) và thạch máu cừu. Các chủng nghi ngờ được kiểm tra hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram, nhuộm tinh thể bằng fushin bazơ và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại 13.000 lần. Đặc tính sinh hóa được xác định thông qua phản ứng catalase với dung dịch H2O2 30%, phản ứng Voges-Proskauer (V-P) xác định axetoin và thử nghiệm dịch hóa gelatin.

Để định danh chính xác loài và xác định gen độc tố, DNA tổng số được tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt kết hợp kết tủa isopropanol. Đoạn gen 16S rDNA kích thước khoảng 1.500 bp được khuếch đại bằng cặp mồi FD1 và RP2, giải trình tự và phân tích phát sinh loài bằng phần mềm MEGA7 với thuật toán Bootstrap 1.000 lần lặp. Sáu cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong kỹ thuật PCR để dò tìm các gen độc tố bao gồm hblA (319 bp), hblD (429 bp), nheA (480 bp), bceT (428 bp), cytK (605 bp) và entFM (1.269 bp). Toàn bộ quá trình thực nghiệm và kiểm tra độ nhạy trên nền thực phẩm giả định được thực hiện đồng bộ trong chu kỳ nghiên cứu kéo dài 9 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc vi sinh từ các nguồn mẫu đã thu nhận được 11 chủng vi khuẩn thuần khiết ký hiệu từ C1.1 đến C1.5, CV1.1, CV1.2, D1.7, B1, B4 và Đ mang các đặc điểm hình thái đặc trưng của nhóm Bacillus cereus. Tất cả 11 chủng (chiếm tỷ lệ 100%) đều là trực khuẩn Gram dương hình que, sinh nội bào tử hình elip nằm ở trung tâm tế bào, không hình thành tinh thể độc hình quả trám sau 3 ngày nuôi cấy (loại trừ loài Bacillus thuringiensis), và khuẩn lạc trên môi trường MPA không có dạng rễ cây (loại trừ loài Bacillus mycoides). Dưới kính hiển vi điện tử, hai cực tế bào tròn rõ rệt giúp phân biệt hoàn toàn với vi khuẩn than Bacillus anthracis vốn có đầu tế bào vuông.

Thử nghiệm sinh hóa ghi nhận 100% số chủng phân lập có phản ứng dương tính với catalase, phản ứng Voges-Proskauer tạo màu đỏ hồng và có khả năng sinh enzyme gelatinase làm lỏng môi trường gelatin. Tuy nhiên, chỉ có 4 trên 11 chủng (chiếm 36,36%) bao gồm D1.7, B1, B4 và Đ có khả năng sinh enzyme haemolysin tạo vòng phân giải trong suốt trên môi trường thạch máu cừu. Chủng D1.7 thể hiện các đặc tính sinh học điển hình nhất đã được lựa chọn để định danh phân tử.

Phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA kích thước 1.500 bp của chủng D1.7 và đối soát dữ liệu BLAST trên GenBank cho thấy mức độ tương đồng di truyền đạt 99% so với các chủng Bacillus cereus chuẩn quốc tế, với giá trị độ tin cậy Bootstrap trên cây phát sinh loài đạt 100%. Chủng vi khuẩn được định danh chính thức là Bacillus cereus D1.7.

Kết quả phản ứng PCR với các cặp mồi chuyên biệt đã chứng minh chủng Bacillus cereus D1.7 mang đồng thời các gen mã hóa độc tố đường ruột gồm hblA, hblD, nheA, bceT, cytK và entFM. Thử nghiệm độ nhạy của phản ứng PCR xác định giới hạn phát hiện đạt 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit. Khi thử nghiệm trên mẫu cơm giả định có bổ sung vi khuẩn cạnh tranh Bacillus subtilis ở mật độ cao 10^8 tế bào trên một mililit, kỹ thuật PCR vẫn phát hiện rõ nét phân đoạn gen độc tố hblD tại nồng độ 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit mà không xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc ức chế phản ứng.

Thảo luận kết quả

Sự hiện diện đồng thời của nhiều gen mã hóa độc tố đường ruột trong chủng Bacillus cereus D1.7 phản ánh độc lực cao của các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu dịch tễ học quốc tế, điển hình như công bố của tác giả Guinebretière vào năm 2002 trên 37 chủng Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm, trong đó 97,3% chủng mang gen nhe, 73% chủng mang gen hbl và cytK, và 56,8% chủng mang gen bceT. Việc không có chủng nào chỉ mang duy nhất một thành phần độc tố khẳng định tính chất phức hợp và đa dạng của các yếu tố độc lực vi sinh vật.

Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm sinh hóa có thể được biểu diễn trực quan qua bảng tổng hợp so sánh 11 chủng phân lập với 5 chỉ tiêu sinh học then chốt, làm nổi bật sự vượt trội của 4 chủng sinh haemolysin. Đồng thời, ảnh chụp điện di gel agarose nồng độ 1,5% thể hiện rõ các vạch sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước chuẩn xác từ 319 bp đến 1.269 bp mà không xuất hiện băng phụ. Cây phát sinh loài xây dựng trên hệ thống MEGA7 biểu thị rõ vị trí phân loại của chủng D1.7 cùng nhánh với các chủng Bacillus cereus gây bệnh chuẩn, minh chứng cho độ chính xác tuyệt đối của phương pháp định danh kết hợp. Việc phát hiện trực tiếp gen độc tố từ nền mẫu thực phẩm tinh bột ở ngưỡng 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit mở ra giải pháp chẩn đoán lâm sàng nhanh chóng, khắc phục triệt để nhược điểm tốn thời gian và dễ nhầm lẫn của phương pháp nuôi cấy truyền thống.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, Bộ Y tế và Cục An toàn thực phẩm cần chuẩn hóa và ban hành quy trình xét nghiệm PCR đa mồi (Multiplex-PCR) phát hiện trực tiếp vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố trong thực phẩm. Mục tiêu đặt ra là rút ngắn thời gian chẩn đoán các vụ ngộ độc thực phẩm xuống dưới 4 giờ và triển khai áp dụng tại 100% trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh trước quý IV năm 2027.

Thứ hai, các viện nghiên cứu chuyên ngành và các trường đại học cần tổ chức chuyển giao kỹ thuật tách chiết DNA nhanh và quy trình phản ứng PCR cho 63 Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm trên cả nước. Chương trình đào tạo cần nâng cao năng lực cho ít nhất 200 kiểm nghiệm viên trong giai đoạn từ năm 2027 đến năm 2028, đảm bảo kiểm soát ngưỡng phát hiện vi khuẩn đạt độ nhạy 10^3 CFU trên một gram thực phẩm.

Thứ ba, Ban Quản lý An toàn thực phẩm các địa phương cần tăng cường kiểm tra các cơ sở chế biến bún, bánh phở và bếp ăn tập thể, bắt buộc áp dụng tiêu chuẩn kiểm soát nhiệt độ nghiêm ngặt. Thực phẩm chế biến từ tinh bột gạo sau khi nấu chín phải được bảo quản liên tục ở nhiệt độ trên 60°C hoặc làm lạnh dưới 5°C, tuyệt đối không lưu giữ quá 2 giờ ở nhiệt độ phòng, nhằm giảm 50% số ca ngộ độc thực phẩm do độc tố Bacillus cereus từ năm 2027.

Thứ tư, Bộ Khoa học và Công nghệ cùng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần cấp kinh phí mở rộng các đề tài điều tra dịch tễ học phân tử trên diện rộng. Kế hoạch thực hiện cần thu thập và phân tích định kỳ 500 mẫu đất, nông sản và thực phẩm mỗi năm tại các vùng kinh tế trọng điểm trong giai đoạn 2027 đến 2030 để xây dựng cơ sở dữ liệu số hóa về các chủng vi sinh vật sinh độc tố tại Việt Nam.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Thứ nhất, các học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học và Công nghệ thực phẩm. Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập vi sinh vật, kỹ thuật nhuộm tiêu bản kính hiển vi điện tử, quy trình giải trình tự gen 16S rDNA và thiết kế mồi PCR chuyên sâu.

Thứ hai, đội ngũ kỹ thuật viên xét nghiệm tại các viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC) và các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Tài liệu là hướng dẫn chi tiết để ứng dụng quy trình PCR phát hiện nhanh các gen độc tố vi khuẩn với ngưỡng nhạy 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit trong các ca ngộ độc cấp tính.

Thứ ba, cán bộ quản lý chất lượng (QA/QC) và chuyên gia an toàn thực phẩm tại các doanh nghiệp sản xuất, chế biến lương thực, thực phẩm từ tinh bột. Luận văn cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng hệ thống phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP), nhận diện nguy cơ nhiễm bào tử chịu nhiệt và kiểm soát mật độ vi sinh dưới ngưỡng gây độc 10^5 CFU trên một gram.

Thứ tư, các giảng viên đại học và chuyên gia nghiên cứu dịch tễ học bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm. Nội dung công trình là nguồn dẫn chứng khoa học giá trị phục vụ công tác giảng dạy chuyên đề an toàn sinh học phân tử, độc chất học vi sinh và dịch tễ học thực phẩm.

Câu hỏi thường gặp

Vi khuẩn Bacillus cereus gây ra những dạng ngộ độc thực phẩm nào và thời gian ủ bệnh là bao lâu?

Vi khuẩn gây ra hai thể ngộ độc chính gồm thể nôn và thể tiêu chảy. Thể nôn do độc tố Cereulide có thời gian ủ bệnh ngắn từ 0,5 đến 5 giờ sau khi ăn thực phẩm giàu tinh bột như cơm nguội. Thể tiêu chảy do phức hợp độc tố ruột HBL và NHE sinh ra trong ruột non, có thời gian ủ bệnh kéo dài từ 8 đến 16 giờ kèm đau bụng dữ dội.

Tại sao phương pháp PCR lại vượt trội hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống trong phát hiện Bacillus cereus?

Phương pháp nuôi cấy truyền thống mất từ 3 đến 5 ngày và không thể phân biệt được chủng có mang gen sinh độc tố hay không. Ngược lại, kỹ thuật PCR cho kết quả chính xác chỉ trong 4 đến 6 giờ, xác định trực tiếp các gen độc tố như hblD hay nheA với độ nhạy cao đạt 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit.

Bào tử và độc tố của Bacillus cereus có bị tiêu diệt khi đun sôi thức ăn thông thường không?

Bào tử vi khuẩn có lớp vỏ bền vững chịu được nhiệt độ 100°C và độc tố gây nôn Cereulide vẫn giữ nguyên hoạt tính ở 126°C trong 90 phút. Do đó, việc đun sôi hoặc chiên lại thức ăn đã nhiễm khuẩn và tích tụ độc tố không thể loại bỏ nguy cơ gây ngộ độc cho người sử dụng.

Chỉ thị sinh học phân tử nào được ứng dụng để định danh chính xác chủng vi khuẩn trong nghiên cứu?

Nghiên cứu đã sử dụng cặp mồi FD1 và RP2 để nhân bản đoạn gen 16S rDNA kích thước 1.500 bp. Kết quả giải trình tự và tra cứu trên hệ thống GenBank đạt mức độ tương đồng di truyền 99% với loài Bacillus cereus, được chứng thực bằng giá trị tin cậy Bootstrap 100% trên cây phân loại phát sinh loài.

Mật độ vi khuẩn Bacillus cereus bao nhiêu trong thực phẩm thì bắt đầu gây nguy cơ ngộ độc cho người ăn?

Mật độ vi khuẩn đạt từ 10^5 đến 10^8 tế bào trên một gram thực phẩm đủ điều kiện sản sinh lượng độc tố gây bệnh cấp tính. Quy trình PCR trong đề tài có khả năng cảnh báo sớm nguy cơ khi phát hiện vi khuẩn ở mật độ thấp từ 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit, giúp ngăn chặn thực phẩm bẩn trước khi đến tay người tiêu dùng.

Kết luận

• Đã phân lập thành công 11 chủng vi khuẩn Gram dương mang đặc điểm hình thái và sinh hóa điển hình của nhóm Bacillus cereus từ các nguồn mẫu đất và thực phẩm tinh bột tại Hà Nội.
• Định danh chính xác chủng vi khuẩn Bacillus cereus D1.7 dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA kích thước 1.500 bp với độ tương đồng di truyền đạt 99% và giá trị Bootstrap 100%.
• Xác định chủng D1.7 mang hệ thống đa gen mã hóa các độc tố đường ruột nguy hiểm bao gồm hblA, hblD, nheA, bceT, cytK và entFM.
• Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật PCR phát hiện gen độc tố hblD trên nền mẫu thực phẩm giả định với độ nhạy đạt ngưỡng 3,5 x 10^3 tế bào trên một mililit mà không bị ức chế bởi vi khuẩn cạnh tranh.
• Đóng góp giải pháp khoa học thực tiễn giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm độc chất vi sinh từ nhiều ngày xuống dưới 6 giờ, phục vụ hiệu quả công tác kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm.

Đóng góp lớn nhất của công trình là cung cấp quy trình sinh học phân tử tin cậy và có tính ứng dụng cao trong việc phát hiện nhanh các chủng Bacillus cereus sinh độc tố tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2027 đến 2028, hướng nghiên cứu tiếp theo cần phát triển bộ kit Multiplex-PCR tích hợp để phát hiện đồng thời 6 loại gen độc tố trong cùng một phản ứng. Các cơ quan quản lý và đơn vị kiểm nghiệm thực phẩm hãy chủ động áp dụng quy trình kỹ thuật PCR này vào công tác giám sát định kỳ để bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu thiệt hại do các vụ ngộ độc thực phẩm gây ra.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm là một tình trạng bệnh lý xảy ra do ăn uống phải các thức ăn bị ô nhiễm chất độc hại đối với sức khoẻ con người. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có chừng 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Ngộ độc thực phẩm do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra, nhưng trong số đó thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm 33-49% [1]. Ngộ độc thực phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật có 2 dạng gây bệnh: vi sinh vật tiết ra độc tố và sự hiện diện của độc tố này trong thực phẩm là nguyên nhân gây bệnh.

Dạng khác là vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm, từ đó xâm nhập vào cơ thể con người, sự hiện diện của chúng hoặc các sản phẩm hình thành từ quá trình phân giải các chất trong cơ thể là nguyên nhân gây bệnh. Bacillus cereus là vi khuẩn có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với 2 thể bệnh là thể tiêu chảy và thể gây nôn [29]. Chủng vi khuẩn này còn có khả năng hình thành bào tử và phân bố rộng khắp trong môi trường, vì thế đây là nhóm vi khuẩn quan trọng khi nhìn từ khía cạnh vệ sinh thực phẩm. Việt Nam là nước có điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho B.

cereus phát triển trong thực phẩm và giải phóng ra độc tố, ý thức của người dân chưa đầy đủ và đặc biệt là việc sử dụng rất nhiều các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ gạo làm cho tỷ lệ ngộ độc thực phẩm do B. cereus là không nhỏ tại Việt Nam. Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định B. cereus gây ngộ độc thực phẩm: Phương pháp định danh kinh điển dựa vào việc phân lập và các đặc tính sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn.

Phương pháp ELISA. Phương pháp phát hiện gen dựa vào phản ứng khuyếch đại gen – Polymerase Chain Reaction (PCR). Trong đó phương pháp phát hiện gen nhờ PCR đang được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng cũng như trong chẩn đoán các tác nhân gây ngộ độc có trong thực phẩm. Phương pháp này cho phép xác định chính xác được sự ô nhiễm của thực phẩm với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông qua sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh.

Ưu điểm của kỹ thuật này là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiết kiệm thời gian, kể cả nguyên vật liệu. Vì vậy, việc áp dụng kỹ thuật này trong phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng gây 1 c ngộ độc thực phẩm là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thiết thực trong việc góp phần kiểm soát VSATTP, giảm chi phí xã hội thông qua việc ngăn ngừa các vụ ngộ độc thực phẩm do B. Do đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, phát hiện vi khuẩn Bacillus cereus sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam”.

Đề tài được đặt ra nhằm đạt được mục tiêu sau: Phát hiện vi khuẩn B. cereus có khả năng sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm từ các chủng phân lập tại Việt Nam. Để đạt được các mục tiêu trên cần phải thực hiện các nội dung sau: - Phân lập và xác định vi khuẩn B. cereus từ các mẫu khác nhau dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự 16s rDNA.

- Phát hiện gen mã hoá độc tố của các chủng B. cereus bằng kỹ thuật PCR. - Xác định độ nhạy của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện B. - Phát hiện vi khuẩn B.

cereus sinh độc tố trong một số thực phẩm giả định bằng kỹ thuật PCR. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. KHÁI NIỆM NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ NGUYÊN NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 2. Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận động…) [6].

Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Những năm qua, kinh tế nước ta được đổi mới, phát triển và nhiều khởi sắc, đời sống nhân dân được cải thiện. Bên cạnh đó các vụ ngộ độc thức ăn vẫn thường xuyên xảy ra, khắp mọi nơi và ngày càng nhiều với nhiều nguyên nhân khác nhau. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố. Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[5].

Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật luôn là nguyên nhân phổ biến nhất. Các loại vi sinh vật có khả năng gây ngộ độc thực phẩm thường gặp nhất là tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…[2]. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ Bacillus cereus 2. Vị trí phân loại và nguồn gốc vi khuẩn Bacillus cereus Phân loại quốc tế B.

cereus: • Thuộc giới Bacteria • Ngành (phylum) Firmicutes • Lớp (class) Bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceae • Chi (genus) Bacillus 3 c • Loài (species) B. cereus lần đầu tiên được Frankland phân lập và mô tả vào năm 1887. Tuy nhiên, cho đến năm 1950, vi khuẩn này mới được Hauge và cộng sự chứng minh là căn nguyên gây ra các vụ dịch ngộ độc thức ăn. Các vụ dịch ngộ độc thức ăn do B.

cereus có đặc điểm là nôn và tiêu chảy [25]. cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, Hauge đã phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106/ml và uống 200ml cocktail. Sau 13h ông cảm thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau một triệu chứng ngộ độc thực phẩm khác do chủng B.

cereus gây ra lại xuất hiện ở công nhân Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn (chưa đến 5h). cereus được công nhận là một nguyên nhân quan trọng của ngộ độc thực phẩm trên toàn thế giới [28]. Đặc điểm hình thái Bacillus cereus Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus như là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [31], thì B.

cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B. cereus dài 3 - 5µm, rộng 1 - 1,2µm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông. Phần lớn tế bào B. cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động.

cereus có khả năng hình thành nội bào tử. Nội bào tử của B. cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước của bào tử khoảng 1 – 1,5µm, bào tử nang không phồng. Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối [18].

Khả năng hình thành bào tử là đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B. Nhờ có đặc điểm này mà B. cereus có thể tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất. Vì vậy, khả năng lây nhiễm B.

cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy hiểm hơn. Khi tế bào sinh dưỡng của B. cereus gặp phải điều kiện bất lợi như nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường thiếu chất dinh dưỡng khô hạn…, B. cereus sẽ sinh nội bào tử.

Nội bào tử nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do. Bào tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài. Khi gặp môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ, pH tối ưu…, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất.

Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất 4 c lợi nội bào tử lại được hình thành [4]. Do bào tử của B. cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng nên trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại bỏ hết bào tử B. Hình ảnh tế bào vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi 2.

Đặc điểm nuôi cấy Là loại vi khuẩn dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. cereus có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ rất rộng 5 - 50oC, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B. cereus là 30 - 37oC.  Độ pH biến thiên từ 4,3 – 9,3, pH tối ưu là 7 - 7,2.

cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7 – 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [18, 27].  Trên môi trường LB lỏng: đục Khi nuôi cấy B. cereus trên môi trường phân lập MYP trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7 – 7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc B. cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzyme lecithinase) [17,19,27].

5 c Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA, khuẩn lạc B. cereus có đường kính khoảng 0,4 – 0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,32]. Khuẩn lạc vi khuẩn B. cereus trên môi trường MYP (A), trên môi trường thạch máu (B) Trên môi trường thạch máu, B.

cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết. Đây là một trong các đặc điểm để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn khác như B. anthracis (không có khả năng sinh ra haemolysin), đây cũng là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B.

Đặc điểm sinh hóa Để phân biệt B. cereus với các vi khuẩn trong Bacillus nhóm 1 (B. thuringiensis,…) dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L – tyrosine., được trình bày trong bảng sau: 6 c Bảng 2. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các loài trong nhóm Bacillus cereus [27] Loài Đặc tính B.