Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về Salmonella spp. thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống Salmonella.
là vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu hơi tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 μm, sống kị khí tùy nghi, không hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao có khoảng 7 đến 12 lông mao chung quanh thân, trừ S. pullorum gây bệnh cho gia cầm. dễ dàng nuôi cấy ở 37oC trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển các khuẩn lạc có đường kính 2 – 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất (Brenner và ctv, 2000). Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp là S.
Do đó, việc chuẩn đoán chính xác các loại trực khuẩn này có một ý nghĩa rất quan trọng về mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh công cộng, dự phòng bệnh truyền nhiễm (Nguyễn Phùng Tiến và ctv, 2003). * Phân loại Salmonella spp. theo loài và theo kiểu huyết thanh Theo hệ thống phân loại Kaufmann-White, dựa vào đặc điểm kiểu hình cũng như phân tích bằng lai DNA-DNA, Salmonella được chia thành 2 loài: Salmonella enteritica và Salmonella bongori (Brenner và ctv, 2000). bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V và Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài là S.
Salmonella có 2579 chủng huyết thanh được xác định đến năm 2010 (Guibourdenche và ctv, 2010). enterica, có tính gây bệnh cao đối với động vật máu nóng, có 1531 serotypes. salamae được tìm thấy trong 505 serotypes; S. Trang 5 * Cấu trúc kháng nguyên và độc tố Salmonella có 3 loại kháng nguyên là kháng nguyên O (kháng nguyên thân – somatic), kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao – flagella) và kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt – capsule) (John, 2004; Silva, 2006; Agasan, 2002; Jay, 1992).1 Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella (Nguồn: Diffchamb, 1997) Kháng nguyên O: gồm chuỗi lipopolysaccharide-protein trên bề mặt tế bào.
Kháng nguyên O là polymer của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 – 6 nhóm đường tùy từng nhóm kháng nguyên O. Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường khác nhau, hay khác nhau do bản chất liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần (Hu & Kopecko 2003). Kháng nguyên H: có bản chất là protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H gắn liền với roi của vi khuẩn nên kháng nguyên này chỉ hiện diện trên các chủng có tiêm mao.
Kháng nguyên tiêm mao H có thành phần khác nhau tùy vào kiểu huyết thanh (Jay, 1992). Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh (McQuiston và ctv, 2008). Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.
Kháng nguyên này chỉ được xác định trên 3 kiểu huyết thanh: S. Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp (Trần Linh Thước, 2002; Nguyễn Phùng Tiến và ctv, 2003).
Năm 2006, theo điều tra của Trung tâm Phòng chống dịch bệnh của Mỹ (CDC) về các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đã công bố 18% số vụ ngộ độc thực phẩm (trong tổng số 624 vụ) có nguyên nhân bắt nguồn từ Salmonella, phổ biến nhất là S. Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao được phát hiện ở rất nhiều loài như lợn, trâu bò, gia cầm và con người (Angkititrakul, 2005). Hơn nữa, báo cáo năm 2010 của Trung tâm Phòng chống dịch bệnh của Mỹ (CDC) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Salmonella ở Mỹ trong năm 2010 cao hơn 10% (95% Confidence Interval (CI) 4- 17%) so với giai đoạn 2006-2008. Năm 2017, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật của Mỹ (CDC) cho biết có ít nhất 611 người tại nước này bị nhiễm bệnh và một người tử vong trong 8 đợt bùng phát dịch bệnh do vi khuẩn đường ruột Salmonella gây ra liên quan tới gia cầm sống.
Ở Nhật Bản, tỷ lệ nhiễm S. enterica trong thịt lợn là 2,8% (Kanako và ctv, 2009); tỷ lệ nhiễm Salmonella tại Ailen là 2,9% (Prendergast và ctv, 2009). Tại Hàn Quốc, tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trong thịt gà và thịt lợn lần lượt là 18,8% và 30,3% (Kim và ctv, 2014).
Tại khu vực Đông Nam Á, Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao ở trứng gà, thịt gà và thịt lợn bán tại các chợ bán lẻ (Padungtod, 2006). Tại Thái Lan, tỷ lệ nhiễm Salmonella trên lợn ở các trang trại, lò mổ và thịt lợn trên thị trường lần lượt là 6%, 28% và 29% (Padungtod, 2005). Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm Salmonella của thịt lợn bán lẻ tại các chợ ở Huế khoảng 3,8% (Koichi và ctv, 2009); theo Van và ctv (2007), tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh là 6%. Theo nghiên cứu của Le Bas và ctv, nhiễm Salmonella trên thân thịt tại lò mổ, nguồn nước ở một số lò mổ tại Hà Nội lần lượt là 5,1%, 6,5%.
Nghiên cứu của Trần Thị Xuân Mai và ctv (2011) cho biết trong tổng số 260 mẫu thực phẩm Trang 7 được thu thập từ các chợ khác nhau trong địa bàn thành phố Cần Thơ để kiểm tra về sự hiện diện của Salmonella. Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp. là nem chua (20%), thịt heo (47,5%), thịt bò (30%), thịt gà (46,7%), trứng gà (lòng trắng và lòng đỏ) (10%), vỏ trứng gà (40%), chả lụa (10%), ba khía (0%), sò huyết (40%), bì heo (20%). Trong đó, 2,5% ở thịt heo; 2,5% ở thịt bò; 1,6% ở thịt gà; 10% ở vỏ trứng gà và 5% ở sò huyết phát hiện nhiễm Salmonella enteri.
Theo Trương Hà Thái và ctv (2012) khi nghiên cứu các mẫu thịt tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam thấy 39,6% mẫu thịt lợn và 42,9% mẫu thịt gà phân lập được vi khuẩn Salmonella. Các yêu cầu về Salmonella trong thực phẩm Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra nghiêm ngặt bởi các cơ quan chức năng.
Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 3. Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào. Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.
Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế Nhóm thực phẩm Phương pháp kiểm tra Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm TCVN 5153:90 muối, sấy khô, hun khói Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường TCVN 6402:98 hoặc chất ngọt khác Trang 8 Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để TCVN 6402:98 lên men hoặc acid hóa Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế TCVN 5153:90 phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó 1. Các phương pháp phát hiện Salmonella spp. Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới vẫn đang áp dụng phương pháp nuôi cấy để phát hiện Salmonella trong thực phẩm (ISO 6579-1: 2017). Đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi.
Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình,… Do đó, thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 5– 7 ngày. Ngoài phương pháp truyền thống để phân lập và định danh Salmonella, còn có một số phương pháp kiểm tra nhanh Salmonella có thể thực hiện việc kiểm tra trên nhiều mẫu trong thời gian ngắn. Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, real-time, nested PCR dựa vào việc xác định sự hiện diện của đoạn DNA đích. Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau: tiền tăng sinh trong môi trường BPW, xử lý tế bào để thu nhận khuôn DNA, thực hiện phản ứng PCR, phân tích kết quả.
Ưu điểm của các phương pháp sinh học phân tử: thời gian cho kết quả nhanh; có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy; hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ lưu trữ hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống; ít tốn kém công lao động. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (Trần Linh Thước, 2002) với tổng thời gian thực hiện để có kết quả là 2 ngày. Hiện nay trong công tác kiểm nghiệm khách hàng yêu cầu có kết quả nhanh nhưng phải chính xác, đặc hiệu. Phương pháp LAMP đã đáp ứng được điều đó vì quy trình thực hiện LAMP nhanh nên thời gian để có kết quả phân tích dưới 2 ngày, có thể được sử dụng để phát hiện Salmonella spp.
ngay tại hiện trường. Do vậy phương pháp LAMP có thể là một phương pháp đặc biệt hữu ích để chẩn đoán Salmonella spp. có trong thực phẩm.