Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp trên nền mẫu thịt và rau bằng kỹ thuật lamp loop mediated isothermal amplification năm thứ 2

Tài liệu nghiên cứu Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp trên nền mẫu thịt và rau bằng kỹ thuật, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Nguyễn Phạm Trúc Phương
• Trường học: Trung Tâm Nghiên Cứu Và Phát Triển Nông Nghiệp Công Nghệ Cao TP. HCM
• Đề tài: Quy Trình Phát Hiện Nhanh Vi Khuẩn Salmonella SPP. Trong Thịt Và Rau Bằng Kỹ Thuật LAMP
• Loại tài liệu: báo cáo
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• TÓM TẮT ĐỀ TÀI
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• THÔNG TIN ĐỀ TÀI
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về Salmonella spp. thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống Salmonella
• 1.2. Phân loại Salmonella spp. theo loài và theo kiểu huyết thanh
• 1.3. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố
• 1.4. Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm
• 1.5. Các yêu cầu về Salmonella trong thực phẩm
• 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Hóa chất thí nghiệm
• 2.5. Thiết bị thí nghiệm
• 2.6. Nội dung nghiên cứu
• 2.6.1. Nội dung 1: Xây dựng quy trình tăng sinh Salmonella spp.
• 2.6.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của Salmonella spp.
• 2.6.3. Nội dung 3: Đánh giá quy trình phân tích Salmonella trên nền mẫu thịt heo và rau
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nội dung 1: Xây dựng quy trình tăng sinh nhanh Salmonella spp.
• 3.2. Nội dung 2: Xây dựng quy trình tách chiết nhanh DNA của Salmonella spp.
• 3.2.1. Khảo sát khả năng tách chiết DNA vi khuẩn Salmonella spp. bằng Triton X100 hoặc NaOH kết hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95ᴼC trên nền mẫu rau tươi
• 3.2.2. Khảo sát khả năng tách chiết DNA vi khuẩn Salmonella spp. bằng Triton X100 hoặc NaOH kết hợp siêu âm và gia nhiệt ở 95ᴼC trên nền mẫu thịt heo
• 3.2.3. Đánh giá hiệu quả tách chiết DNA vi khuẩn Salmonella spp. bằng các phương pháp trên nền mẫu rau tươi và thịt heo tươi
• 3.3. Nội dung 3: Đánh giá quy trình phân tích Salmonella trên nền mẫu thịt heo tươi và rau tươi
• 3.3.1. Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp. nhiễm trên nền mẫu rau tươi và thịt heo tươi bằng phương pháp LAMP dựa trên gen mục tiêu invA
• 3.3.2. Kiểm tra độ chọn lọc theo phương pháp (Theo ISO 16140: 2016)
• 3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD50) của phương pháp đã xây dựng
• 3.3.4. Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp
• 3.3.5. Chứng thực phương pháp bằng cách so sánh liên phòng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC II
• PHỤ LỤC III
• PHỤ LỤC IV
• PHỤ LỤC V
• PHỤ LỤC VI
• PHỤ LỤC VII
• PHỤ LỤC VIII

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Salmonella spp

Salmonella spp., thuộc họ Enterobacteriaceae, là tác nhân gây bệnh phổ biến trong thực phẩm, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Vi khuẩn gram âm này có khả năng lây nhiễm qua nhiều loại thực phẩm, từ thịt đến rau tươi. Theo Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu, Salmonella là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh truyền nhiễm từ thực phẩm. Ước tính có tới 75% các trường hợp nhiễm Salmonella ở người là do tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, bao gồm thịt gia súc, gia cầm và trứng. Do đó, việc kiểm soát và phát hiện Salmonella trong thực phẩm là vô cùng quan trọng. Đặc biệt, Salmonella enteritidis và Salmonella typhimurium là hai chủng huyết thanh phổ biến nhất gây bệnh ở người. Việc hiểu rõ về đặc điểm sinh học và độc tính của Salmonella là nền tảng cho việc phát triển các phương pháp phát hiện nhanh Salmonella hiệu quả, góp phần bảo vệ an toàn thực phẩm cho cộng đồng.

1.1. Phân Loại và Đặc Điểm Cấu Trúc Kháng Nguyên Salmonella

Salmonella spp. được phân loại dựa trên hệ thống Kaufmann-White, chia thành hai loài chính: Salmonella enterica và Salmonella bongori. Salmonella enterica có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với động vật máu nóng. Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella bao gồm kháng nguyên O (thân), kháng nguyên H (tiêm mao) và kháng nguyên Vi (bề mặt). Các kháng nguyên này đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại và xác định các chủng Salmonella khác nhau. Kháng nguyên O là lipopolysaccharide trên bề mặt tế bào, kháng nguyên H là protein liên quan đến tiêm mao và kháng nguyên Vi là polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, liên quan đến độc tính. Hiểu rõ cấu trúc kháng nguyên giúp thiết kế các phương pháp phát hiện Salmonella chính xác và đặc hiệu.

1.2. Tình Hình Nhiễm Salmonella Trong Thịt và Rau Toàn Cầu

Nhiễm Salmonella trong thực phẩm là một vấn đề toàn cầu, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tỷ lệ nhiễm Salmonella cao trong các sản phẩm thịt và rau ở nhiều quốc gia. Tại Mỹ, CDC ước tính 18% các vụ ngộ độc thực phẩm là do Salmonella. Các loại thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và thủy hải sản là những nguồn lây nhiễm phổ biến. Tại khu vực Đông Nam Á, Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao ở trứng gà, thịt gà và thịt lợn. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã ghi nhận tỷ lệ nhiễm Salmonella đáng kể trong thịt lợn và rau tại các chợ bán lẻ. Việc kiểm soát và giảm thiểu ô nhiễm Salmonella trong chuỗi cung ứng thực phẩm là rất quan trọng để bảo vệ vệ sinh an toàn thực phẩm.

II. Thách Thức Trong Phát Hiện Nhanh Salmonella Giải Pháp Nào

Việc phát hiện nhanh Salmonella trong thực phẩm là một thách thức lớn do yêu cầu về độ chính xác, độ nhạy và thời gian. Các phương pháp truyền thống, như nuôi cấy, thường mất từ 5 đến 7 ngày để cho kết quả. Trong khi đó, sự chậm trễ trong việc phát hiện Salmonella có thể dẫn đến nguy cơ ngộ độc thực phẩm và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Các phương pháp dựa trên PCR và ELISA có độ nhạy cao hơn nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên có trình độ. Vì vậy, cần có một phương pháp xét nghiệm nhanh vi sinh vật, hiệu quả, chi phí thấp và dễ thực hiện để kiểm tra Salmonella trong thịt và kiểm tra Salmonella trong rau. Phương pháp này phải đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao để phát hiện chính xác sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong các mẫu thực phẩm khác nhau.

2.1. Hạn Chế Của Các Phương Pháp Truyền Thống Nuôi Cấy Salmonella PCR

Các phương pháp truyền thống như nuôi cấy Salmonella thường kéo dài và tốn kém. Quy trình nuôi cấy đòi hỏi nhiều bước, từ chuẩn bị môi trường, cấy mẫu, ủ và định danh. Thời gian nuôi cấy Salmonella kéo dài có thể làm chậm trễ việc đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Các phương pháp dựa trên PCR có độ nhạy cao hơn nhưng đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Ngoài ra, PCR có thể bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế trong mẫu thực phẩm, dẫn đến kết quả âm tính giả. Do đó, cần có một phương pháp xét nghiệm nhanh Salmonella đơn giản, hiệu quả và ít bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế.

2.2. Yêu Cầu Đối Với Phương Pháp Phát Hiện Nhanh Salmonella Hiệu Quả

Một phương pháp phát hiện nhanh Salmonella hiệu quả cần đáp ứng các tiêu chí sau: thời gian xét nghiệm Salmonella ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp, dễ thực hiện và có thể ứng dụng tại hiện trường. Phương pháp này cần có khả năng phát hiện vi khuẩn Salmonella trong nhiều loại thực phẩm khác nhau, bao gồm thịt và rau. Ngoài ra, phương pháp cần ít bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế trong mẫu thực phẩm và có thể cho kết quả định tính hoặc định lượng. Một quy trình phát hiện Salmonella đơn giản và nhanh chóng sẽ giúp các nhà sản xuất thực phẩm và cơ quan quản lý ATTP nhanh chóng xác định và ngăn chặn các sản phẩm bị ô nhiễm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

III. Kỹ Thuật LAMP Giải Pháp Phát Hiện Nhanh Salmonella Ưu Việt

Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) là một phương pháp khuếch đại DNA đẳng nhiệt, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. Phương pháp LAMP có thể khuếch đại DNA mục tiêu với hiệu suất cao trong thời gian ngắn (15-60 phút) ở một nhiệt độ duy nhất. Điều này giúp đơn giản hóa quy trình và giảm chi phí so với PCR. Kỹ thuật LAMP sử dụng 4-6 mồi đặc hiệu, giúp tăng độ đặc hiệu và giảm nguy cơ phát hiện sai. Kết quả phát hiện Salmonella bằng phương pháp LAMP có thể được quan sát bằng mắt thường hoặc bằng các thiết bị đơn giản. Vì vậy, LAMP là một giải pháp tiềm năng cho việc phát hiện nhanh Salmonella trong thực phẩm, đặc biệt là tại các địa điểm không có thiết bị hiện đại.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động và Ưu Điểm Vượt Trội của LAMP

Kỹ thuật LAMP dựa trên nguyên tắc khuếch đại DNA đẳng nhiệt sử dụng enzyme DNA polymerase có hoạt tính sao chép ngược. Phương pháp LAMP sử dụng 4-6 mồi đặc hiệu, bao gồm mồi trong (FIP và BIP) và mồi ngoài (F3 và B3). Các mồi này nhận diện 6-8 vùng khác nhau trên gen mục tiêu, giúp tăng độ đặc hiệu. Quá trình khuếch đại diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất (60-65°C), loại bỏ nhu cầu về chu trình nhiệt như PCR. Sản phẩm LAMP là các cấu trúc DNA hình chùy có nhiều vòng lặp, có thể được phát hiện bằng mắt thường thông qua sự thay đổi độ đục hoặc bằng các chất chỉ thị huỳnh quang. Ưu điểm của LAMP bao gồm thời gian phát hiện Salmonella nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp và dễ thực hiện.

3.2. So Sánh Kỹ Thuật LAMP Với Các Phương Pháp Khác PCR Salmonella ELISA

So với các phương pháp khác như PCR Salmonella và ELISA, kỹ thuật LAMP có nhiều ưu điểm. LAMP đơn giản hơn PCR vì không cần chu trình nhiệt. LAMP có độ nhạy tương đương hoặc cao hơn PCR và ELISA. LAMP có chi phí thấp hơn PCR và ELISA vì không cần thiết bị đắt tiền và mồi phức tạp. LAMP ít bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế trong mẫu thực phẩm hơn PCR. Tuy nhiên, LAMP cũng có một số hạn chế, như thiết kế mồi phức tạp và khó định lượng chính xác. Mặc dù vậy, LAMP vẫn là một lựa chọn hấp dẫn cho việc phát hiện nhanh Salmonella trong thực phẩm, đặc biệt là tại các địa điểm không có điều kiện trang thiết bị tốt.

IV. Quy Trình Phát Hiện Nhanh Salmonella Bằng LAMP Hướng Dẫn Chi Tiết

Để xây dựng một quy trình phát hiện nhanh Salmonella hiệu quả bằng kỹ thuật LAMP, cần tối ưu hóa các bước chính sau: tăng sinh mẫu, tách chiết DNA, phản ứng LAMP và phát hiện kết quả. Tăng sinh mẫu giúp tăng số lượng vi khuẩn Salmonella trong mẫu, tăng độ nhạy của phương pháp. Tách chiết DNA loại bỏ các chất ức chế và thu được DNA tinh sạch cho phản ứng LAMP. Phản ứng LAMP khuếch đại DNA mục tiêu một cách nhanh chóng và hiệu quả. Phát hiện kết quả có thể được thực hiện bằng mắt thường hoặc bằng các thiết bị đơn giản. Việc tối ưu hóa từng bước trong quy trình xét nghiệm Salmonella là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả.

4.1. Tối Ưu Hóa Tăng Sinh Mẫu Thịt Rau Để Tăng Độ Nhạy

Tăng sinh mẫu là một bước quan trọng trong quy trình chuẩn phát hiện Salmonella, giúp tăng số lượng vi khuẩn Salmonella trong mẫu, đặc biệt là khi số lượng ban đầu thấp. Môi trường tăng sinh thường được sử dụng là Buffered Peptone Water (BPW) và Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth (RVS). Thời gian tăng sinh thường từ 10-24 giờ. Việc lựa chọn môi trường và thời gian tăng sinh tối ưu phụ thuộc vào loại thực phẩm (thịt, rau) và điều kiện thí nghiệm. Nghiên cứu cho thấy thời gian tăng sinh 10 ± 2 giờ trên nền mẫu rau tươi và thịt tươi là phù hợp để đạt độ nhạy cao.

4.2. Phương Pháp Tách Chiết DNA Nhanh và Hiệu Quả Cho LAMP Salmonella

Tách chiết DNA là bước loại bỏ các chất ức chế và thu được DNA tinh sạch cho phản ứng LAMP Salmonella. Các phương pháp tách chiết DNA truyền thống thường tốn thời gian và sử dụng các hóa chất độc hại. Các phương pháp tách chiết nhanh, như sử dụng đệm NaOH kết hợp với gia nhiệt và siêu âm, có thể giúp rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu. Nghiên cứu cho thấy sử dụng đệm NaOH 50 mM (rau) và NaOH 100 mM (thịt), gia nhiệt 5 phút tại 95°C, siêu âm 30 giây, ly tâm 10.000 g trong 2 phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP là một phương pháp hiệu quả.

4.3. Thiết Kế Mồi và Điều Kiện Phản Ứng LAMP Tối Ưu cho Salmonella

Thiết kế mồi là một yếu tố quan trọng quyết định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP. Mồi LAMP cần được thiết kế để nhận diện 6-8 vùng khác nhau trên gen mục tiêu, như gen invA của Salmonella. Điều kiện phản ứng LAMP, bao gồm nồng độ mồi, nồng độ MgSO4, nồng độ dNTPs và nhiệt độ ủ, cần được tối ưu hóa để đạt hiệu suất khuếch đại cao nhất. Nhiệt độ ủ thường được sử dụng là 60-65°C. Việc lựa chọn enzyme DNA polymerase phù hợp cũng rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả của phản ứng LAMP.

V. Ứng Dụng Thực Tế và Đánh Giá Kỹ Thuật LAMP Salmonella

Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình phân tích trực tiếp Salmonella từ thực phẩm dựa trên phản ứng LAMP, bao gồm các bước tăng sinh, tách chiết DNA nhanh và phản ứng LAMP. Kết quả cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu cao (94%), độ chính xác cao (94%) và độ nhạy cao (100%). Giới hạn phát hiện (LOD50) là 3 CFU/25g. Hiệu quả phân tích Salmonella bằng phương pháp mới được xây dựng tương đương với phương pháp real-time PCR nhưng có thời gian phân tích ngắn hơn (12 giờ). Kỹ thuật LAMP Salmonella có thể được ứng dụng rộng rãi trong kiểm tra Salmonella trong thịt và kiểm tra Salmonella trong rau tại các cơ sở sản xuất thực phẩm, phòng thí nghiệm và cơ quan quản lý.

5.1. Đánh Giá Độ Nhạy Độ Đặc Hiệu và Giới Hạn Phát Hiện LOD của LAMP

Độ nhạy, độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện (LOD) là các thông số quan trọng để đánh giá hiệu quả của một phương pháp phát hiện Salmonella. Độ nhạy cho biết khả năng của phương pháp trong việc phát hiện Salmonella khi số lượng vi khuẩn thấp. Độ đặc hiệu cho biết khả năng của phương pháp trong việc phân biệt Salmonella với các vi khuẩn khác. LOD cho biết số lượng vi khuẩn tối thiểu mà phương pháp có thể phát hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật LAMP Salmonella có độ nhạy cao (100%), độ đặc hiệu cao (94%) và LOD thấp (3 CFU/25g), cho thấy phương pháp có thể phát hiện Salmonella một cách chính xác và hiệu quả.

5.2. So Sánh Hiệu Quả LAMP Salmonella Với Real time PCR Nghiên Cứu Thực Tế

Để đánh giá hiệu quả của kỹ thuật LAMP Salmonella, nghiên cứu đã so sánh với phương pháp real-time PCR (theo quy trình ISO 16140:2003). Kết quả cho thấy LAMP Salmonella có hiệu quả tương đương với real-time PCR về độ nhạy và độ đặc hiệu. Tuy nhiên, LAMP có thời gian phân tích ngắn hơn (12 giờ so với 24-48 giờ của real-time PCR). Điều này cho thấy LAMP là một giải pháp phát hiện nhanh Salmonella hiệu quả và tiết kiệm thời gian.

VI. Kết Luận và Triển Vọng của Kỹ Thuật LAMP Trong An Toàn Thực Phẩm

Kỹ thuật LAMP là một phương pháp phát hiện nhanh Salmonella tiềm năng với nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. LAMP có thời gian phân tích ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp và dễ thực hiện. LAMP có thể được ứng dụng rộng rãi trong kiểm tra Salmonella trong thịt và kiểm tra Salmonella trong rau tại các cơ sở sản xuất thực phẩm, phòng thí nghiệm và cơ quan quản lý. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển kỹ thuật LAMP sẽ giúp cải thiện an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Trong tương lai, có thể phát triển các kit xét nghiệm LAMP Salmonella đơn giản và dễ sử dụng để ứng dụng tại hiện trường.

6.1. Ưu Điểm Kỹ Thuật LAMP Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi Trong ATTP

Ưu điểm kỹ thuật LAMP giúp đơn giản hóa quy trình phát hiện vi sinh vật và giảm chi phí. Giúp đẩy nhanh quá trình kiểm nghiệm mầm bệnh trong thực phẩm và ngăn chặn kịp thời các nguy cơ tiềm ẩn do ngộ độc thực phẩm. Ngoài ra còn giúp giảm thiểu chi phí cho việc xây dựng phòng thí nghiệm phức tạp.

6.2. Hướng Phát Triển và Nghiên Cứu Tiếp Theo Về LAMP Salmonella

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển kỹ thuật LAMP Salmonella để cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu và tính ổn định. Cần phát triển các kit xét nghiệm LAMP Salmonella đơn giản và dễ sử dụng để ứng dụng tại hiện trường. Cần nghiên cứu ứng dụng LAMP để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh khác trong thực phẩm. Cần đánh giá hiệu quả kinh tế của việc ứng dụng LAMP trong kiểm soát an toàn thực phẩm. Cần đào tạo nguồn nhân lực có trình độ để triển khai kỹ thuật LAMP một cách hiệu quả.

Nội dung chính

Tóm tắt nghiên cứu (200-250 từ)

Salmonella spp. là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm và bùng phát dịch bệnh đường ruột trên toàn cầu, đặc biệt qua các thực phẩm tươi sống như thịt heo và rau xanh. Nghiên cứu do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM thực hiện nhằm giải quyết bài toán cấp thiết: Làm thế nào để xây dựng một quy trình phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu vi khuẩn Salmonella spp. trên nền mẫu thịt và rau mà không cần phụ thuộc vào các trang thiết bị luân nhiệt đắt tiền hay quy trình nuôi cấy kéo dài?

Bằng việc tiếp cận kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng (LAMP - Loop-Mediated Isothermal Amplification) nhắm vào gen xâm nhiễm đặc trưng invA, nghiên cứu đã thiết lập chu trình tối ưu bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường phối hợp (150 ml BPW : 75 ml RVS) trong 10 ± 2 giờ; tách chiết nhanh DNA bằng dung dịch kiềm NaOH kết hợp sốc nhiệt và siêu âm; phản ứng nhân gen đẳng nhiệt ở 63°C trong 30–60 phút và đọc kết quả trực quan qua chất chỉ thị Hydroxy Naphthol Blue (HNB).

Kết quả kiểm chứng theo chuẩn ISO 16140 cho thấy phương pháp đạt giới hạn phát hiện $\text{LOD}_{50} = 3\text{ CFU/25g}$, độ nhạy chẩn đoán (SE) đạt 100%, độ đặc hiệu (SP) và độ chính xác (AC) đạt 94%, hoàn toàn không có âm tính giả. Toàn bộ quy trình chỉ mất khoảng 12 giờ, mang lại giải pháp đột phá cho công tác kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm nhanh tại hiện trường và các phòng kiểm nghiệm cơ sở.

---

Bối cảnh và tầm quan trọng (300-350 từ)

Ô nhiễm vi sinh vật trong chuỗi cung ứng thực phẩm tươi sống là mối đe dọa thường trực đối với sức khỏe cộng đồng và tổn thất kinh tế nông nghiệp. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA), Salmonella spp. là tác nhân truyền bệnh qua thực phẩm nguy hiểm, với hơn 75% trường hợp mắc bệnh bắt nguồn từ thịt gia súc, gia cầm, trứng và rau quả tươi bị nhiễm chéo từ phân bón, nguồn nước tưới hoặc quá trình giết mổ. Tại Việt Nam, nhiều khảo sát dịch tễ ghi nhận tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thịt heo tại các chợ truyền thống dao động từ 6% đến 47,5%, trong khi các quy định hiện hành (Thông tư 01/2000/TT-BYT, Tiêu chuẩn Việt Nam và tiêu chuẩn quốc tế) đều áp dụng ngưỡng nghiêm ngặt: tuyệt đối không được có Salmonella trong 25g thực phẩm.

    [Phương pháp truyền thống: ISO 6579-1:2017]
    
    [Phương pháp Sinh học phân tử: PCR / Real-time PCR]
    
    [Phương pháp Đột phá: Kỹ thuật LAMP (Nghiên cứu này)]

Khoảng trống nghiên cứu lớn nhất hiện nay nằm ở sự bất cập của các phương pháp xét nghiệm:

• Phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống (ISO 6579-1:2017): Mất từ 5 đến 7 ngày để hoàn tất các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập đĩa thạch và thử nghiệm sinh hóa/huyết thanh. Khoảng thời gian này quá dài so với hạn bảo quản của rau và thịt tươi.
• Kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Real-time PCR): Rút ngắn thời gian xuống 24–48 giờ nhưng đòi hỏi máy luân nhiệt đắt tiền, phòng sạch đạt chuẩn, hóa chất bảo quản nghiêm ngặt và dễ bị ức chế bởi các hợp chất hữu cơ có trong nền mẫu thực phẩm (polyphenol, collagen, chất béo).

Vì vậy, việc ứng dụng kỹ thuật LAMP – phương pháp nhân bản DNA đẳng nhiệt ở một nhiệt độ cố định với tốc độ khuếch đại gấp $10^9 - 10^{10}$ lần trong vòng chưa đầy 60 phút – mang tính cấp thiết và đột phá. Kỹ thuật này không chỉ loại bỏ nhu cầu về máy biến nhiệt đắt đỏ mà còn cho phép nhận biết kết quả trực tiếp bằng mắt thường, mở ra tiềm năng thương mại hóa và ứng dụng rộng rãi trong giám sát chất lượng chuỗi cung ứng thực phẩm nông nghiệp.

---

Methodology và approach (350-400 từ)

Nghiên cứu được thiết kế thực nghiệm đa biến, chia thành 3 nội dung trọng tâm nhằm hoàn thiện một quy trình khép kín từ khâu xử lý mẫu thô đến bước đọc kết quả:

1. Thiết kế và quy trình thực nghiệm

• Đối tượng nghiên cứu: 11 chủng Salmonella chuẩn (S. enteritidis ATCC 13076, S. Typhimurium, S. Choleraesuis, S. Paratyphi B,...) và các vi khuẩn đối chứng âm gây nhiễm chéo (Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus). Nền mẫu thực nghiệm là 25g thịt heo tươi và rau xà lách tươi được gây nhiễm chủ động ở các nồng độ vi sinh xác định.
• Tối ưu hóa môi trường tăng sinh: Khảo sát 5 công thức môi trường gồm môi trường cơ bản (BPW), môi trường chọn lọc Rappaport-Vassiliadis (RVS) và các tỷ lệ phối trộn (BPW:RVS tỷ lệ 1:1, 1:2, 2:1) tại các mốc thời gian 6, 8, 10, 12 và 24 giờ.
• Cải tiến phương pháp tách chiết DNA: Nghiên cứu so sánh 3 phương pháp tách chiết: phương pháp ly trích nhiệt truyền thống, phương pháp CTAB/dung môi hữu cơ chuẩn (Ausubel et al., 2001) và phương pháp sốc nhiệt kết hợp hóa chất/siêu âm. Tối ưu nồng độ dung dịch ly giải ($\text{Triton X-100 } 0{,}6 - 2{,}4%$ hoặc $\text{NaOH } 10 - 200\text{ mM}$), thời gian ủ nhiệt 95°C (5–15 phút) và thời gian siêu âm (30 giây – 4 phút).

2. Kỹ thuật phân tích và chỉ thị

• Hệ phản ứng LAMP: Sử dụng bộ 6 mồi đặc hiệu thế hệ mới nhắm vào gen xâm nhiễm invA (F3, B3, FIP, BIP, LoopF, LoopB). Thành phần phản ứng gồm $1\times\text{ Isothermal Buffer II}$, $6\text{ mM MgSO}_4$, $1{,}4\text{ mM dNTPs}$, $320\text{ U/ml Bst 3.0 DNA Polymerase}$, $0{,}8\text{ M Betaine}$ và mồi chuyên biệt. Phản ứng diễn ra đẳng nhiệt ở 63°C trong 30–60 phút, kết thúc ở 80°C trong 10 phút.
• Hệ chỉ thị màu: Bổ sung muối Hydroxy Naphthol Blue (HNB) nồng độ $120\text{ }\mu\text{M}$ trực tiếp vào ống phản ứng trước khi chạy. Mẫu dương tính chuyển từ màu tím đậm sang màu xanh da trời (do sự sụt giảm ion $\text{Mg}^{2+}$ tự do tạo kết tủa pyrophosphate); mẫu âm tính giữ nguyên màu tím.
• Đối chứng và thẩm định phương pháp: Đối chiếu song song với hệ kit thương mại Real-time PCR (Accupid Salmonella spp.). Đánh giá độ chọn lọc, độ đặc hiệu, độ nhạy và tính toán giới hạn phát hiện $\text{LOD}_{50}$ theo mô hình toán học Spearman-Karber ở độ tin cậy 95% theo hướng dẫn ISO 16140:2016.

---

Phát hiện chính (400-450 từ)

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận nhiều kết quả khoa học và thông số kỹ thuật then chốt, giải quyết triệt để các nút thắt trong chẩn đoán nhanh vi sinh vật:

1. Thiết lập tỷ lệ môi trường tăng sinh rút ngắn (10 ± 2 giờ)

Nghiên cứu chứng minh môi trường phối hợp Môi trường 5 (150 ml BPW : 75 ml RVS theo tỷ lệ 2:1) ở nhiệt độ 37°C là tối ưu nhất. Môi trường đệm BPW cung cấp nguồn dinh dưỡng hữu cơ giàu vitamin để phục hồi các tế bào Salmonella bị suy yếu hoặc tổn thương do nhiệt độ bảo quản, trong khi thành phần chọn lọc từ RVS ức chế hiệu quả hệ vi sinh vật bản địa trên thịt và rau.

• Thời gian tăng sinh đạt ngưỡng phát hiện tin cậy $3/3$ lần lặp lại chỉ cần 10 ± 2 giờ (rút ngắn gần $60%$ thời gian so với quy trình 24 giờ của các phương pháp tiêu chuẩn).

2. Đột phá trong kỹ thuật ly trích nhanh DNA bằng kiềm nóng kết hợp siêu âm

Thay vì mất từ 1 đến 2 giờ với các bộ kit cột silica đắt tiền hay sử dụng dung môi độc hại (Phenol:Chloroform), nghiên cứu đã tìm ra công thức ly giải tế bào siêu tốc:

• Đối với nền mẫu rau tươi: Đệm $\text{NaOH } 50\text{ mM}$, gia nhiệt 95°C trong 5 phút, siêu âm 30 giây, ly tâm $10.000\text{ g}$ trong 2 phút.
• Đối với nền mẫu thịt tươi: Đệm $\text{NaOH } 100\text{ mM}$, gia nhiệt 95°C trong 5 phút, siêu âm 30 giây, ly tâm $10.000\text{ g}$ trong 2 phút.
• Toàn bộ quy trình tách chiết hoàn tất trong dưới 10 phút, thu được dịch DNA tinh sạch đáp ứng hoàn hảo cho phản ứng enzyme Bst 3.0 mà không làm ức chế phản ứng khuếch đại.

+-------------------------------------------------------------------------+
|                  HIỆU NĂNG PHƯƠNG PHÁP LAMP invA-2                       |
+------------------------------------+------------------------------------+
| Thông số kỹ thuật                  | Giá trị thực nghiệm                 |
+------------------------------------+------------------------------------+
| Độ nhạy chẩn đoán (SE)             | 100% (Không âm tính giả)           |
| Độ đặc hiệu chẩn đoán (SP)         | 94%                                |
| Độ chính xác tổng thể (AC)         | 94%                                |
| Giới hạn phát hiện (LOD50)         | 3 CFU / 25g mẫu                    |
| Độ nhạy DNA tinh sạch              | 5 pg / phản ứng                     |
| Độ nhạy trên chủng thuần           | 4,1 x 10^1 CFU / mL                |
| Tổng thời gian phân tích           | ~ 12 giờ                           |
+------------------------------------+------------------------------------+

3. Độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội ở ngưỡng nhiễm cực thấp

• Giới hạn phát hiện: Giá trị $\text{LOD}_{50}$ tính theo công thức Spearman-Karber đạt 3 CFU/25g, đáp ứng hoàn toàn yêu cầu không cho phép tồn tại vi khuẩn trong 25g mẫu thực phẩm của Bộ Y tế.
• Độ chọn lọc: Thử nghiệm trên 11 chủng Salmonella khác nhau đều cho kết quả dương tính $100%$, trong khi các chủng vi khuẩn không phải Salmonella (E. coli, L. monocytogenes, S. aureus) đều âm tính, khẳng định độ đặc hiệu tuyệt đối của bộ mồi invA-2.
• So sánh liên phòng: Kết quả phân tích đối chứng liên phòng thí nghiệm độc lập cho thấy tính tương thích và tương đồng $100%$ so với phương pháp Real-time PCR chuẩn hóa ISO 16140.

---

Đóng góp khoa học (250-300 từ)

Nghiên cứu mang lại những giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn to lớn trong ngành công nghệ sinh học và kiểm nghiệm thực phẩm:

1. Đóng góp về mặt lý thuyết và phương pháp luận

• Chứng minh tính ưu việt của hệ mồi 6 vùng nhận diện trên gen invA: Cung cấp thêm bằng chứng khoa học vững chắc về tính bảo thủ cao của gen invA ở hầu hết các serotype Salmonella, đảm bảo phản ứng LAMP không xảy ra phản ứng chéo với các vi khuẩn họ Enterobacteriaceae khác.
• Đổi mới quy trình tiền xử lý mẫu sinh học: Xây dựng thành công cơ chế ly giải màng tế bào bằng kiềm nồng độ thấp ($\text{NaOH } 50 - 100\text{ mM}$) hỗ trợ bởi sóng siêu âm, mở ra hướng đi mới trong việc tối giản hóa khâu thu nhận acid nucleic cho các phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt.

                         GIÁ TRỊ CHUYỂN GIAO THỰC TIỄN
[Khả năng ứng dụng tại chỗ]                                   [Hiệu quả kinh tế]
- Chỉ cần bể ủ nhiệt 63°C                                     - Giảm 70% chi phí hóa chất
- Đọc kết quả trực tiếp bằng mắt thường                       - Rút ngắn thời gian lưu kho
- Không cần máy Real-time PCR đắt tiền                        - Kiểm soát chất lượng trong 12h

2. Ứng dụng thực tiễn và định hướng chính sách

• Hạ thấp rào cản kỹ thuật: Quy trình không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền (chỉ cần một bể ủ nhiệt khô hoặc máy ủ nhiệt đơn giản ở 63°C), giúp các phòng xét nghiệm tuyến huyện, trung tâm kiểm nghiệm cơ sở hoặc các cơ sở giết mổ dễ dàng làm chủ công nghệ.
• Hỗ trợ hoạch định chính sách an toàn thực phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học đáng tin cậy để các nhà quản lý xây dựng quy chuẩn kỹ thuật chẩn đoán nhanh trong ngày đối với nông sản, thực phẩm tươi sống lưu thông trên thị trường.

---

Đối tượng quan tâm (200-250 từ)

Kết quả nghiên cứu mang lại lợi ích thiết thực và giải pháp kỹ thuật trực tiếp cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nhà nghiên cứu học thuật & Giảng viên: Cung cấp tài liệu tham khảo chuyên sâu về động học nhân gen đẳng nhiệt, thiết kế primer đa mồi và kỹ thuật xử lý mẫu phức tạp trong vi sinh thực phẩm.
• Chuyên viên QA/QC và Giám đốc kỹ thuật tại các doanh nghiệp chế biến:
  • Các trang trại nông nghiệp công nghệ cao, hợp tác xã sản xuất rau an toàn đạt chuẩn VietGAP/GlobalGAP.
  • Các nhà máy giết mổ, chế biến thịt heo, gia cầm, chuỗi siêu thị và bán lẻ thực phẩm tươi sống.
  • Lợi ích: Kiểm soát an toàn vi sinh lô hàng ngay trong ngày, hạn chế tối đa nguy cơ thu hồi sản phẩm hoặc lưu kho chờ đợi gây giảm chất lượng nông sản.
• Cơ quan kiểm định và thanh tra an toàn thực phẩm: Các Chi cục An toàn Vệ sinh Thực phẩm, Chi cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm Sản và Thủy Sản, Trung tâm Y tế Dự phòng... có thêm công cụ điều tra dịch tễ nhanh chóng, chính xác khi xảy ra sự cố ngộ độc thực phẩm tập thể.

---

FAQ (250-300 từ)

1. Phát hiện quan trọng nhất của nghiên cứu này là gì?

Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình phát hiện Salmonella spp. với độ nhạy chẩn đoán 100%, giới hạn phát hiện $\text{LOD}_{50} = 3\text{ CFU/25g}$, và rút ngắn toàn bộ thời gian xét nghiệm xuống chỉ còn 12 giờ (nhanh hơn 10 lần so với phương pháp nuôi cấy truyền thống 5–7 ngày).

2. Kỹ thuật tách chiết DNA trong nghiên cứu có gì đặc biệt so với phương pháp thông thường?

Quy trình không dùng dung môi độc hại (Phenol/Chloroform) hay kit thương mại đắt tiền, mà sử dụng dung dịch NaOH ($50 - 100\text{ mM}$) kết hợp gia nhiệt 95°C trong 5 phút và siêu âm 30 giây. Phương pháp này chỉ mất dưới 10 phút, chi phí cực thấp nhưng vẫn đảm bảo dịch DNA khuôn đạt chuẩn cho phản ứng LAMP.

3. Kết quả của quy trình có thể khái quát hóa (generalize) cho các loại thực phẩm khác không?

Có. Quy trình hoàn toàn có thể mở rộng trên các nền mẫu thực phẩm tươi sống khác như thịt gia cầm, thịt bò, thủy hải sản, quả tươi hoặc trứng. Tuy nhiên, cần khảo sát và hiệu chỉnh nồng độ đệm NaOH phù hợp với hàm lượng lipid/protein đặc thù của từng loại nền mẫu.

4. Hướng phát triển tiếp theo (Next steps) của nghiên cứu là gì?

Tích hợp quy trình thành dạng kit đông khô sẵn sàng sử dụng (ready-to-use master mix) để kéo dài thời hạn bảo quản ở nhiệt độ phòng, đồng thời phát triển hệ phản ứng Multiplex LAMP để phát hiện đồng thời nhiều vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes) trong cùng một phản ứng.

5. Khả năng phát hiện kết quả bằng mắt thường qua chất chỉ thị HNB có độ tin cậy ra sao?

Rất cao. Chất chỉ thị Hydroxy Naphthol Blue (HNB) tạo sự tương phản màu sắc rõ rệt từ tím đậm sang xanh da trời khi có phản ứng khuếch đại. Do HNB được bổ sung ngay từ đầu trước khi đóng nắp phản ứng, kỹ thuật này loại bỏ hoàn toàn nguy cơ mở nắp gây ô nhiễm chéo aerosol (sản phẩm khuếch đại bay lơ lửng trong không khí).

---

Kết luận (150 từ)

Nhiệm vụ khoa học công nghệ "Xây dựng quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella spp. trên nền mẫu thịt và rau bằng kỹ thuật LAMP" do ThS. Nguyễn Phạm Trúc Phương chủ nhiệm đã giải quyết thành công bài toán tối ưu hóa thời gian và chi phí trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm. Quy trình tích hợp từ khâu tăng sinh rút ngắn (10 giờ), tách chiết DNA siêu tốc bằng kiềm nóng (10 phút) đến phản ứng đẳng nhiệt LAMP nhắm vào gen invA (60 phút) đạt độ tin cậy tương đương Real-time PCR tiêu chuẩn ISO 16140.

Đây là công nghệ có tính ứng dụng thực tiễn cao, sẵn sàng chuyển giao cho các phòng kiểm nghiệm và doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao nhằm nâng cao năng lực giám sát an toàn chuỗi cung ứng thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về Salmonella spp. thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Salmonelleae và giống Salmonella.

là vi khuẩn hình gậy, mập, ngắn, trực khuẩn gram âm, hai đầu hơi tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 μm, sống kị khí tùy nghi, không hình thành giáp mô và nha bào, có khả năng di động nhờ lông mao có khoảng 7 đến 12 lông mao chung quanh thân, trừ S. pullorum gây bệnh cho gia cầm. dễ dàng nuôi cấy ở 37oC trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển các khuẩn lạc có đường kính 2 – 4 mm, trơn, sáng và đồng nhất (Brenner và ctv, 2000). Những Salmonella thường gây ngộ độc thường gặp là S.

Do đó, việc chuẩn đoán chính xác các loại trực khuẩn này có một ý nghĩa rất quan trọng về mặt bảo vệ sức khỏe, vệ sinh công cộng, dự phòng bệnh truyền nhiễm (Nguyễn Phùng Tiến và ctv, 2003). * Phân loại Salmonella spp. theo loài và theo kiểu huyết thanh Theo hệ thống phân loại Kaufmann-White, dựa vào đặc điểm kiểu hình cũng như phân tích bằng lai DNA-DNA, Salmonella được chia thành 2 loài: Salmonella enteritica và Salmonella bongori (Brenner và ctv, 2000). bongori gồm tất cả các kiểu huyết thanh (serotype) của loài phụ số V và Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài là S.

Salmonella có 2579 chủng huyết thanh được xác định đến năm 2010 (Guibourdenche và ctv, 2010). enterica, có tính gây bệnh cao đối với động vật máu nóng, có 1531 serotypes. salamae được tìm thấy trong 505 serotypes; S. Trang 5 * Cấu trúc kháng nguyên và độc tố Salmonella có 3 loại kháng nguyên là kháng nguyên O (kháng nguyên thân – somatic), kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao – flagella) và kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt – capsule) (John, 2004; Silva, 2006; Agasan, 2002; Jay, 1992).1 Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella (Nguồn: Diffchamb, 1997) Kháng nguyên O: gồm chuỗi lipopolysaccharide-protein trên bề mặt tế bào.

Kháng nguyên O là polymer của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 – 6 nhóm đường tùy từng nhóm kháng nguyên O. Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường khác nhau, hay khác nhau do bản chất liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần (Hu & Kopecko 2003). Kháng nguyên H: có bản chất là protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H gắn liền với roi của vi khuẩn nên kháng nguyên này chỉ hiện diện trên các chủng có tiêm mao.

Kháng nguyên tiêm mao H có thành phần khác nhau tùy vào kiểu huyết thanh (Jay, 1992). Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh (McQuiston và ctv, 2008). Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ. Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ, cồn và HCl.

Kháng nguyên này chỉ được xác định trên 3 kiểu huyết thanh: S. Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm Thực phẩm bị nhiễm bệnh là nguồn gây bệnh dễ dàng và nhanh nhất do vi khuẩn có thể phát triển nhanh trong thực phẩm, nhất là thực phẩm chưa nấu chín, rau tươi, quả, rau salát, bánh bao, bánh rán, sữa chưa thanh trùng, nhuyễn thể, tôm, cua sống trong khu vực có nguồn nước thải ô nhiễm cao do nguồn phân người và động vật. Các loại thực phẩm có nguy cơ bị nhiễm Salmonella cao là thịt gia cầm, sản phẩm thịt, trứng và các sản phẩm từ trứng, thủy hải sản. Nguồn gây nhiễm các loại thực phẩm này thường là phân người và động vật, được nhiễm gián tiếp hay trực tiếp (Trần Linh Thước, 2002; Nguyễn Phùng Tiến và ctv, 2003).

Năm 2006, theo điều tra của Trung tâm Phòng chống dịch bệnh của Mỹ (CDC) về các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm đã công bố 18% số vụ ngộ độc thực phẩm (trong tổng số 624 vụ) có nguyên nhân bắt nguồn từ Salmonella, phổ biến nhất là S. Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao được phát hiện ở rất nhiều loài như lợn, trâu bò, gia cầm và con người (Angkititrakul, 2005). Hơn nữa, báo cáo năm 2010 của Trung tâm Phòng chống dịch bệnh của Mỹ (CDC) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Salmonella ở Mỹ trong năm 2010 cao hơn 10% (95% Confidence Interval (CI) 4- 17%) so với giai đoạn 2006-2008. Năm 2017, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật của Mỹ (CDC) cho biết có ít nhất 611 người tại nước này bị nhiễm bệnh và một người tử vong trong 8 đợt bùng phát dịch bệnh do vi khuẩn đường ruột Salmonella gây ra liên quan tới gia cầm sống.

Ở Nhật Bản, tỷ lệ nhiễm S. enterica trong thịt lợn là 2,8% (Kanako và ctv, 2009); tỷ lệ nhiễm Salmonella tại Ailen là 2,9% (Prendergast và ctv, 2009). Tại Hàn Quốc, tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. trong thịt gà và thịt lợn lần lượt là 18,8% và 30,3% (Kim và ctv, 2014).

Tại khu vực Đông Nam Á, Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao ở trứng gà, thịt gà và thịt lợn bán tại các chợ bán lẻ (Padungtod, 2006). Tại Thái Lan, tỷ lệ nhiễm Salmonella trên lợn ở các trang trại, lò mổ và thịt lợn trên thị trường lần lượt là 6%, 28% và 29% (Padungtod, 2005). Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm Salmonella của thịt lợn bán lẻ tại các chợ ở Huế khoảng 3,8% (Koichi và ctv, 2009); theo Van và ctv (2007), tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh là 6%. Theo nghiên cứu của Le Bas và ctv, nhiễm Salmonella trên thân thịt tại lò mổ, nguồn nước ở một số lò mổ tại Hà Nội lần lượt là 5,1%, 6,5%.

Nghiên cứu của Trần Thị Xuân Mai và ctv (2011) cho biết trong tổng số 260 mẫu thực phẩm Trang 7 được thu thập từ các chợ khác nhau trong địa bàn thành phố Cần Thơ để kiểm tra về sự hiện diện của Salmonella. Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp. là nem chua (20%), thịt heo (47,5%), thịt bò (30%), thịt gà (46,7%), trứng gà (lòng trắng và lòng đỏ) (10%), vỏ trứng gà (40%), chả lụa (10%), ba khía (0%), sò huyết (40%), bì heo (20%). Trong đó, 2,5% ở thịt heo; 2,5% ở thịt bò; 1,6% ở thịt gà; 10% ở vỏ trứng gà và 5% ở sò huyết phát hiện nhiễm Salmonella enteri.

Theo Trương Hà Thái và ctv (2012) khi nghiên cứu các mẫu thịt tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam thấy 39,6% mẫu thịt lợn và 42,9% mẫu thịt gà phân lập được vi khuẩn Salmonella.  Các yêu cầu về Salmonella trong thực phẩm Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra nghiêm ngặt bởi các cơ quan chức năng.

Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 3. Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào. Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella.

Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tư 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế Nhóm thực phẩm Phương pháp kiểm tra Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm TCVN 5153:90 muối, sấy khô, hun khói Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường TCVN 6402:98 hoặc chất ngọt khác Trang 8 Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để TCVN 6402:98 lên men hoặc acid hóa Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế TCVN 5153:90 phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó 1. Các phương pháp phát hiện Salmonella spp. Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới vẫn đang áp dụng phương pháp nuôi cấy để phát hiện Salmonella trong thực phẩm (ISO 6579-1: 2017). Đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi.

Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình,… Do đó, thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 5– 7 ngày. Ngoài phương pháp truyền thống để phân lập và định danh Salmonella, còn có một số phương pháp kiểm tra nhanh Salmonella có thể thực hiện việc kiểm tra trên nhiều mẫu trong thời gian ngắn. Phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, real-time, nested PCR dựa vào việc xác định sự hiện diện của đoạn DNA đích. Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau: tiền tăng sinh trong môi trường BPW, xử lý tế bào để thu nhận khuôn DNA, thực hiện phản ứng PCR, phân tích kết quả.

Ưu điểm của các phương pháp sinh học phân tử: thời gian cho kết quả nhanh; có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy; hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ lưu trữ hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống; ít tốn kém công lao động. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm (Trần Linh Thước, 2002) với tổng thời gian thực hiện để có kết quả là 2 ngày. Hiện nay trong công tác kiểm nghiệm khách hàng yêu cầu có kết quả nhanh nhưng phải chính xác, đặc hiệu. Phương pháp LAMP đã đáp ứng được điều đó vì quy trình thực hiện LAMP nhanh nên thời gian để có kết quả phân tích dưới 2 ngày, có thể được sử dụng để phát hiện Salmonella spp.

ngay tại hiện trường. Do vậy phương pháp LAMP có thể là một phương pháp đặc biệt hữu ích để chẩn đoán Salmonella spp. có trong thực phẩm.