Đặt vấn đề Hiện nay, dịch bệnh gây hại trên cây trồng do tác nhân vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây thất thu năng suất và thiệt hại về kinh tế. Bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra là van đề nan giải trong ngành trồng trot ở nước ta hiện nay cũng như trên toàn thé giới. Vi khuẩn Erwinia sp.
gây hại trên nhiều đối tượng cây trồng quan trọng như các loại cây họ cải, cây hoa, cây cảnh và một số loài khác. Trong đó, rau cải là một loại thực phẩm phổ biến có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Cây rau chứa nhiều vitamin và nhiều chất khoáng quan trọng đối với sức khỏe con người. Bên cạnh nhu cầu về thực phẩm của con người thì nhu cầu thưởng thức và tận hưởng cuộc sông lại càng được nâng cao.
Con người chú trọng hơn đến vẻ đẹp, tính nghệ thuật của cuộc sống, đó chính là nghệ thuật thưởng thức hoa. Cây hoa hồng là một trong những loại cây hoa được yêu thích nhất hiện nay và cũng mang lại giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, đối với tình hình biến đổi khí hậu như hiện nay, các cây trồng dé bị nhiễm các loại bệnh hại khác nhau. Trong đó bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia carotovora được xem là bệnh làm giảm đáng kê năng suất, chất lượng cây trồng.
Bệnh có thé gây hại trong giai đoạn đồng ruộng và cũng như trong quá trình bảo quản, vận chuyền và bày bán. Bệnh thối nhũn gây thiệt hại ước tính mỗi năm khoảng 15 - 30% giá tri cây trồng (FAOSTAT data, 2012). Vi khuân gây bệnh phát triển mạnh va lây lan nhanh chóng trong mùa mưa. Bệnh thối nhữn do vi khuan Erwinia carotovora có khả năng lây lan rất cao, khó phát hiện triệu chứng trong giai đoạn sớm, vì vậy cần có một phương pháp cụ thé dé có thé xác định nhanh, chính xác, phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm dé có thé giảm thiệt hại về năng suất, chất lượng và kinh tế cho người trồng trọt.
Hiện nay, phương pháp PCR là một trong những phương pháp tối ưu với độ chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao có thé giải đáp vấn đề nan giải cho các nhà vườn. Chính vì lý do này nên đề tài “Xây dựng quy trình PCR cho việc phát hiện và định danh các loài vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh trên cây hoa hồng và rau cải” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu Đề tài thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn Erwinia sp.
và xây dựng thành công quy trình PCR phát hiện vi khuân Erwinia carotovora gây bệnh cây hoa hồng và rau cải. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Thu mẫu và phân lập vi khuẩn Erwinia sp. từ các mẫu cây hoa hồng, rau cải tại khu vực Thủ Đức, Quận 9 (TPHCM). Nội dung 2: Thiết kế 2 cặp primer chuyên biệt cho chi vi khuân Erwinia và loài vi khuan Erwinia carotovora bằng phần mềm tin sinh học ứng dụng.
Nội dung 3: Xây dựng quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora và sử dụng quy trình PCR dé phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora cho các mau vi khuân đã phân lập. TÔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về vi khuẩn Erwinia sp. Phân loại Theo Winslow và ctv (1920), Erwinia sp.
có vi trí trong khóa phân loại như sau: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Grammaproteobacteria Bộ (Order): Enterobacteriales Ho (Family): Enterobacteriaceae Chi (Genus): Erwinia Erwinia sp. được chia thành 2 nhóm: nhóm vi khuẩn gây thối nhữũn hay “carotovora”, và nhóm vi khuẩn gây bệnh héo hoặc tàn rụi hay “amylovora”. Nam 1998, chi Erwinia này đã được đổi tên thành chi Pectobacterium (Hauben và ctv, 1998). Pectobacterium được chia thành các nhóm dưới loài gồm: Pectobacterium atroseptica (trước đây là Erwinia carotovora subsp.
atroseptica); Pectobacterium carotovora subsp. carotovorum (Erwinia carotovora subsp. carotovora) (Gardan va ctv, 2003); Pectobacterium carotovora subsp. brasilinse (Erwinia carotovora subsp.
brasilinse); Pectobacterium wasabiae (Erwinia carotovora subsp. wasabiae) (Pitman va ctv, 2008) va Pectobacterium carotovora subsp. odiferiferum (Erwinia carotovora subsp. Phân bố và đặc điểm 2.
Phân bố Erwinia sp. phân bố rộng khắp thế giới cả vùng nhiệt đới và ôn đới, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới, cả cây trồng ngoài trời và trong nhà kính. Trong đó, loài Erwinia carotovora có phô kí chủ rộng hơn những loài khác, là tác nhân chủ yếu gây bệnh thối nhiin trước và sau thu hoạch làm giảm đáng kể năng suất cây trồng. là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: Solanum tuberosum, Allium (hành củ, củ tỏi, toi tây), Ananas comosus (dita), Anemone, Apium graveolens (can tay), Araceae, Asparagus officinalis (mang tay), Brassica oleracea (cải bắp, súp lơ), Capsicum annuum (hồ tiêu), Carica papaya (du đủ), Cichorium intybus (rau diép xoăn), Chrysanthemum maximum hybrids, Chrysanthemum vestitum, Colocasia esculenta (khoai sọ), Consolida ambigua (cây phi yên), Cucumis melo (dua), Cucumis sativus (dua chuột), Cyclamen, Cynara scolymus (cây atis6), Dahlia pinnata, Daucus carota (cà rốt), Dianthus (cam chướng), Elettaria cardamomum (bach đậu khẩu), Z uphorbia pulcherrima (cây trạng nguyên), Glycine max (đậu nành), Helianthus annuus (hoa hướng dương), Ipomoea batatas (khoai lang), Lactuca sativa (rau diép), Lycopersicon esculentum (ca chua), Medicago sativa (cé linh lang), Musa (chuối), Nicotiana tabacum (thuốc la), Oryza sativa (lua), Paspalum, Pennisetum purpureum (co voi), Phalaenopsis, Philodendron, Pyrus communis (dau), Raphanus sativus (cu cai), Saccharum officinarum (mia), Sedum spectabile, Solanaceae, Solanum melongena (ca tim), Solanum tuberosum (khoai tay), Sorghum bicolor (lúa mién), Urochloa mutica (kê), Zea mays (ngô) (Dickey va ctv, 1984).
Đặc điểm hình thái và sinh hóa Erwinia sp. là vi khuan ky khí tùy nghi, Gram âm, dạng hình que, hai đầu hơi tròn, đơn lẻ hoặc từng cặp, có khả năng di động do có 2 - 8 lông roi bao quanh tế bao và có kích thước trung bình từ 0,6 - 0,7 um đến 2 - 2,5 um (Fiori và Schiaffino, 2003). có phan ứng catalase đương tính, phát triển trong điều kiện ky khí, lên men glucose, biến đổi nitrate, thủy phân và sản sinh acid từ các loại đường L-arabinose, D-galactose, D-glucose, glucerol, D-manose, D-ribose va sucrose. Tuy nhiên, Erwinia sp.
có phan ứng âm với oxidase, không san sinh urease hoặc acid từ adonitol. Hau hết các dòng thủy phân L-rhamnose và D-manitol nhưng không thủy phân dextrin (Avrova va ctv, 2002). Vi khuẩn Erwinia phát triển ở phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là khoảng 27°C - 32°C, nhiệt độ tới han là 50°C. Pham vi pH cũng khá rộng, dao động từ 5,3 - 9,2 trong đó pH thích hợp nhất là 7,2.
Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô và dưới ánh nang (Vũ Triệu Man, 2007). Dé phân lập vi khuân Erwinia sp. có thé dùng nhiều loại môi trường khác nhau như: CVP, PDA (PGA), TZA, YDC. Tuy nhiên, môi trường phân lập tốt nhất được lựa chọn dé phân lập vi khuẩn gây thối nhũn là CVP (Crystal Violet Pectate).
Trên môi trường này, sau 48 giờ ủ ở 27°C, khuan lạc trong mờ, có màu sắc óng ánh, dang lõm (Hyman và ctv, 2002). Trên môi trường TZC khuẩn lạc của vi khuẩn Erwinia sp. có màu đỏ ở giữa, ria ngoài màu trang. Đây cũng là một đặc trưng dé nhận biết loài Erwinia (Lê Lương Té va Vũ Triệu Man, 1977).
Ngoài ra, có thé sử dụng môi trường agar dinh dưỡng hoặc KB dé phân lập vi khuẩn Erwinia sp. Khuan lạc của Erwinia sp. trên môi trường KB sẽ không phát huỳnh quang trong khi hầu hết các loài của Pseudomonas đều phát huỳnh quang. Khả năng phát triển và gây hại trên cây trồng 2.
Điều kiện phát sinh và phát triển Sự khởi đầu của mầm bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi trường và vi khuân gây bệnh thực sự được coi là tác nhân cơ hội. Vi khuân Erwinia có khả năng sống trong mô thực vật mà không gây ra triệu chứng nhưng giai đoạn không triệu chứng kết thúc khi độ 4m cao va nồng độ oxy thấp tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn dẫn đến cây trồng bị nhiễm bệnh. Bệnh do vi khuẩn Erwinia sp. thường xảy ra trong những ngày mưa dam, dat thoát nước kém, lên liếp thấp, có nhiều tàn dư chưa hoai mục hoặc tưới nhiều nước, bón phân không cân đối.
Vi khuẩn tồn tại trong quá trình bảo quản, trong đất, xác bã thực vật, trong nước tưới và có thé tồn tại trên nhộng của một số côn trùng. Sau khi xâm nhập chúng bat đầu phát triển trong gian bào, xâm nhiễm vào trong nhu mô (Lê Lương Té và Vũ Triệu Man, 1999). Vi khuẩn Erwinia sp. phat triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là 27 - 32°C, nhiệt độ tới hạn chết là 50°C; phạm vi pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2 (Lê Lương Té và Vũ Triệu Man, 1977).
Con đường xâm nhiễm Erwinia sp. xâm nhập qua vết thương như: do cơ giới (vết thương do cắt tỉa, thu hoạch, tưới phun áp lực cao), gió mưa, côn trùng, gia súc, con người. Erwinia là loài vi khuân đa thực, chúng phá hoại trên 50 loại cây trồng khác nhau. Bệnh lây nhiễm từ cây bệnh sang cây mạnh hay có thé lan truyền qua mam, củ, thân hành, thân rễ, lá thân, rễ (Lê Lương Té và Vũ Triệu Man, 1999).
Triệu chứng Erwinia sp. là nguyên nhân gây bệnh thối nhữn trên rau cải, hành tây, khoai tây, hoa hồng, hoa cúc, thược dược; gây héo rũ trên hoa hồng, hoa cúc, ngô, Dieffenbachia pulcherrimai, chuối; gây bệnh còi cọc (drawing), héo chậm (slow wilting) và can cỗi (stunting) trên hoa câm chướng (Burkholder và ctv, 1953). Vi khuẩn tấn công trên các bộ phận khác nhau của cây, có thể có những triệu chứng bệnh khác nhau. Lá bi bệnh do vi khuẩn Erwinia sp.
thường có triệu chứng bị thương tốn, héo rũ, thối nhũn, bị vàng dan và rụng; thân cây bệnh bị biến đổi màu, héo rũ, phát triển đị dạng hoặc chết, phần rễ bị bệnh thường có triệu chứng thối rữa. Quá trình nhiễm bệnh từ một bộ phận thân, lá cho đến khi lan ra cả cây diễn ra rất nhanh. Trên khoai tây, vi khuân gây thôi nhũn thân củ làm thân củ không mọc tiếp được. Sau đó, vi khuan gây hại đến thân cây, triệu chứng này xuất hiện phụ thuộc vào điều kiện môi trường: dưới điều kiện nóng, khô cây có xu hướng bị khô, héo nhưng khi môi trường nóng, am thân bị thối đen từ thân củ lên phía trên (Perombelon và Kelman, 1987).
Thối nhũn trên đồng ruộng có thé do một trong những loài vi khuẩn Erwinia sp. gây ra như: Erwinia carotovora va Erwinia chrysanthemi là chủ yêu. Nghiên cứu trên thé giới và Việt Nam về Erwinia gây bệnh trên cây trồng 2. Trên thế giới Bệnh cây do vi khuẩn gây ra trong đó có nhiều bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn đặc biệt trong thời kỳ sinh trưởng của cây cũng như trong thời gian bảo quản, cất trữ nông sản phẩm.