Nghiên Cứu Phân Lập Gene SyrB2 Từ Chủng Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae

• Tác giả: Đinh Thị Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Gene SyrB2 Từ Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
• 2.2. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
• 2.3. Khả năng gây bệnh chung của P.
• 2.4. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
• 2.5. Khái quát về Syringomycin E
• 2.6. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
• 2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
• 2.8. Phổ hoạt động của Syringomycin E
• 2.9. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước
• 2.9.1. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
• 2.9.2. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
• 2.10. Chức năng của protein SyrB2
• 2.11. Phương pháp PCR, realtime PCR
• 2.11.1. Phương pháp PCR
• 2.11.2. Real-time PCR
• 2.12. Vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.2. Chủng vi khuẩn
• 3.3. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.4. Môi trường và dung dịch
• 3.5. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn
• 3.7.2. Phương pháp PCR
• 3.7.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.7.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI
• 3.7.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn
• 3.7.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên
• 3.7.10. Kỹ thuật Real-time PCR
• 3.7.11. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.7.12. Giải trình tự gene
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120
• 4.2. Tạo dòng gen SyrB2
• 4.3. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu
• 4.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy
• 4.5. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E.
• 4.6. Kiểm tra kết quả tạo dòng
• 4.7. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2
• 4.8. Kết quả giải trình tự gen
• 4.9. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI
• 4.10. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến
• 4.11. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gene SyrB2 Vai Trò và Tiềm Năng

Nghiên cứu về gene syrB2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae mở ra hướng đi mới trong kiểm soát bệnh hại thực vật. Bệnh cây gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp toàn cầu, với nấm là tác nhân chính. Việc sử dụng thuốc hóa học, dù hiệu quả nhanh, lại gây ra nhiều vấn đề như ô nhiễm môi trường và kháng thuốc. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp sinh học, đặc biệt là các hợp chất kháng nấm tự nhiên, trở nên cấp thiết. Pseudomonas syringae sản xuất syringomycin, một lipodepsinonapeptide có hoạt tính kháng nấm mạnh. Gene syrB2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và phân tích gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae sinh tổng hợp syringomycin cao, nhằm khai thác tiềm năng ứng dụng của nó trong nông nghiệp bền vững.

1.1. Giới Thiệu Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae và Syringomycin

Pseudomonas syringae là một loài vi khuẩn Gram âm, gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Một số chủng Pseudomonas syringae có khả năng sinh tổng hợp syringomycin, một hợp chất có hoạt tính kháng nấm mạnh. Syringomycin là một lipodepsinonapeptide, có cấu trúc phức tạp và cơ chế tác động độc đáo. Nó có khả năng phá vỡ màng tế bào nấm, gây chết tế bào. Nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy syringomycin có phổ kháng nấm rộng, chống lại nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng. Theo một nghiên cứu, syringomycin E có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm.

1.2. Tầm Quan Trọng của Gene SyrB2 Trong Sinh Tổng Hợp Syringomycin

Gene syrB2 là một trong những gen quan trọng trong cụm gen syr, chịu trách nhiệm cho quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Protein SyrB2 đóng vai trò thiết yếu trong việc lắp ráp các đơn vị cấu thành của syringomycin. Việc nghiên cứu gene syrB2 giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp syringomycin, từ đó có thể tìm ra các phương pháp để tăng cường sản xuất syringomycin hoặc tạo ra các biến thể syringomycin mới với hoạt tính kháng nấm cao hơn. Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết.

II. Thách Thức và Mục Tiêu Nghiên Cứu Gene SyrB2 Hiện Nay

Mặc dù syringomycin có tiềm năng lớn trong kiểm soát bệnh hại thực vật, nhưng việc ứng dụng nó vào thực tế vẫn còn gặp nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là chi phí sản xuất syringomycin còn cao. Việc tăng cường sản xuất syringomycin đòi hỏi phải có hiểu biết sâu sắc về cơ chế sinh tổng hợp của nó, đặc biệt là vai trò của các gen liên quan, trong đó có gene syrB2. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, giải trình tự và phân tích gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae sinh tổng hợp syringomycin cao, nhằm tìm kiếm các đột biến có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin.

2.1. Các Vấn Đề Liên Quan Đến Sản Xuất và Ứng Dụng Syringomycin

Việc sản xuất syringomycin ở quy mô công nghiệp còn gặp nhiều khó khăn do năng suất thấp và chi phí cao. Syringomycin cũng có thể gây độc cho một số loại cây trồng, hạn chế khả năng ứng dụng của nó. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về độc tính của syringomycin và các biện pháp để giảm thiểu tác động tiêu cực của nó. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về tính ổn định của syringomycin trong môi trường và khả năng chống chịu của nó đối với các điều kiện khắc nghiệt.

2.2. Xác Định Mục Tiêu Cụ Thể Trong Nghiên Cứu Gene SyrB2

Nghiên cứu này tập trung vào các mục tiêu sau: (1) Tách dòng và giải trình tự gene syrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở mức độ gen và protein. (2) Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. (3) Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT-realtime PCR. Các kết quả thu được sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc, chức năng và điều hòa của gene syrB2, từ đó có thể ứng dụng vào việc cải thiện quá trình sản xuất syringomycin.

III. Phương Pháp Phân Lập và Giải Trình Tự Gene SyrB2 Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để phân lập và giải trình tự gene syrB2. Đầu tiên, DNA tổng số được tách chiết từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Sau đó, gene syrB2 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli. Các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và DNA plasmid được tách chiết. Cuối cùng, DNA plasmid được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide của gene syrB2.

3.1. Kỹ Thuật PCR và Tách Dòng Gene SyrB2 Chi Tiết

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại gene syrB2 từ DNA tổng số của vi khuẩn Pseudomonas syringae. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự đã biết của gene syrB2. Quá trình PCR bao gồm các chu kỳ nhiệt lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ bao gồm các giai đoạn: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Sản phẩm PCR được tinh sạch và gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy. Vector pGEM-T Easy chứa đoạn T thừa ở hai đầu, cho phép gắn trực tiếp với sản phẩm PCR có đoạn A thừa. Theo tài liệu gốc, thành phần phản ứng PCR gene SyrB2 được tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất.

3.2. Giải Trình Tự DNA và Phân Tích Tin Sinh Học Gene SyrB2

Sau khi tách dòng thành công, DNA plasmid chứa gene syrB2 được gửi đi giải trình tự. Trình tự nucleotide thu được được phân tích bằng các công cụ tin sinh học để xác định vị trí các gen, các vùng điều hòa và các đột biến (nếu có). Các công cụ như BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) được sử dụng để so sánh trình tự gene syrB2 với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu gen. Các phân tích tin sinh học giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của gene syrB2.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Phân Tích Trình Tự và Biểu Hiện Gene SyrB2

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập và giải trình tự thành công gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Phân tích trình tự cho thấy có sự khác biệt giữa trình tự gene syrB2 của chủng vi khuẩn nghiên cứu và trình tự gene syrB2 chuẩn trên NCBI. Các khác biệt này có thể là do đột biến hoặc do sự khác biệt giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. Nghiên cứu cũng tiến hành kiểm tra sự biểu hiện của gene syrB2 bằng kỹ thuật Real-time PCR. Kết quả cho thấy gene syrB2 được biểu hiện ở mức độ cao trong điều kiện nhất định.

4.1. So Sánh Trình Tự Gene SyrB2 Giữa Các Chủng Vi Khuẩn

Việc so sánh trình tự gene syrB2 giữa các chủng vi khuẩn khác nhau có thể giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự tiến hóa và đa dạng di truyền của gene syrB2. Các đột biến trong gene syrB2 có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein SyrB2 và quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Việc xác định các đột biến này có thể giúp chúng ta tìm ra các phương pháp để cải thiện quá trình sản xuất syringomycin.

4.2. Đánh Giá Mức Độ Biểu Hiện Gene SyrB2 Bằng Real time PCR

Kỹ thuật Real-time PCR được sử dụng để định lượng mức độ biểu hiện của gene syrB2 trong các điều kiện khác nhau. Kết quả cho thấy gene syrB2 được biểu hiện ở mức độ cao trong điều kiện nhất định, cho thấy rằng các điều kiện này có thể kích thích quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Việc hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gene syrB2 có thể giúp chúng ta tối ưu hóa quá trình sản xuất syringomycin.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Nghiên Cứu Gene SyrB2 Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu về gene syrB2 có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp. Việc hiểu rõ cơ chế sinh tổng hợp syringomycin có thể giúp chúng ta tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn, từ đó có thể sử dụng để kiểm soát bệnh hại thực vật một cách hiệu quả và bền vững. Ngoài ra, syringomycin cũng có thể được sử dụng làm chất bảo quản nông sản, giúp kéo dài thời gian bảo quản và giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch.

5.1. Phát Triển Chế Phẩm Sinh Học Từ Syringomycin

Syringomycin có thể được sử dụng để phát triển các chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh hại thực vật. Các chế phẩm này có thể được sử dụng để phun lên cây trồng hoặc xử lý đất, giúp bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh do nấm gây ra. Việc sử dụng chế phẩm sinh học từ syringomycin có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

5.2. Cải Thiện Năng Suất và Chất Lượng Nông Sản

Việc sử dụng syringomycin để kiểm soát bệnh hại thực vật có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng nông sản. Cây trồng khỏe mạnh hơn sẽ cho năng suất cao hơn và chất lượng tốt hơn. Điều này có ý nghĩa quan trọng đối với việc đảm bảo an ninh lương thực và nâng cao thu nhập cho người nông dân.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gene SyrB2

Nghiên cứu này đã góp phần làm sáng tỏ vai trò của gene syrB2 trong quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Các kết quả thu được sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế điều hòa biểu hiện của gene syrB2 và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn thông qua kỹ thuật di truyền.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Chính và Ý Nghĩa Khoa Học

Nghiên cứu đã phân lập, giải trình tự và phân tích thành công gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa trình tự gene syrB2 của chủng vi khuẩn nghiên cứu và trình tự gene syrB2 chuẩn trên NCBI. Nghiên cứu cũng đã kiểm tra sự biểu hiện của gene syrB2 bằng kỹ thuật Real-time PCR. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp syringomycin.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Mở Rộng Về Gene SyrB2

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc: (1) Nghiên cứu cơ chế điều hòa biểu hiện của gene syrB2. (2) Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin. (3) Tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn thông qua kỹ thuật di truyền. (4) Nghiên cứu độc tính của syringomycin và các biện pháp để giảm thiểu tác động tiêu cực của nó.