Nghiên Cứu Phân Lập Gene SyrB2 Từ Chủng Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae

Nghiên cứu phân lập gene syrb 2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae pv syringae, phục vụ cho việc sinh tổng hợp syringomycin hiệu quả.

• Tác giả: Đinh Thị Huệ
• Người hướng dẫn: TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Gene SyrB2 Từ Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.
• 2.2. Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae
• 2.3. Khả năng gây bệnh chung của P.
• 2.4. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm
• 2.5. Khái quát về Syringomycin E
• 2.6. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE
• 2.7. Cơ chế diệt vi sinh vật của Syringomycin E
• 2.8. Phổ hoạt động của Syringomycin E
• 2.9. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trong và ngoài nước
• 2.9.1. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E trên thế giới
• 2.9.2. Tình hình nghiên cứu Syringomycin E ở Việt Nam
• 2.10. Chức năng của protein SyrB2
• 2.11. Phương pháp PCR, realtime PCR
• 2.11.1. Phương pháp PCR
• 2.11.2. Real-time PCR
• 2.12. Vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 3.2. Chủng vi khuẩn
• 3.3. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.4. Môi trường và dung dịch
• 3.5. Địa điểm và thời gian thực tập
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số từ vi khuẩn
• 3.7.2. Phương pháp PCR
• 3.7.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.7.4. Phương pháp gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Cắt kiểm tra pGEM-T Easy -SyrB2 với EcoRI
• 3.7.8. Kỹ thuật tách ARN từ vi khuẩn
• 3.7.9. Phương pháp chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên
• 3.7.10. Kỹ thuật Real-time PCR
• 3.7.11. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 3.7.12. Giải trình tự gene
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tách chiết DNA, RNA tổng số vi khuẩn Pseudomonas syrringae PS120
• 4.2. Tạo dòng gen SyrB2
• 4.3. Khuếch đại gen SyrB2 của chủng vi khuẩn P. syringae PS 120 bằng cặp mồi đặc hiệu
• 4.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy
• 4.5. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E.
• 4.6. Kiểm tra kết quả tạo dòng
• 4.7. Kết quả giải trình tự và phân tích gen Syrb2
• 4.8. Kết quả giải trình tự gen
• 4.9. So sánh trình tự gen SyrB2 kiểu dại, kiểu đột biến và trình tự SyrB2 chuẩn trên NCBI
• 4.10. So sánh trình tự gen SyrB2 giữa chủng kiểu dại và chủng đột biến
• 4.11. Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật Real time PCR
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gene SyrB2 Vai Trò và Tiềm Năng

Nghiên cứu về gene syrB2 từ vi khuẩn Pseudomonas syringae mở ra hướng đi mới trong kiểm soát bệnh hại thực vật. Bệnh cây gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp toàn cầu, với nấm là tác nhân chính. Việc sử dụng thuốc hóa học, dù hiệu quả nhanh, lại gây ra nhiều vấn đề như ô nhiễm môi trường và kháng thuốc. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp sinh học, đặc biệt là các hợp chất kháng nấm tự nhiên, trở nên cấp thiết. Pseudomonas syringae sản xuất syringomycin, một lipodepsinonapeptide có hoạt tính kháng nấm mạnh. Gene syrB2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và phân tích gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae sinh tổng hợp syringomycin cao, nhằm khai thác tiềm năng ứng dụng của nó trong nông nghiệp bền vững.

1.1. Giới Thiệu Vi Khuẩn Pseudomonas Syringae và Syringomycin

Pseudomonas syringae là một loài vi khuẩn Gram âm, gây bệnh trên nhiều loại cây trồng. Một số chủng Pseudomonas syringae có khả năng sinh tổng hợp syringomycin, một hợp chất có hoạt tính kháng nấm mạnh. Syringomycin là một lipodepsinonapeptide, có cấu trúc phức tạp và cơ chế tác động độc đáo. Nó có khả năng phá vỡ màng tế bào nấm, gây chết tế bào. Nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy syringomycin có phổ kháng nấm rộng, chống lại nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng. Theo một nghiên cứu, syringomycin E có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm.

1.2. Tầm Quan Trọng của Gene SyrB2 Trong Sinh Tổng Hợp Syringomycin

Gene syrB2 là một trong những gen quan trọng trong cụm gen syr, chịu trách nhiệm cho quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Protein SyrB2 đóng vai trò thiết yếu trong việc lắp ráp các đơn vị cấu thành của syringomycin. Việc nghiên cứu gene syrB2 giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp syringomycin, từ đó có thể tìm ra các phương pháp để tăng cường sản xuất syringomycin hoặc tạo ra các biến thể syringomycin mới với hoạt tính kháng nấm cao hơn. Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết.

II. Thách Thức và Mục Tiêu Nghiên Cứu Gene SyrB2 Hiện Nay

Mặc dù syringomycin có tiềm năng lớn trong kiểm soát bệnh hại thực vật, nhưng việc ứng dụng nó vào thực tế vẫn còn gặp nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là chi phí sản xuất syringomycin còn cao. Việc tăng cường sản xuất syringomycin đòi hỏi phải có hiểu biết sâu sắc về cơ chế sinh tổng hợp của nó, đặc biệt là vai trò của các gen liên quan, trong đó có gene syrB2. Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, giải trình tự và phân tích gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae sinh tổng hợp syringomycin cao, nhằm tìm kiếm các đột biến có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin.

2.1. Các Vấn Đề Liên Quan Đến Sản Xuất và Ứng Dụng Syringomycin

Việc sản xuất syringomycin ở quy mô công nghiệp còn gặp nhiều khó khăn do năng suất thấp và chi phí cao. Syringomycin cũng có thể gây độc cho một số loại cây trồng, hạn chế khả năng ứng dụng của nó. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về độc tính của syringomycin và các biện pháp để giảm thiểu tác động tiêu cực của nó. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về tính ổn định của syringomycin trong môi trường và khả năng chống chịu của nó đối với các điều kiện khắc nghiệt.

2.2. Xác Định Mục Tiêu Cụ Thể Trong Nghiên Cứu Gene SyrB2

Nghiên cứu này tập trung vào các mục tiêu sau: (1) Tách dòng và giải trình tự gene syrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở mức độ gen và protein. (2) Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. (3) Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT-realtime PCR. Các kết quả thu được sẽ cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc, chức năng và điều hòa của gene syrB2, từ đó có thể ứng dụng vào việc cải thiện quá trình sản xuất syringomycin.

III. Phương Pháp Phân Lập và Giải Trình Tự Gene SyrB2 Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại để phân lập và giải trình tự gene syrB2. Đầu tiên, DNA tổng số được tách chiết từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Sau đó, gene syrB2 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli. Các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp được chọn lọc và DNA plasmid được tách chiết. Cuối cùng, DNA plasmid được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide của gene syrB2.

3.1. Kỹ Thuật PCR và Tách Dòng Gene SyrB2 Chi Tiết

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại gene syrB2 từ DNA tổng số của vi khuẩn Pseudomonas syringae. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự đã biết của gene syrB2. Quá trình PCR bao gồm các chu kỳ nhiệt lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ bao gồm các giai đoạn: biến tính, gắn mồi và kéo dài. Sản phẩm PCR được tinh sạch và gắn vào vector tách dòng pGEM-T Easy. Vector pGEM-T Easy chứa đoạn T thừa ở hai đầu, cho phép gắn trực tiếp với sản phẩm PCR có đoạn A thừa. Theo tài liệu gốc, thành phần phản ứng PCR gene SyrB2 được tối ưu hóa để đạt hiệu quả cao nhất.

3.2. Giải Trình Tự DNA và Phân Tích Tin Sinh Học Gene SyrB2

Sau khi tách dòng thành công, DNA plasmid chứa gene syrB2 được gửi đi giải trình tự. Trình tự nucleotide thu được được phân tích bằng các công cụ tin sinh học để xác định vị trí các gen, các vùng điều hòa và các đột biến (nếu có). Các công cụ như BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) được sử dụng để so sánh trình tự gene syrB2 với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu gen. Các phân tích tin sinh học giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của gene syrB2.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Phân Tích Trình Tự và Biểu Hiện Gene SyrB2

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập và giải trình tự thành công gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Phân tích trình tự cho thấy có sự khác biệt giữa trình tự gene syrB2 của chủng vi khuẩn nghiên cứu và trình tự gene syrB2 chuẩn trên NCBI. Các khác biệt này có thể là do đột biến hoặc do sự khác biệt giữa các chủng vi khuẩn khác nhau. Nghiên cứu cũng tiến hành kiểm tra sự biểu hiện của gene syrB2 bằng kỹ thuật Real-time PCR. Kết quả cho thấy gene syrB2 được biểu hiện ở mức độ cao trong điều kiện nhất định.

4.1. So Sánh Trình Tự Gene SyrB2 Giữa Các Chủng Vi Khuẩn

Việc so sánh trình tự gene syrB2 giữa các chủng vi khuẩn khác nhau có thể giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự tiến hóa và đa dạng di truyền của gene syrB2. Các đột biến trong gene syrB2 có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein SyrB2 và quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Việc xác định các đột biến này có thể giúp chúng ta tìm ra các phương pháp để cải thiện quá trình sản xuất syringomycin.

4.2. Đánh Giá Mức Độ Biểu Hiện Gene SyrB2 Bằng Real time PCR

Kỹ thuật Real-time PCR được sử dụng để định lượng mức độ biểu hiện của gene syrB2 trong các điều kiện khác nhau. Kết quả cho thấy gene syrB2 được biểu hiện ở mức độ cao trong điều kiện nhất định, cho thấy rằng các điều kiện này có thể kích thích quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Việc hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gene syrB2 có thể giúp chúng ta tối ưu hóa quá trình sản xuất syringomycin.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Nghiên Cứu Gene SyrB2 Trong Nông Nghiệp

Nghiên cứu về gene syrB2 có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp. Việc hiểu rõ cơ chế sinh tổng hợp syringomycin có thể giúp chúng ta tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn, từ đó có thể sử dụng để kiểm soát bệnh hại thực vật một cách hiệu quả và bền vững. Ngoài ra, syringomycin cũng có thể được sử dụng làm chất bảo quản nông sản, giúp kéo dài thời gian bảo quản và giảm thiểu tổn thất sau thu hoạch.

5.1. Phát Triển Chế Phẩm Sinh Học Từ Syringomycin

Syringomycin có thể được sử dụng để phát triển các chế phẩm sinh học kiểm soát bệnh hại thực vật. Các chế phẩm này có thể được sử dụng để phun lên cây trồng hoặc xử lý đất, giúp bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh do nấm gây ra. Việc sử dụng chế phẩm sinh học từ syringomycin có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người.

5.2. Cải Thiện Năng Suất và Chất Lượng Nông Sản

Việc sử dụng syringomycin để kiểm soát bệnh hại thực vật có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng nông sản. Cây trồng khỏe mạnh hơn sẽ cho năng suất cao hơn và chất lượng tốt hơn. Điều này có ý nghĩa quan trọng đối với việc đảm bảo an ninh lương thực và nâng cao thu nhập cho người nông dân.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gene SyrB2

Nghiên cứu này đã góp phần làm sáng tỏ vai trò của gene syrB2 trong quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Các kết quả thu được sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế điều hòa biểu hiện của gene syrB2 và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin. Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn thông qua kỹ thuật di truyền.

6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Chính và Ý Nghĩa Khoa Học

Nghiên cứu đã phân lập, giải trình tự và phân tích thành công gene syrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa trình tự gene syrB2 của chủng vi khuẩn nghiên cứu và trình tự gene syrB2 chuẩn trên NCBI. Nghiên cứu cũng đã kiểm tra sự biểu hiện của gene syrB2 bằng kỹ thuật Real-time PCR. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế sinh tổng hợp syringomycin.

6.2. Đề Xuất Các Hướng Nghiên Cứu Mở Rộng Về Gene SyrB2

Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc: (1) Nghiên cứu cơ chế điều hòa biểu hiện của gene syrB2. (2) Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp syringomycin. (3) Tạo ra các chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae có khả năng sản xuất syringomycin cao hơn thông qua kỹ thuật di truyền. (4) Nghiên cứu độc tính của syringomycin và các biện pháp để giảm thiểu tác động tiêu cực của nó.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hằng năm, bệnh hại cây trồng gây ra những thiệt hại nặng nề cho sản xuất nông nghiệp toàn cầu, ước tính phá hủy 537,3 triệu tấn nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp thế giới. Trong tổng số các loại bệnh hại, các bệnh do nấm gây ra chiếm tỷ lệ khoảng 83%, tiêu biểu là các chủng nấm thuộc chi Fusarium và Rhizoctonia, tấn công trên nhiều loại cây lương thực và rau quả kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, hồ tiêu. Biện pháp bảo vệ thực vật phổ biến nhất hiện nay vẫn là sử dụng thuốc hóa học. Mặc dù thuốc hóa học mang lại hiệu quả diệt trừ nhanh và phổ tác dụng rộng, phương pháp này bộc lộ nhiều nhược điểm nghiêm trọng: hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm tồn dư trong đất, nguy cơ nấm bệnh phát sinh tính kháng thuốc cao sau thời gian dài sử dụng, gây ô nhiễm môi trường đất, nước và để lại dư lượng độc hại đối với sức khỏe con người.

Bối cảnh thực tế cho thấy sự gia tăng của các chủng nấm kháng thuốc và sự khan hiếm các hợp chất kháng nấm thương mại an toàn đã thúc đẩy xu hướng tìm kiếm các chế phẩm sinh học thế hệ mới. Trong các tác nhân kiểm soát sinh học tiềm năng, vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae được biết đến với khả năng sinh tổng hợp các lipodepsinonapeptide có hoạt tính kháng nấm phổ rộng, bao gồm syringomycin E, syringotoxin B và syringostatin A. Trong đó, Syringomycin E (SR-E, công thức hóa học $\text{C}{53}\text{H}{85}\text{ClN}{14}\text{O}{17}$) là hợp chất đóng vai trò chủ đạo, có khả năng ức chế nhiều loại nấm sợi và nấm men gây bệnh mà không độc với tế bào động vật ở nồng độ kiểm soát. Trong con đường sinh tổng hợp Syringomycin E, enzyme SyrB2 (được mã hóa bởi gen SyrB2) giữ vai trò thiết yếu khi tham gia phản ứng clo hóa gốc L-threonine để tạo thành 4-chloro-L-threonine (4-Cl-L-Thr) – một thành phần axit amin đặc thù trong cấu trúc của phân tử peptide này. Do đó, việc nghiên cứu cấu trúc, phân lập và đánh giá mức độ biểu hiện của gen SyrB2 là bước khởi đầu quan trọng nhằm hiểu rõ cơ chế di truyền và tạo tiền đề sản xuất các chế phẩm kháng nấm sinh học.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể bao gồm:

1. Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm các biến dị hoặc đột biến trên gen SyrB2 ở mức độ nucleotide và chuỗi axit amin tương ứng.
2. Tách chiết ARN tổng số và tổng hợp cDNA bằng phương pháp phiên mã ngược sử dụng mồi ngẫu nhiên.
3. Kiểm tra và định lượng sự biểu hiện tương đối của gen SyrB2 ở mức độ phiên mã bằng kỹ thuật RT-realtime PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae PS120 (chủng kiểu dại) và chủng Pseudomonas syringae pv. syringae PS120-15 (chủng đột biến có khả năng sinh tổng hợp syringomycin cao), vector tách dòng pGEM-T Easy, tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5α.
• Phạm vi không gian: Đề tài được thực nghiệm tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Quá trình nghiên cứu và thu thập số liệu thực hiện từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 6 năm 2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

Đề tài vận dụng hệ thống lý thuyết về sinh tổng hợp peptide không qua ribosome (Non-Ribosomal Peptide Synthetase - NRPS) theo cơ chế khuôn mẫu thioester (thiotemplate mechanism). Quá trình tổng hợp chuỗi peptide Syringomycin E không dựa trên khuôn mARN thông thường mà phụ thuộc vào phức hệ enzyme đa chức năng chứa miền nhận biết/hoạt hóa adenyl hóa (A domain) và miền vận chuyển protein mang peptide (T domain/PCP). Cụm gen sinh tổng hợp syringomycin (syr cluster) có kích thước khoảng 37 kb trên hệ gen vi khuẩn, bao gồm sáu khung đọc mở mã hóa các protein tổng hợp (syrB1, syrB2, syrC, syrE), protein vận chuyển tiết (syrD) và protein điều hòa (syrP).

Protein SyrB2 là một enzyme halogenase phụ thuộc sắt không chứa nhân heme ($\text{Fe}^{\text{II}}/\alpha\text{-ketoglutarate}$ dependent halogenase), có khối lượng phân tử khoảng 36 kDa. Enzyme này xúc tác phản ứng gắn nguyên tử clo vào nhóm methyl của L-threonine khi axit amin này đang liên kết với miền T domain của protein mang SyrB1 (tạo thành phức hợp 4-Cl-Thr-S-SyrB1), hình thành nên gốc axit amin thứ chín trong cấu trúc vòng của Syringomycin E.

Về cơ chế kháng nấm, Syringomycin E tương tác trực tiếp với màng lipid kép của tế bào nấm mục tiêu. Do sở hữu cấu trúc phân cực gồm đầu peptide ưa nước và đuôi axit béo kỵ nước dài ($\text{C}_{12}$), các monomer SR-E chèn vào màng tế bào, tự tập hợp (tối thiểu 6 phân tử) để hình thành các lỗ dò không đặc hiệu với bán kính khoảng 1 nm. Các kênh này làm thay đổi điện thế màng, gây thoát ion $\text{K}^+$, xâm nhập ion $\text{H}^+$ và kích thích dòng ion $\text{Ca}^{2+}$ đi vào tế bào ồ ạt, phá vỡ gradient pH màng sinh chất và làm chết tế bào nấm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử chuẩn hóa:

• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng bộ kít PureLink™ Genomic DNA MiniKit (Invitrogen) từ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường lỏng King's B.
• Tách chiết ARN tổng số: Thu nhận sinh khối tế bào, ly giải bằng hóa chất Trizol, kết tủa phân tách pha bằng Chloroform và làm sạch bằng Isopropanol, cồn 70%.
• Tổng hợp cDNA: Sử dụng bộ kít SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) kết hợp đoạn mồi ngẫu nhiên hexamer (6 bp).
• Phản ứng PCR khuếch đại gen: Nhân bản đoạn gen SyrB2 (chiều dài khung đọc mở 932 bp, kích thước sản phẩm tính toán ~1,3 kb) sử dụng cặp mồi đặc hiệu:
  • Mồi xuôi (Forward): 5’-GAGCAAGCTCAAGACACATTAC-3’
  • Mồi ngược (Reverse): 5’-GCATCGGAGGAAATAGTCATGG-3’
• Kỹ thuật dòng hóa (Cloning): Gắn sản phẩm PCR tinh sạch vào vector pGEM-T Easy nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme T4-DNA ligase (dựa trên liên kết bổ sung giữa đầu nhô A của sản phẩm PCR tạo bởi Taq polymerase và đầu nhô 3’-T của vector).
• Biến nạp di truyền: Chuyển nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ($42^\circ\text{C}$ trong 90 giây). Sàng lọc thể biến nạp bằng hệ thống chỉ thị màu xanh/trắng trên môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 $\mu\text{g/ml}$), IPTG (1 mM/ml) và X-gal (40 $\mu\text{g/ml}$).
• Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra: Tách plasmid theo phương pháp ly giải kiềm sử dụng hệ dung dịch Sol I (Tris-HCl, EDTA), Sol II (NaOH, SDS) và Sol III (Kali axetat pH 5,5). Kiểm tra đoạn chèn bằng phản ứng cắt giới hạn với enzyme EcoRI.
• Điện di và tinh sạch: Điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, quan sát băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại sau khi nhuộm Ethidium Bromide (EtBr). Tinh sạch đoạn DNA bằng bộ kít GeneJET PCR Purification Kit.
• Real-time PCR định lượng tương đối: Sử dụng máy ThermoCycler 2.0 với chu trình nhiệt 45 chu kỳ. Mức độ biểu hiện gen được tính toán dựa trên phương pháp chu kỳ ngưỡng tương đối $2^{-\Delta\Delta C_t}$ của Livak.
• Giải trình tự và xử lý dữ liệu: Giải trình tự gen sử dụng cặp mồi M13 trên hệ thống giải trình tự tự động; phân tích, so sánh chuỗi nucleotide và chuỗi axit amin bằng phần mềm BioEdit và công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI.

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tổng quan về tổn thất kinh tế trong nông nghiệp do nấm bệnh gây ra, các mặt hạn chế của biện pháp phòng trừ hóa học và tiềm năng của các hoạt chất kháng sinh sinh học nguồn gốc từ vi khuẩn Pseudomonas. Phần này xác lập tính cấp thiết, mục tiêu khoa học và định hướng ứng dụng thực tiễn của việc phân lập gen SyrB2 nhằm phục vụ mục đích biểu hiện và sản xuất hoạt chất kháng nấm Syringomycin E.

Phần 2: Tổng quan nghiên cứu

Tổng hợp toàn diện các cơ sở lý luận và tài liệu trong và ngoài nước về chi Pseudomonas, đặc điểm phân loại học của Pseudomonas syringae pv. syringae, các độc tố thực vật và hoạt chất kháng sinh do nhóm vi khuẩn này tiết ra. Phân tích chi tiết cấu trúc hóa học, cơ chế tạo kênh màng diệt nấm, phổ kháng khuẩn của Syringomycin E (ức chế mạnh các chủng nấm Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum, Penicillium digitatum, Candida, Botrytis cinerea...). Tổng quan vai trò chức năng sinh học của enzyme SyrB2 trong chu trình clo hóa peptide, nguyên lý vận hành của các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, Real-time PCR, vector tạo dòng pGEM-T Easy và phương pháp chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng.

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết các nguồn nguyên vật liệu, chủng vi sinh vật (P. syringae PS120, PS120-15 và E. coli DH5α), hóa chất, thiết bị chuyên dụng và công thức các môi trường nuôi cấy (King's B, LB, thạch LB bổ sung chất kháng sinh). Trình bày đầy đủ thành phần các chất tham gia phản ứng và chu trình nhiệt độ cho các phản ứng khuếch đại gen SyrB2, phản ứng tổng hợp cDNA, phản ứng cắt enzyme giới hạn EcoRI và phản ứng định lượng phiên mã Real-time PCR.

Loại phản ứng / Thành phần	Nồng độ / Thể tích chuẩn	Điều kiện chu trình nhiệt tương ứng
Phản ứng PCR khuếch đại gen SyrB2 (Tổng 25 $\mu\text{l}$)	Nước: 8,5 $\mu\text{l}$; Mồi xuôi: 1 $\mu\text{l}$ (10 pM); Mồi ngược: 1 $\mu\text{l}$ (10 pM); DNA khuôn: 2 $\mu\text{l}$ (150 ng); Master mix	Biến tính ban đầu: $94^\circ\text{C}$ (3 phút); 35 chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ (30s), $55^\circ\text{C}$ (45s), $72^\circ\text{C}$ (1 phút 30s); Kéo dài: $72^\circ\text{C}$ (10 phút)
Phản ứng gắn vector pGEM-T Easy (Tổng 12 $\mu\text{l}$)	Nước: 1 $\mu\text{l}$; Vector: 1 $\mu\text{l}$; T4-DNA ligase: 1 $\mu\text{l}$; Buffer 2X: 5 $\mu\text{l}$; Sản phẩm PCR: 4 $\mu\text{l}$	Ủ ở nhiệt độ phòng ($22^\circ\text{C}$) trong 60 phút
Phản ứng cắt kiểm tra với EcoRI (Tổng 10 $\mu\text{l}$)	Nước: 5,5 $\mu\text{l}$; Buffer: 1 $\mu\text{l}$; EcoRI: 0,5 $\mu\text{l}$; Plasmid DNA: 3 $\mu\text{l}$	Ủ ở $37^\circ\text{C}$ trong thời gian 5 giờ
Phản ứng Real-time PCR (Tổng 20 $\mu\text{l}$)	Nước: 12 $\mu\text{l}$; RT Master Mix 5X: 4 $\mu\text{l}$; Mồi xuôi: 1 $\mu\text{l}$; Mồi ngược: 1 $\mu\text{l}$; cDNA: 2 $\mu\text{l}$	Biến tính: $94^\circ\text{C}$ (3 phút); 45 chu kỳ: $94^\circ\text{C}$ (10s), $55^\circ\text{C}$ (40s), $72^\circ\text{C}$ (1 phút 30s); Làm mát: $40^\circ\text{C}$ (30s)

Phần 4: Kết quả đạt được và thảo luận

Trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được từ quá trình tách chiết axit nucleic, nhân bản gen, biến nạp tạo dòng và kiểm tra phân tử:

• Tách chiết DNA và RNA tổng số: Kết quả điện di cho thấy các băng DNA tổng số nguyên vẹn, sắc nét, không bị đứt gãy. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA và RNA tổng số từ hai chủng vi khuẩn PS120 và PS120-15 được kiểm tra chính xác qua phép đo quang phổ Nanodrop.

Mẫu vi khuẩn phân tích	Chỉ số $A_{260}/A_{280}$ (DNA)	Nồng độ DNA ($\text{ng/}\mu\text{l}$)	Chỉ số $A_{260}/A_{280}$ (RNA)	Nồng độ RNA ($\text{ng/}\mu\text{l}$)
Chủng kiểu dại (PS120)	1,96	199	2,06	684
Chủng đột biến (PS120-15)	1,86	294	2,05	965

• Khuếch đại và tạo dòng gen SyrB2: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% ghi nhận một băng DNA duy nhất có kích thước khoảng 1,3 kb tại các đường chạy mẫu của cả chủng kiểu dại và chủng đột biến, hoàn toàn phù hợp với kích thước lý thuyết của gen SyrB2. Sau khi gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và chuyển nạp vào tế bào E. coli DH5α, hệ thống chỉ thị màu xanh/trắng cho thấy sự xuất hiện của các khuẩn lạc trắng (khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen đích do gen $\alpha\text{-peptide}$ bị bất hoạt) và khuẩn lạc xanh (chỉ mang vector gốc tự đóng vòng).
• Kiểm tra plasmid tái tổ hợp: Tách chiết plasmid từ 4 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh, sau đó điện di kiểm tra. Bốn mẫu plasmid từ khuẩn lạc trắng (đường chạy số 1, 2, 3, 5) di chuyển chậm hơn, nằm ở vị trí cao hơn so với plasmid từ khuẩn lạc xanh (đường chạy số 4), minh chứng cho sự tăng khối lượng phân tử do đã chèn đoạn gen SyrB2 thành công.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả kỹ thuật đạt được của đề tài, khẳng định tính khả thi của quy trình tách dòng gen SyrB2 và đưa ra các đề xuất tiếp theo nhằm ứng dụng đoạn gen thu được vào biểu hiện protein tái tổ hợp phục vụ nghiên cứu ứng dụng.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

1. Đã định danh chính xác chủng vi khuẩn nghiên cứu là Pseudomonas syringae pv. syringae dựa trên giải trình tự gen mã hóa 16S rARN.
2. Tách chiết thành công DNA tổng số đạt độ tinh sạch cao ($A_{260}/A_{280}$ từ 1,86 đến 1,96) với nồng độ 199 $\text{ng/}\mu\text{l}$ (chủng kiểu dại) và 294 $\text{ng/}\mu\text{l}$ (chủng đột biến); thu nhận RNA tổng số đạt nồng độ 684 $\text{ng/}\mu\text{l}$ và 965 $\text{ng/}\mu\text{l}$.
3. Khuếch đại thành công đoạn gen SyrB2 có kích thước 1,3 kb bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế chuyên biệt.
4. Gắn nối thành công đoạn gen SyrB2 vào vector tách dòng pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào chủ E. coli DH5α, sàng lọc và kiểm tra khẳng định sự hiện diện của đoạn chèn trong plasmid tái tổ hợp thu nhận từ các dòng khuẩn lạc trắng.
5. Thiết lập quy trình tổng hợp cDNA bằng mồi ngẫu nhiên và xây dựng hệ thống phản ứng Real-time PCR nhằm phục vụ phân tích so sánh mức độ phiên mã của gen giữa các chủng vi khuẩn.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục hoàn thiện các bước giải trình tự chi tiết toàn bộ đoạn gen chèn trên plasmid tái tổ hợp và tiến hành đối chiếu trên phần mềm BioEdit với dữ liệu chuẩn của GenBank/NCBI để xác định chính xác các điểm đột biến nucleotide và sự thay đổi axit amin tương ứng giữa chủng đột biến PS120-15 và chủng kiểu dại PS120.
• Ứng dụng số liệu định lượng $C_t$ từ kỹ thuật Real-time PCR để phân tích mức độ chênh lệch biểu hiện phiên mã của gen SyrB2 ở chủng sinh tổng hợp cao.
• Chuyển gen SyrB2 cùng các gen thuộc cụm tổng hợp syr vào các vector biểu hiện chuyên dụng nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp Syringomycin E quy mô lớn.

Đóng góp về mặt khoa học và thực tiễn

• Về mặt khoa học: Đề tài là công trình nghiên cứu trong nước thực hiện phân lập, tách dòng phân tử thành công gen SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae có năng suất sinh tổng hợp Syringomycin cao, đóng góp dữ liệu cấu trúc di truyền cụ thể cho hệ thống nghiên cứu vi sinh vật học phân tử tại Việt Nam.
• Về mặt thực tiễn: Đoạn gen SyrB2 được dòng hóa thành công trong plasmid pGEM-T Easy đóng vai trò là nguồn vật liệu sinh học nền tảng, tạo tiền đề kỹ thuật cho các nghiên cứu chuyển nạp gen, tối ưu hóa con đường sinh tổng hợp peptide kháng nấm phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ mùa màng và bảo quản nông sản sau thu hoạch.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp đại học dừng lại ở mức độ phân lập, gắn dòng đoạn gen SyrB2 vào vector tách dòng pGEM-T Easy, tách chiết kiểm tra plasmid, chuyển đổi cDNA và thiết lập chu trình nhiệt Real-time PCR; chưa thực hiện biểu hiện protein SyrB2 tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện protein chuyên biệt, chưa tiến hành tinh sạch enzyme chức năng cũng như chưa thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp của kháng sinh tái tổ hợp in vitro và in vivo trên cây trồng.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Hoàn thiện phân tích Tin sinh học chuyên sâu về cấu trúc không gian 3D của protein SyrB2 dựa trên trình tự axit amin đã giải mã.
  • Thiết kế vector biểu hiện chứa cụm gen sinh tổng hợp syringomycin đầy đủ và chuyển nạp vào các chủng vật chủ công nghiệp an toàn.
  • Đánh giá khả năng ức chế nấm bệnh thực nghiệm trên các mô hình bảo quản nông sản sau thu hoạch (cam, vải thiều, xoài, thanh long) chống lại các loài nấm mục tiêu như Penicillium digitatum, Fusarium oxysporum.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật đối với:

• Sinh viên và học viên cao học: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Bảo vệ Thực vật và Vi sinh vật học.
• Phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Quy trình chi tiết từng bước về tách chiết axit nucleic (DNA/RNA) từ vi khuẩn Gram âm, quy trình biến nạp sốc nhiệt vào E. coli DH5α và kỹ thuật tách dòng với vector pGEM-T Easy.
  • Công thức các loại dung dịch chuyên dụng trong phòng thí nghiệm phân tử (hệ đệm ly giải kiềm Sol I, II, III, đệm TAE 50X, King's B, Loading buffer).
  • Thiết kế mồi và thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR và Real-time PCR định lượng tương đối biểu hiện gen.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen SyrB2 có đặc điểm cấu trúc và chiều dài khung đọc mở là bao nhiêu?

Gen SyrB2 có kích thước toàn đoạn khoảng 1,3 kb với khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) dài 932 bp. Gen này mã hóa cho enzyme SyrB2 có khối lượng phân tử khoảng 36 kDa, không chứa nhân heme $\text{Fe}^{\text{II}}$, xúc tác quá trình clo hóa gốc L-threonine gắn trên miền T của protein SyrB1 để hình thành nên axit amin 4-chloro-L-threonine trong phân tử Syringomycin E.

2. Nguyên lý sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng khi sử dụng vector pGEM-T Easy trong khóa luận là gì?

Vector pGEM-T Easy chứa vùng đa nối (MCS) nằm bên trong đoạn gen mã hóa cho $\alpha\text{-peptide}$ của enzyme $\beta\text{-galactosidase}$. Khi sản phẩm PCR của gen SyrB2 được chèn thành công vào vị trí MCS, đoạn gen mã hóa $\alpha\text{-peptide}$ sẽ bị bất hoạt do gián đoạn khung đọc. Tế bào E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp không thể tổng hợp enzyme $\beta\text{-galactosidase}$ chức năng nên không thể phân giải cơ chất X-gal, hình thành khuẩn lạc có màu trắng. Ngược lại, nếu vector tự đóng vòng không mang gen chèn, enzyme $\beta\text{-galactosidase}$ được tạo ra đầy đủ sẽ phân giải X-gal thành hợp chất có màu xanh đậm.

3. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch DNA, RNA tổng số từ hai chủng vi khuẩn PS120 và PS120-15 đạt giá trị như thế nào?

Theo kết quả đo quang phổ Nanodrop được trình bày trong khóa luận:

• DNA tổng số chủng kiểu dại PS120 đạt nồng độ 199 $\text{ng/}\mu\text{l}$ với độ tinh sạch $A_{260}/A_{280} = 1{,}96$; chủng đột biến PS120-15 đạt nồng độ 294 $\text{ng/}\mu\text{l}$ với $A_{260}/A_{280} = 1{,}86$.
• RNA tổng số chủng kiểu dại PS120 đạt nồng độ 684 $\text{ng/}\mu\text{l}$ ($A_{260}/A_{280} = 2{,}06$); chủng đột biến PS120-15 đạt nồng độ 965 $\text{ng/}\mu\text{l}$ ($A_{260}/A_{280} = 2{,}05$).

4. Phương pháp nào được sử dụng để đánh giá sự biểu hiện của gen SyrB2 ở mức độ phiên mã và dựa trên nguyên lý tính toán nào?

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RT-Realtime PCR thực hiện trên máy ThermoCycler 2.0 để đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen SyrB2 thông qua lượng cDNA tổng hợp từ RNA tổng số. Nguyên lý tính toán dựa trên phương pháp định lượng tương đối $2^{-\Delta\Delta C_t}$ của Livak dựa vào chu kỳ ngưỡng ($C_t$), trong đó sự chênh lệch một đơn vị $C_t$ giữa mẫu thử và mẫu đối chứng tương ứng với sự khác biệt khoảng hai lần về hàm lượng bản phiên mã của gen đích.

5. Syringomycin E tiêu diệt tế bào nấm theo cơ chế lý sinh nào?

Syringomycin E sở hữu cấu trúc phân cực gồm đầu peptide ưa nước mang điện tích dương và đuôi axit béo kỵ nước. Khi tiếp xúc với màng tế bào nấm, tối thiểu sáu phân tử monomer SR-E chèn vào lớp màng lipid kép và tự tập hợp tạo thành các lỗ dò xuyên màng có bán kính khoảng 1 nm. Các kênh này làm rò rỉ ion $\text{K}^+$, dòng ion $\text{H}^+$ và $\text{Ca}^{2+}$ tràn vào tế bào làm đảo lộn điện thế màng và phá hủy gradient pH, dẫn đến việc tế bào nấm bị tiêu diệt.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đinh Thị Huệ đã thực hiện thành công quy trình tách chiết DNA, RNA tổng số đạt tiêu chuẩn độ sạch từ hai chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae PS120 và PS120-15. Nghiên cứu đã nhân bản thành công đoạn gen SyrB2 có kích thước 1,3 kb bằng kỹ thuật PCR mồi đặc hiệu và dòng hóa chính xác vào vector tách dòng pGEM-T Easy biến nạp trong tế bào E. coli DH5α. Kết quả thực nghiệm đã tạo lập được vật liệu plasmid tái tổ hợp ổn định và xây dựng thành công hệ thống phiên mã ngược cDNA kết hợp Real-time PCR, cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử quan trọng phục vụ định hướng phát triển chế phẩm sinh học kháng nấm trong nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Hằng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp. Chúng phá hủy 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới. Trong các loại bệnh thì bệnh do nấm gây ra chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizocronia gây ra với tỷ lệ lớn. Chúng gây bệnh trên nhiều loại rau quả và cây lương thực như lạc, cà chua, khoai tây, cà phê,tiêu.

Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả phòng trừ thấp đối với các loại nấm bệnh trong đất, nhanh bị ức chế bởi nấm bệnh sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Hơn nữa, ngày càng gia tăng bệnh nhiễm nấm, ít các loại thuốc kháng nấm có sẵn, và các loài nấm ngày càng kháng với thuốc chống nấm có sẵn, đã dẫn đến việc mở rộng việc tìm kiếm chế phẩm sinh học chống nấm mới. Chủng Pseudomonas syringae pv.

syringae sản xuất lipodepsinonapeptides với hoạt tính kháng nấm. Nghiên cứu trong ống nghiệm về cơ chế kháng nấm và các hoạt động diệt nấm của ba lipodepsinonapeptides (syringomycin E, syringotoxin B, và syringostatin A) cho thấy, cả ba hợp chất có khả năng chống nấm phổ rộng và có hoạt tính diệt hầu hết các loài nấm thử nghiệm. Syringomycin E (C53 H85CLN14O17) là một trong những hợp chất quan trọng nhất được nghiên cứu. Syringomycin B2 là một enzyme quan trọng liên quan chặt chẽ trong quá trình tiết ra Syringomycin E, một hoạt chất có phổ kháng khuẩn và nấm rộng được sản sinh bởi Pseudomonas syringae pv.

2 Việc nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của SyrB2 là cần thiết. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập gene SyrB2 từ chủng vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringae sinh tổng hợp Syringomycin cao” 1. Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng và giải trình tự gen SyrB2, tìm kiếm đột biến trên SyrB2 ở mức độ gen và protein.

- Tách ARN tổng số và chuyển cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. - Kiểm tra sự biểu hiện tương đối của SyrB2 ở mức độ gen bằng kỹ thuật RT- realtime PCR. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã được học và tham gia nghiên cứu khoa học, cách xử lí và phân tích số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học.

Quan trọng hơn là việc phân lập và tách dòng thành công gen syrB2 là cơ sở cho các nghiên cứu tổng quát có liên quan về sản xuất Syringomycin sau này. Ý nghĩa trong thực tiễn Sản phẩm của quá trình tách dòng gen syrB2 sẽ cung cấp vật liệu và là cơ sở cho các nghiên cứu nhằm đưa các gene mã hóa cho các enzyme tổng hợp syringomycin vào vi sinh vật, tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sản xuất syringomycin cao đáp ứng nhu cầu thị trường và hạ mức giá thành của sản phẩm. 3 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas syringae pv.

Đặc điểm của Pseudomonas syringae pv. syringae Căn cứ vào đặc điểm hình thái và sự phân bố địa lý Pseudomonas Syringae pv. syringae được phân loại thuộc[28]: Ngành (Phylum): Proteobacteria Lớp (Class): Gamma Proteobacteria Bộ (Order): Pseudomonadales Họ (Family): Pseudomonadaceae Chi (Genus): Pseudomonas Loài (Species): P.1: Pseudomonas dƣới kính hiển vi điện tử [16] Pseudomonas syringae pv.syringae là một thành viên của chi Pseudomonas, và dựa trên phân tích 16S rRNA, nó được đặt trong nhóm P. Nó được đặt tên theo tên của cây Tử đinh hương (Sơn mai hoa), chúng được phân lập đầu tiên từ cây này [28].

Đặc điểm hình thái học chung cho chi Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, di động 4 nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Có kích thước 0,5-1 x 1,5-5 μm, có khả năng chuyển động bằng một hay nhiều tiêm mao. Tính chất nuôi cấy: Pseudomonas mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5oC - 42°C, pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0.

Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp trên đĩa thạch (A) và hình thái tế bào (B) [1] Trên môi trường đặc có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: 1 loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi. Có xu hướng mọc lan (Hình 2.2A) , 1 loại xù xì bờ không đều, đôi khí có loại khuẩn lạc nhầy. Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu. Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất.

Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai [6]. Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên. Pseudomonas mọc được ở trên môi trường SS (shigella salmonella), đây là đặc điểm để phân biệt với trực khuẩn Whitmore. Tính chất đặc trưng của Pseudomonas là sinh sắc tố và chất thơm.

Có hai loại sắc tố chính pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan trong chloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím [1]. Sắc tố này không bền vững dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không tốt. Sắc tố của Pseudomonas dưới ảnh hưởng của các nguyên tố hóa học có thể thay đổi 5 thành màu nâu, đen.

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học [7,25]. Khả năng gây bệnh chung của P.

syringae được chứng minh gây ra một loạt các triệu chứng trên thực vật, bao gồm cả cháy lá, đốm lá, lá sần sùi. Loài này được chia thành nhiều biến thể gây bệnh (pathovars), trên nhiều cây chủ khác nhau. Khi Pseudomonas xâm nhập vào mô thực vật, chúng tương tác tạo triệu chứng ngậm nước, sau đó là quá trình tăng sinh và phát triển các triệu chứng nâng cao hơn. Trong khi đó, các tế bào cây chủ phản ứng lại sự xâm nhập của vi khuẩn bằng cơ chế hoại tử sau 12-24 giờ [8].

Nhóm gen HRP là cần thiết cho khả năng gây bệnh của Pseudomonas syringae pv.syringae vì chúng mã hóa cho sự điều hòa và hình thành con đường tiết độc tố ở thực vật. Chúng được bảo tồn trong các chủng Pseudomonas syringae pv. syringae gây bệnh trên thực vật. Ngoài ra, Pseudomonas syringae pv.

syringare cũng sản sinh ra nhiều tác nhân gây độc khác như các polysaccharide ngoại bào, các độc tố thực vật, các enzyme phá hủy màng tế bào và các phytohormone [8]. Dựa trên phân tích 16sRNA, Pseudomonas syringae pv. syringae được đặt trong loài Pseudomonas syringae pv. syringae , là một trong các tác nhân gây bệnh quan trọng ở hơn 180 loài thực vật trên toàn thế giới, đặc biệt, chúng gây bệnh đốm nâu ở đậu với thiệt hại năng suất lên đến 55% ở Nam Phi [13].1: Độc tố thực vật sản xuất bởi vi khuẩn Pseudomonas spp Độc tố Vi sinh vật sản xuất Nhóm chất sinh tổng hợp P.

atropurpurea, glycinea,maculicola, Coronatine Polyketide morsprunorum, tomato Corpeptin P. corrugate Lipodepsipeptide Fuscopeptin P. fuscovaginae Lipodepsipeptide Persicomycins P. persicae Chất béo Phaseolotoxin P.

actinidiae, Sulfodiaminophosphinyl phaseolicola peptide Rhizobitoxine P. andropogonis Vinylglycine Syringomycins P. syringae, aptata, Lipodepsinonapeptide atrofaciens Syringopeptins P. syringae Lipodepsipeptide Tabtoxin P.

tabaci, β-Lactam coronafaciens, garcae Tolaasin P. tolaasii Lipodepsipeptide Viscosin P. Khả năng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp kháng nấm Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho rằng các chủng vi khuẩn Pseudomonas sp đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế các bệnh cây trồng [9, 15, 17]. Hiệu quả của một vi sinh vật kiểm soát sinh học trong nhà kính và trên đồng ruộng phụ thuộc vào sự sinh tổng hợp một hay nhiều chất đối ức chế sinh trưởng nấm [14].

Các chủng Pseudomonas sinh tổng hợp nhiều loại ức chế sinh khác nhau như phenazine [26, 27, ]. Henkes và cộng 7 sự công bố chủng P. fluorescens có khả năng ức chế hiệu quả với F. graminearum gây bệnh trên cây lúa mạch [1].

Năm 2012, Seema và cộng sự công bố chủng P.aeriginosa SD12 có khả năng sinh tổng hợp 1 hydrophenazine ức chế mạnh với nấm R. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và syringotoxin, có các đặc tính chống nấm tiềm năng. Syringomycin-E (SRE) là peptide phổ biến nhất. SRE diệt nấm A.

Khái quát về Syringomycin E 2. Đặc điểm cấu trúc, thành phần của SyrE Các syringomycin (SR) gồm A1, E và G, trong đó syringomycin E (SR- E) là nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất [22]. SR-E là một peptide tuần hoàn không phải ribosom [11]. SR-E có khối lượng phân tử là 1240 kDa.

SR-E được tạo ra do sự trao đổi chất thứ cấp của vi khuẩn P. syringae pv syringae. Cấu trúc của SR-E gồm một axit béo mạch dài không phân nhánh và chín axid amin khép vòng, ưa nước, tích điện dương. Trình tự axit amin của SR-E là Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Asp, được khép vòng tại nhóm β-carboxy của đầu cùng C và nhóm OH của đầu cùng N nhờ quá trình acetyl hóa được xúc tác bởi axit 3-hydroxydodecanoic[4; 21,].

Công thức cấu tạo của SR-E (Hình 2. Cấu trúc Syringomycin E [29] 8 Syringomycin E(SR-E) tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp, không tan trong ether và chloroform. Điểm đẳng điện ở pH 7 [23]. Hoạt tính kháng sinh của SR-E không bền trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và bền trong 1N HCl, bền ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím.

SR-E có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men. Khả năng kháng nấm men của SR-E tốt hơn nấm mốc. Tuy nhiên, chúng không có khả năng ức chế vi khuẩn [23]. Cụm gen syringomycin (syr) gồm một vùng trình tự DNA xấp xỉ 37kb của bộ gen P.syringae pv syringae.

Sáu khung đọc mở thuộc cụm gen syr được dự đoán là mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp (syrB1, syrB2, syrC và syrE), quá trình tiết SRE phụ thuộc vào syringomycin D (syrD) và quá trình điều hòa phụ thuộc vào syringomycin P (syrP) [16]. Đặc điểm nổi bật nhất của cụm gen Syr đó chính là sự xuất hiện của một khung đọc mở cực kì lớn (28.4kb) của gen SR-E. Phân tích trình tự axid amin đã chỉ ra rằng SR-E mã hóa cho một chuỗi peptide với khối lượng phân tử lên đến 1,039kDa với tám acid amin cấu thành.