Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Đối tượng, nội dung, phạm vi và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận. 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về Bacillus licheniformis 1. Phân bố Bacillus licheniformis Bacillus licheniformis (B.
licheniformis) thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất. Nó được tìm thấy trên dòng chim, đặc biệt là bộ dòng ngực và lưng và thường thấy nhất ở các loài chim sống trên mặt đất (như chim sẻ ) và các loài sống dưới nước (như vịt), B. licheniformis còn được tìm thấy và phân lập ở các suối nước nóng [49]. Đặc điểm hình thái Bacillus licheniformis B.
licheniformis là một vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt [13]. Ban đầu nó được đặt tên là Clostridium licheniformis bởi H. Weigmann và được Frederick D. Chester đổi tên thành B.
licheniformis TT01 là chủng vi khuẩn được phân lập từ phân chim cút ủ thô, tại Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng (Đoàn Thị Vân và cs. Đây là vi khuẩn gram dương, tế bào hình que, có kích thước 0,4 – 2,4 x 1,2 – 10 mm, khuẩn lạc có hình tròn, dẹt, mép có răng cưa, giữa khuẩn lạc có màu trắng đục xung quanh trắng trong, kích thước khuẩn lạc 1,2 – 2,7cm (sau 2 ngày cấy), sống trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ phát triển thích hợp là 35 - 500C, ở 370C tiết ra enzyme ngoại bào: amylase, protease, cellulose. licheniformis TT01 có khả năng đối kháng với Salmonella typhi ATCC 14028, E. Trong điều kiện môi trường bất lợi, nghèo dinh dưỡng thì nó cũng có khả năng tạo bào tử.
Những bào tử này khá chịu nhiệt, lạnh, bức xạ và các áp lực môi trường khác. Một tế bào chỉ có duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ, chịu được điều kiện bất lợi như nhiệt độ, acid, sự hình thành bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí (Ngô Xuân Mạnh, 2008). Dưới tác động của điều kiện tốt, những bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn thể hoạt động. licheniformis có thể tồn tại ở độ pH cao, điều kiện bất lợi với thời gian dài [43, 48].
licheniformis có khả năng sinh nano bạc: AgNPs tạo ra từ quá trình ủ sinh khối B. licheniformis TT01 với AgNO3 1mM, có kích thước nhỏ, có khả năng đối kháng cao với các chủng vi sinh vật gây hại E. AgNPs này có tiềm năng trong ứng dụng để xử lý nguồn thải từ phân chim cút, nhằm giảm mùi hôi chuồng trại, giảm thiểu khả năng gây ô nhiễm trường, giúp giảm thiểu dịch bệnh, hạn chế sự lạm dụng chất kháng sinh trong điều trị bệnh cho chim và sử dụng phân chim cút để sản xuất phân hữu cơ vi sinh, phục vụ sản xuất nông nghiệp sạch, nhằm đảm bảo sức khoẻ cho con người và phát triển nông nghiệp một cách bền vững tại Việt Nam [35, 37, 38, 43, 49]. 4 Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B.
licheniformis TT01 chịu tác động của nhiều yếu tố khác nhau, như: thành phần môi trường, độ pH,… trong đó nhiệt độ, ánh sáng và chế độ lắc cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót, cũng như đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn này [40, 41, 42]. Đặc tính sinh học Bacillus licheniformis B. licheniformis có khả năng sản sinh nhiều enzyme ngoại bào, đặc biệt là amylase và protease - 2 loại enzyme quan trọng thuộc hệ thống men tiêu hóa, sản sinh các enzyme có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, enzyme cellulase biến đổi chất sơ thành các loại đường dễ tiêu, lecithinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin, enzyme phân giải fibrin [35] [41]. licheniformis có khả năng sản sinh ra các loại enzyme ngoại bào như phytase, cellulase có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ.
licheniformis thuộc nhóm lợi khuẩn. Do đó việc bổ sung loại khuẩn này cho vật nuôi sẽ góp phần cân bằng hệ vi sinh có lợi cho đường ruột. licheniformis còn có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật có hại, nấm gây bệnh góp phần cải thiện hệ tiêu hóa vật nuôi. licheniformis đóng vai trò quan trọng trong ruột vì hoạt động trao đổi chất của chúng.
Loại khuẩn này có khả năng sản xuất kháng sinh để tổng hợp chất chống vi trùng, có tác dụng kháng khuẩn chống lại phổ rộng của mầm bệnh. Bào tử của Bacillus có khả năng chống lại các điều kiện môi trường như nhiệt độ khắc nghiệt, bức xạ, pH, áp suất và các tác nhân hóa học độc hại, do đó mang lại một số lợi thế về khả năng tồn tại và ổn định của chủng [36]. licheniformis TT01 sống trong điều kiện hiếu khí, nhiệt độ phát triển thích hợp là 35 - 500C, ở 370C tiết ra enzyme ngoại bào: amylase, protease, cellulose [34, 44]. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của B.
licheniformis, cũng như đặc tính sinh học của chúng bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt không hẳn là nhiệt độ thích hợp cho việc sinh enzyme ngoại bào hay khả năng kháng khuẩn [48]. Để phát triển mỗi một sinh vật phát triển trong một khoảng nhiệt độ nhất định. Ngoài khoảng nhiệt độ đó ra vi sinh vật sẽ bị hạn chế sự phát triển.
Trong nhiều tài liệu cho thấy rằng nhiều vi sinh vật có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ dài từ 80C đến 1400C. Tuỳ theo mức độ chịu nhiệt của chúng mà người ta có một số khái niệm như sau: 5 Nhiệt độ tối ưu: là nhiệt độ ở đó vi sinh vật phát triển thuận lợi nhất. Nhiệt độ cao nhất: là mức độ nhiệt độ giới hạn tối đa. Ở đó vi sinh vật vẫn phát triển nhưng hết sức chậm và yếu.
Nếu quá giới hạn đó thì vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt. Nhiệt độ thấp nhất: là mức độ nhiệt độ thấp mà vi sinh vật vẫn tồn tại, phát triển rất yếu. Nếu quá mức độ đó vi sinh vật sẽ bị tiêu diệt. Phần lớn vi sinh vật gây bệnh phát triển tốt ở nhiệt độ 35 - 370C.
Một số nấm men và nấm mốc nuôi cấy trong phòng thí nghiệm phát triển tốt ở 260C - 320C. Nhiệt độ thường gây cho vi sinh vật những chiều hướng sau đây. Đối với nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả năng chuyển hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt động của các hệ enzym, làm thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trường hợp vi sinh vật sẽ bị chết.
Khả năng gây chết của chúng hết sức từ từ chứ không xảy ra đột ngột như ở nhiệt độ cao. Dựa vào đặc tính này mà người ta tiến hành cất giữ thực phẩm ở nhiệt độ thấp, bảo quản giống vi sinh vật ở nhiệt độ thấp. Đối với nhiệt độ cao. Nhiệt độ cao thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng.
Đa số vi sinh vật bị chết ở 60 - 800C. Một số khá chết ở nhiệt độ cao hơn. Đặc biệt bào tử có khả năng tồn tại ở nhiệt độ lớn hơn 1000C. Nhiệt độ cao thường gây biến tính protein, làm hệ enzym lập tức không hoạt động được, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt.
Lợi dụng đặc điểm này, người ta tiến hành những phương pháp sấy khô thực phẩm, phương pháp thanh trùng. Như thanh trùng Pasteur, tiệt trùng Tindal, v. Theo quan hệ của vi sinh vật đối với nhiệt độ người ta chia ra làm những nhóm khác nhau. Ảnh hưởng của ánh sáng, chế độ lắc Ánh sáng và điều kiện lắc có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển, cũng như đặc tính sinh học của các chủng vi sinh vật.
Có thể có những chủng vi sinh vật ưa sáng, ngược lại cũng có những chủng ưa tối. Tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý của từng chủng vi sinh vật như kị khí, hiếu khí hay thiếu khí mà các nhà nghiên cứu sẽ lựa chọn các chế độ nuôi cấy khác nhau để phù hợp như: lắc/không lắc hoặc lắc với các chế độ khác nhau [48]. licheniformis TT01 có hoạt tính sinh học cao, phù hợp phát triển trong phân chim cút và thổ nhưỡng ở khu vực Quảng Nam, Đà Nẵng, cũng như vùng Duyên Hải Miền Trung. licheniformis TT01 có tiềm năng trong việc ứng dụng để xử lý phụ phẩm chăn nuôi chim cút trực tiếp trong chuồng trại.
Ứng dụng của Bacillus licheniformis trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp a. Ứng dụng trong nước Vi khuẩn B. licheniformis được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp để sản 6 xuất các enzyme protease, α-amylase, penicillinase, pentosanase, β-mannanase, cyclo glucosyltransferase và kháng sinh tạo chất kháng sinh để tiêu diệt một số vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Làm mất mùi hôi của phân chuồng và ức chế sinh trưởng các vi sinh vật gây thối.
Bên cạnh đó cũng đã có nghiên cứu về khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào của B. licheniformis của các loại enzyme bền nhiệt amylase, cellulase, protease [20]. Nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và Ngô Thị Kim Toán cho thấy B. licheniformis có khả năng tạo màng biofilm và tích lũy photpho trong việc xử lý nguồn nước thải giúp giảm ô nhiễm môi trường đặc biệt là ô nhiễm nước thải có chứa các hợp chất photpho [6].licheniformis được sử dụng trong sản xuất men vi sinh, bảo quản thực phẩm [17].licheniformis còn có thể tạo ra nhiều chế phẩm vi sinh hỗ trợ trong nông nghiệp, chăn nuôi, xử lý nước nuôi tôm, chế phẩm vi sinh [10].
licheniformis có thể tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên kháng lại một số vi sinh vật gây hại, giúp cải thiện bệnh tiêu chảy và tỉ lệ chết non ở vật nuôi.licheniformis có khả năng phân hủy các chất carbohydrate, chất béo, chất đạm nhờ quá trình tiết ra một số loại enzyme như phytase, protease, amylase,… từ đó chúng có thể phân hủy được các chất thải hữu cơ tích lũy trong các ao nuôi, làm giảm nồng độ các khí độc, giảm vi sinh vật gây bệnh quá mức, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường nuôi giúp tăng năng suất trong nuôi trồng [32, 38]. Ứng dụng trên thế giới B. licheniformis góp phần ổn định hệ vi sinh có ích cho đường ruột, có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm và gram dương, nấm gây bệnh. licheniformis có khả năng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn gây hại khác.