Luận án nghiên cứu Bacillus thuringiensis để phát triển chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh Diptera

Bacillus thuringiensis (Bt) là một loại vi khuẩn đất nổi bật với khả năng sản sinh ra các protein tinh thể độc có khả… 175 trang · Đại học Phương Đông · 2018.

• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Đình Bính
• Trường học: Đại học Phương Đông
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu Bacillus thuringiensis cho chế phẩm diệt côn trùng Diptera
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis
• 1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis
• 1.4. Đặc điểm phân loại. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng
• 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp độc tố của vi khuẩn B.
• 1.7. Nhu cầu dinh dưỡng của Bacillus thuringiensis
• 1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector
• 2.4. Môi trường nuôi cấy
• 2.5. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp vi sinh
• 2.6.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.6.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.6.4. Tối ưu hóa môi trường lên men theo phương pháp đáp ứng bề mặt
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis
• 3.2. Phân lập các chủng Bacillus
• 3.3. Nghiên cứu protein tinh thể
• 3.4. Phân loại dưới loài các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
• 3.5. Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
• 3.6. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập
• 3.7. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR
• 3.8. Tách dòng và đọc trình tự gen cry2A
• 3.9. Biểu hiện gen
• 3.10. Nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu hiện gen
• 3.11. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin
• 3.12. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8
• 3.13. Lựa chọn môi trường và tối ưu lên men làm tăng khả năng hình thành protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8
• 3.14. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8
• 3.15. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trưởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8
• 3.16. Tối ưu hóa môi trường lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia
• 3.17. Nghiên cứu tạo chế phẩm
• 3.18. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng, hình thành bào tử và sinh tinh thể độc của chủng MSS8
• 3.19. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƯỢC CÔNG BỐ
• LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là một loại vi khuẩn đất nổi bật với khả năng sản sinh ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng, đặc biệt là các loài thuộc bộ hai cánh (Diptera). Vi khuẩn này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp như một biện pháp sinh học để kiểm soát côn trùng gây hại mà không gây hại cho con người và môi trường. Nghiên cứu cho thấy rằng các protein độc này, như protein cry, có khả năng tác động lên hệ thống tiêu hóa của côn trùng, dẫn đến cái chết của chúng. Việc sử dụng Bacillus thuringiensis trong sản xuất chế phẩm diệt côn trùng không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực của hóa chất lên môi trường.

1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng

Lịch sử nghiên cứu về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ cuối thế kỷ 19, khi Louis Pasteur phát hiện ra vi khuẩn này. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định khả năng diệt côn trùng của nó. Năm 1930, chế phẩm đầu tiên từ Bt được sản xuất để diệt sâu hại lúa mì. Qua nhiều thập kỷ, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Bacillus thuringiensis có thể diệt nhiều loại côn trùng khác nhau, bao gồm cả muỗi và ruồi, nhờ vào các protein độc tố mà nó sản sinh. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc ứng dụng Bt trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả.

II. Đặc điểm sinh học của Bacillus thuringiensis

Các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng sinh sản và phát triển trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng có thể tồn tại dưới dạng bào tử, giúp chúng chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt. Đặc điểm nổi bật của Bt là khả năng sản sinh ra các protein độc tố, như cry1, cry2, có tác dụng diệt côn trùng. Các protein này được hình thành dưới dạng tinh thể và chỉ hoạt động khi được tiêu hóa bởi côn trùng. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp các protein độc này. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả sản xuất chế phẩm diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Bacillus thuringiensis. Đặc biệt, pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này thường nằm trong khoảng 6-7. Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng, với nhiệt độ tối ưu thường là 30-37 độ C. Việc điều chỉnh các yếu tố này trong môi trường nuôi cấy có thể giúp tăng cường khả năng sinh tổng hợp protein độc, từ đó nâng cao hiệu quả của chế phẩm diệt côn trùng.

III. Ứng dụng Bacillus thuringiensis trong nông nghiệp

Việc ứng dụng Bacillus thuringiensis trong nông nghiệp đã mang lại nhiều lợi ích. Chế phẩm từ Bt không chỉ giúp kiểm soát côn trùng gây hại mà còn bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Các nghiên cứu cho thấy rằng chế phẩm diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis có thể giảm thiểu sự phát triển của côn trùng gây hại mà không gây ra tác động tiêu cực đến các loài sinh vật có ích khác. Hơn nữa, việc sử dụng Bt còn giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào các loại thuốc trừ sâu hóa học, từ đó góp phần bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững.

3.1. Tác động đến môi trường

Sử dụng chế phẩm từ Bacillus thuringiensis có tác động tích cực đến môi trường. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm này không gây hại cho các loài sinh vật có ích như ong, bướm và các loài động vật khác. Hơn nữa, việc giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu hóa học giúp bảo vệ nguồn nước và đất, từ đó duy trì sự cân bằng sinh thái. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường sống cho các thế hệ tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nghiên cứu được thực hiện nhằm giải quyết yêu cầu thực tiễn về việc kiểm soát các loài côn trùng gây hại thuộc bộ Hai cánh (Diptera), đặc biệt là ruồi nhà (Musca domestica) và các loài muỗi truyền bệnh (Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Culex tritaeniorhynchus). Các biện pháp hóa học hiện nay bộc lộ nhiều hạn chế do chi phí cao, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và hiện tượng kháng thuốc ở côn trùng. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là tác nhân sinh học có khả năng tạo protein tinh thể độc diệt côn trùng với độ an toàn cao đối với người và sinh vật có ích. Khoảng trống nghiên cứu được luận án tập trung giải quyết là việc thiếu hụt các nghiên cứu có hệ thống về chủng Bacillus thuringiensis bản địa mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh tại Việt Nam, cũng như việc tìm kiếm nguồn cơ chất rẻ tiền từ phế thải công nghiệp nhằm hạ giá thành sản xuất chế phẩm sinh học.

Hệ thống mục tiêu của luận án được xác định cụ thể như sau:

Mục tiêu chung: Tuyển chọn được chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch được protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ Hai cánh trong vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất được chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ nguồn bã thải của nhà máy bia.

Mục tiêu cụ thể:

1. Thu thập và sàng lọc được chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt Nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ Hai cánh và xác định được trình tự nucleotide của gen cry2A này.
2. Biểu hiện và tinh sạch được protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E. coli.
3. Tìm ra được phương pháp xử lý bã malt bia làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis khi sử dụng bã malt bia làm môi trường nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm; đồng thời đánh giá được sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ Hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis tuyển chọn trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập từ mẫu đất và lá tại Việt Nam; gen cry2A và protein tái tổ hợp rCry2A; bã malt bia từ nhà máy sản xuất bia; ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica).
• Phạm vi không gian: Mẫu đất và lá được thu thập tại 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam; các thí nghiệm chuyên sâu thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Công nghệ Môi trường.
• Phạm vi đối tượng sinh học: Khảo sát tập trung vào chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 và đánh giá hoạt tính sinh học trên ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis trên thế giới và tại Việt Nam:

• Lịch sử nghiên cứu thế giới: Louis Pasteur phát hiện vi khuẩn gây bệnh ở tằm (Bacillus bombyces, 1870); Sigetane Ishiwata phát hiện Bacillus soto (1901); Berliner phân lập vi khuẩn từ sâu Anagasta kuhniella và đặt tên Bacillus thuringiensis (1911, 1915). Chế phẩm BT thương mại đầu tiên xuất hiện tại Pháp năm 1938. Hannay và Fitzjame (1953) xác định bản chất protein của thể vùi; Angus (1956) chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể độc. De Barjac và Bonnefoi (1962, 1973) thiết lập hệ thống phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên H. Goldberg và Margarit (1977) phát hiện B. israelensis có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi và muỗi. Năm 1981, gen mã hóa protein tinh thể đầu tiên được tách dòng và giải trình tự.
• Cấu trúc và cơ chế độc tố: Morse và cộng sự (2001), Li và cộng sự (1991), Galitsky và cộng sự (2001), Boonserm và cộng sự (2005, 2006) làm sáng tỏ cấu trúc tinh thể tia X của các protein Cry (Cry1Aa, Cry2Aa, Cry3Aa, Cry4Aa, Cry4Ba). Độc tố Cry gồm 3 vùng chức năng (Domain I, II, III). Winder và Whiteley (1989) nghiên cứu tách dòng các gen cry2A và cry2B.
• Cơ chất lên men từ phế phụ phẩm: Các nghiên cứu tận dụng bùn thải sinh học (Maria và cs., 2001), bột lông vũ (Subbiah và cs., 2012), giá thể nấm sau thu hoạch (Songqing và cs., 2014) làm môi trường lên men Bt.
• Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Trải qua 3 giai đoạn chính từ năm 1971 với các công trình của Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, Võ Thị Thứ, Lê Thị Thu Hiền, Phan Tường Lộc. Năm 1998, bộ 34 kháng huyết thanh H được ứng dụng để phân loại; các gen cry1, cry4A được tách dòng và biểu hiện trong E. coli.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn: Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào các chủng Bt diệt côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) mang gen cry1 hoặc diệt muỗi mang gen cry4. Việc nghiên cứu một cách bài bản từ phân lập, định danh huyết thanh, tách dòng, biểu hiện gen cry2A từ chủng bản địa (B. thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4) có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh, kết hợp giải pháp công nghệ sử dụng phế thải bã malt bia làm môi trường lên men chưa được thực hiện đầy đủ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm

• Cơ chế tác động của độc tố Cry: Tinh thể protein tan trong môi trường kiềm ruột giữa côn trùng $\rightarrow$ protease (trypsin/chymotrypsin) cắt bỏ đoạn đầu C để tạo độc tố hoạt hóa $\rightarrow$ Vùng II và III gắn đặc hiệu với thụ thể màng tế bào biểu mô $\rightarrow$ Vùng I với cấu trúc bó xoắn $\alpha$ chèn vào màng hình thành kênh ion (lỗ rò đại phân tử) làm mất cân bằng thẩm thấu, ly giải tế bào ruột dẫn đến côn trùng tử vong (Grochulski và cs., 1995; Jurat-Fuentes và cs., 2002; Canh và cs., 2004).
• Hệ thống biểu hiện gen dị phân: Sử dụng vector pET-22b(+) chứa promoter T7 mạnh, kiểm soát bởi chất cảm ứng Isopropyl-$\beta$-D-thiogalactoside (IPTG), có đoạn mã hóa đuôi 6xHistidine (His-Tag) ở đầu C để hỗ trợ tinh sạch protein qua sắc ký ái lực ion kim loại cố định ($Ni^{2+}$).
• Quy hoạch thực nghiệm: Ứng dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) với mô hình hồi quy bậc hai nhằm tối ưu hóa các yếu tố dinh dưỡng môi trường lên men.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp vi sinh học:
  • Phân lập vi khuẩn Bt từ đất và lá cây thu thập tại 7 vùng sinh thái; nuôi cấy trên môi trường MPA, LB ở nhiệt độ 28–30°C.
  • Quan sát hình thái tế bào, bào tử và thể tinh thể dưới kính hiển vi đối pha ở độ phóng đại 10.000 lần.
  • Phân loại dưới loài bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên tiêm mao H với 34 bộ kit kháng huyết thanh chuẩn.
• Phương pháp sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để sàng lọc sự hiện diện của gen cry2A.
  • Tách dòng gen vào vector, biến nạp vào tế bào vi khuẩn, kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc và cắt giới hạn bằng enzyme BamHI và XhoI.
  • Giải trình tự nucleotide của gen cry2A; phân tích so sánh độ tương đồng bằng công cụ tin sinh học (GenBank BLAST) và mô phỏng cấu trúc protein 3D.
• Phương pháp hóa sinh và biểu hiện protein:
  • Biểu hiện protein tái tổ hợp rCry2A trong chủng vật chủ E. coli BL21 (DE3); khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng.
  • Kiểm tra sự biểu hiện protein bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,6% và kỹ thuật Western blot.
  • Tinh sạch protein rCry2A có gắn đuôi His-Tag bằng cột sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin ($Ni^{2+}$).
• Phương pháp công nghệ lên men và tối ưu hóa:
  • Xử lý cơ chất bã malt bia bằng phương pháp thủy phân để tạo dịch thủy phân bã bia (DTPBB).
  • Khảo sát các yếu tố dinh dưỡng đơn lẻ bổ sung vào DTPBB: nguồn đạm hữu cơ (bột đậu tương), muối khoáng ($MgSO_4$, $MnSO_4$), pH ban đầu và nhiệt độ lên men.
  • Thiết kế ma trận thực nghiệm và phân tích thống kê bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Design-Expert 10.
• Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học (Bioassay):
  • Đánh giá tỷ lệ gây chết của protein tinh thể tự nhiên, protein tái tổ hợp rCry2A và chế phẩm BT đối với ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện trường.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết cơ sở lý luận về phân loại học, hệ gen, cấu trúc độc tố và công nghệ sản xuất Bacillus thuringiensis.

Độc tố Cry đại diện	Đối tượng côn trùng đặc trưng	Tổng số axit amin tồn dư	Vùng bảo thủ hiện diện	% Tương đồng trình tự với Cry1Aa	% Tương đồng trình tự với Cry2Aa	% Tương đồng trình tự với Cry3Aa	% Tương đồng trình tự với Cry4Ba
Cry1Aa	Lepidoptera	577	1, 2, 3, 4, 5	100%	23%	39%	30%
Cry2Aa	Diptera / Lepidoptera	584	1, 2	23%	100%	21%	20%
Cry3Aa	Coleoptera	584	1, 2, 3, 4, 5	39%	21%	100%	36%
Cry4Ba	Diptera	558	1, 2, 3, 4, 5	30%	20%	36%	100%

Bảng tổng hợp đặc điểm cấu trúc một số protein Cry theo tinh thể học tia X (Boonserm và cs., 2006).

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Bt được tổng kết qua các môi trường lên men truyền thống sử dụng bột đậu tương (18,0–40,0 g/l), bột ngô, nước ngâm ngô, glucose (10,0–45,0 g/l), rỉ đường cùng các muối vô cơ ($KH_2PO_4$, $CaCO_3$, $(NH_4)_2SO_4$). Tác giả cũng phân tích đặc điểm vòng đời ruồi nhà (Musca domestica) qua 4 giai đoạn: trứng (dài 1 mm), ấu trùng (dòi, qua 3 lần lột xác đạt 10–12 mm), nhộng (dài 6 mm) và cá thể trưởng thành; đồng thời tổng kết các giai đoạn phát triển dưới nước của muỗi.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, hóa chất, thiết bị và các quy trình phân tích được sử dụng trong luận án:

• Vật liệu sinh học: Các chủng Bt bản địa (trong đó có chủng MSS8.4, LNT7.44); chủng E. coli BL21 (DE3); vector biểu hiện pET-22b(+) (kích thước 5493 bp mang promoter T7, gen kháng ampicillin, lac operator và trình tự His-Tag).
• Hóa chất và dung dịch: Dung dịch đệm TE, môi trường LB, môi trường MPA, chất cảm ứng IPTG, cơ chất X-gal, ethidium bromide (EtBr), bovine serum albumin (BSA), gel polyacrylamide, hóa chất nhuộm màu và dung dịch thôi cột sắc ký.
• Quy trình thí nghiệm: Thiết lập điều kiện phản ứng PCR khuếch đại gen cry2A; quy trình cắt và nối DNA tái tổ hợp bằng enzym giới hạn BamHI và XhoI; quy trình tách dòng và kiểm tra thể biến nạp; kỹ thuật điện di SDS-PAGE 12,6% và Western blot; thiết kế ma trận thực nghiệm RSM trên phần mềm Design-Expert 10; phương pháp lên men chìm, thu sinh khối và đông khô tạo chế phẩm dạng bột thấm ướt (WP).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình nghiên cứu:

• Phân lập và định danh: Thu thập mẫu đất và lá tại 7 vùng địa lý sinh thái của Việt Nam. Phân lập được các chủng Bt có khả năng sinh tinh thể protein độc hình quả trám, hình tròn hoặc hình trứng dưới kính hiển vi đối pha (10.000x). Kết quả phân loại bằng phản ứng ngưng kết huyết thanh H và sàng lọc PCR đã xác định được 7 chủng mang gen cry2A, trong đó chủng ký hiệu MSS 8.4 thuộc thứ loài B. thuringiensis serovar kurstaki thể hiện hiệu lực kháng côn trùng bộ Hai cánh rõ rệt.
• Tách dòng và biểu hiện gen cry2A: Gen cry2A từ chủng MSS 8.4 được tách dòng thành công vào vector pET-22b(+) sau khi cắt kiểm tra bằng hai enzyme BamHI và XhoI. Trình tự nucleotide của gen được giải mã và so sánh với dữ liệu GenBank quốc tế; trình tự axit amin suy diễn được phân tích để thiết lập cây quan hệ phát sinh loài và xây dựng mô hình cấu trúc không gian 3D của protein Cry2Aa từ chủng MSS 8.4.
• Tối ưu hóa biểu hiện và tinh sạch protein rCry2A: Quá trình biểu hiện protein rCry2A trong E. coli BL21 (DE3) được khảo sát ở các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau. Sản phẩm protein được phân tích trên gel SDS-PAGE 12,6% và khẳng định bằng Western blot. Protein tái tổ hợp rCry2A được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin. Thử nghiệm sinh học cho thấy cả protein tinh thể tự nhiên từ chủng MSS 8.4 và protein tái tổ hợp rCry2A đều có hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica).
• Nghiên cứu cơ chất bã bia và tối ưu hóa môi trường lên men:
  • Đánh giá thành phần hóa học của dịch thủy phân bã bia (DTPBB) và ảnh hưởng của tỷ lệ DTPBB đến sinh trưởng, sinh tổng hợp protein tinh thể của chủng MSS 8.4.
  • Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố bổ sung: bột đậu tương (nguồn đạm hữu cơ), muối $MgSO_4$ và $MnSO_4$ (khoáng chất kích thích sinh tổng hợp độc tố), nhiệt độ nuôi cấy và pH ban đầu (dao động từ pH 5,8 đến trên 8,0 sau 48 giờ lên men).
  • Sử dụng phần mềm Design-Expert 10 để phân tích hồi quy và xây dựng đồ thị bề mặt đáp ứng, xác định nồng độ tối ưu của các thành phần môi trường nhằm đạt hàm lượng protein tinh thể cao nhất sau 48 giờ lên men.
• Nghiên cứu tạo chế phẩm và thử nghiệm thực tế:
  • Quy trình lên men chìm được vận hành trên thiết bị lên men pilot, thu nhận sinh khối vi khuẩn và tiến hành đông khô.
  • Phối chế các công thức chế phẩm BT dạng bột thấm ướt (WP).
  • Kết quả thử nghiệm hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) của chế phẩm BT cho thấy hiệu quả diệt dòi cao ở cả quy mô phòng thí nghiệm và các điểm thử nghiệm ngoài hiện trường.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt lý luận và thực tiễn

1. Phân lập và tuyển chọn được 7 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera).
2. Là công trình nghiên cứu có hệ thống tại Việt Nam về gen cry2A từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 phân lập trong nước, chứng minh khả năng diệt côn trùng bộ Hai cánh phục vụ định hướng phát triển thuốc trừ sâu sinh học.
3. Bổ sung dữ liệu trình tự nucleotide và đặc tính sinh học của nguồn gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis Việt Nam vào cơ sở dữ liệu chung.
4. Xây dựng quy trình xử lý bã malt bia – phụ phẩm công nghiệp ngành sản xuất đồ uống – làm nguồn dinh dưỡng (cacbon, nitơ, khoáng chất) thay thế các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền trong công nghệ lên men sản xuất chế phẩm sinh học BT.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng quy trình công nghệ lên men từ bã malt bia ở quy mô bán công nghiệp và công nghiệp nhằm tận dụng phế phụ phẩm, giảm phát thải ô nhiễm và hạ giá thành chế phẩm sinh học.
• Đề xuất mở rộng các thử nghiệm sinh học đối với chế phẩm BT từ chủng MSS 8.4 trên các đối tượng côn trùng bộ Hai cánh khác trong thực tế dịch tễ học và nông nghiệp, đặc biệt là ấu trùng các loài muỗi truyền bệnh (Aedes, Culex, Anopheles) và ruồi đục quả.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Thử nghiệm hoạt tính sinh học và khảo sát hiệu lực thực địa của chế phẩm BT trong luận án chủ yếu tập trung đánh giá trên ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica); các loài côn trùng bộ Hai cánh khác như muỗi mới được tiếp cận ở phạm vi tổng quan lý thuyết và định hướng mục tiêu. Dữ liệu hiện trường mới dừng lại ở các thử nghiệm bước đầu trên diện hẹp.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  1. Mở rộng đánh giá hiệu lực diệt ấu trùng muỗi (Aedes aegypti, Culex tritaeniorhynchus, Anopheles gambiae) của protein tinh thể từ chủng MSS 8.4 và protein rCry2A.
  2. Nghiên cứu nâng cao tính ổn định, thời gian bảo quản và độ bám dính của chế phẩm dạng bột thấm ướt ngoài đồng ruộng và bãi rác thải.
  3. Hoàn thiện dây chuyền công nghệ lên men quy mô lớn hơn để chuyển giao sản xuất thương mại.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm từ phân lập vi sinh vật bản địa, định danh huyết thanh H, sàng lọc PCR, tách dòng biểu hiện gen dị phân trong E. coli bằng hệ vector pET, đến kỹ thuật tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin và mô hình hóa bề mặt đáp ứng RSM (Design-Expert 10).
• Đối với giảng viên và nhà nghiên cứu bảo vệ thực vật: Luận án là tài liệu tham khảo về phân loại các nhóm độc tố Bacillus thuringiensis (Cry, Cyt, Vip), cơ chế phân tử của độc tố tinh thể 3 domain và tương tác giữa độc tố với thụ thể tế bào ruột côn trùng.
• Đối với doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: Cung cấp giải pháp kỹ thuật về việc tái sử dụng bã thải nhà máy bia làm môi trường lên men, giúp giảm chi phí sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phục vụ nông nghiệp hữu cơ và vệ sinh môi trường.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis nào được lựa chọn nghiên cứu chuyên sâu trong luận án và thuộc phân loài nào?
Chủng được tuyển chọn để nghiên cứu chuyên sâu là chủng ký hiệu MSS 8.4, được phân loại thuộc thứ loài Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh.

2. Độc tố Cry2A có đặc điểm cấu trúc và phổ hoạt tính như thế nào so với các độc tố Cry khác?
Protein Cry2A có khối lượng phân tử khoảng 70–71 kDa, gồm 3 vùng chức năng (Domain I, II, III). Khác với Cry2B và Cry2C chỉ gây độc cho côn trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera), Cry2A có hoạt tính diệt đồng thời cả côn trùng bộ Cánh vảy và bộ Hai cánh (Diptera).

3. Hệ thống vector và tế bào chủ nào được sử dụng để biểu hiện gen cry2A tái tổ hợp?
Luận án sử dụng vector biểu hiện pET-22b(+) (chứa promoter T7 và đoạn mã hóa đuôi 6xHis-Tag) và tế bào chủ là vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21 (DE3), được cảm ứng biểu hiện bằng IPTG và tinh sạch qua cột sắc ký ái lực ProBond Nickel Resin ($Ni^{2+}$).

4. Phế phụ phẩm công nghiệp nào được sử dụng làm môi trường lên men và các yếu tố dinh dưỡng nào được tối ưu hóa?
Bã malt bia từ nhà máy sản xuất bia được thủy phân thành dịch thủy phân bã bia (DTPBB) làm nguồn cơ chất chính. Các yếu tố được khảo sát và tối ưu hóa bằng phần mềm Design-Expert 10 gồm: nồng độ bột đậu tương bổ sung, nồng độ muối khoáng $MgSO_4$ và $MnSO_4$, pH ban đầu và nhiệt độ lên men.

5. Hoạt tính sinh học của chủng vi khuẩn và chế phẩm BT được đánh giá chủ yếu trên loài côn trùng nào?
Hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp rCry2A, protein tinh thể tự nhiên và chế phẩm BT (dạng đông khô, bột thấm ướt) được đánh giá trực tiếp trên ấu trùng (dòi) của loài ruồi nhà (Musca domestica) ở cả quy mô phòng thí nghiệm và thực địa.

---

Kết luận

Luận án đã phân lập, định danh và tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn bản địa Bacillus thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ Hai cánh. Công trình đã thực hiện tách dòng, giải trình tự, biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rCry2A trong E. coli BL21 và tinh sạch qua sắc ký ái lực. Đồng thời, nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình công nghệ tận dụng phế thải bã malt bia để lên men sản xuất chế phẩm sinh học BT có hiệu lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Càng ngày thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày càng cao. Không những thế thuốc trừ sâu sinh học BT còn có những ƣu điểm rất vƣợt trội từ việc khắc phục đƣợc tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại, không ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời.

Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với số lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho ngƣời.

Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bảncòn ruồi là tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae,lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus). Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi.

Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của các 1 chủng Bacillus thuringiensisphân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)” 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.

Mục tiêu chung Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự nucleotide của gen cry2A này. - Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.

- Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B.