Luận án nghiên cứu Bacillus thuringiensis để phát triển chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh Diptera

Chuyên khảo phân tích Luận án nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Người hướng dẫn: PGS. Ngô Đình Bính
• Trường học: Đại học Phương Đông
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu Bacillus thuringiensis cho chế phẩm diệt côn trùng Diptera
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis
• 1.3. Vị trí, đặc điểm hình thái và sinh thái học Bacillus thuringiensis
• 1.4. Đặc điểm phân loại. Hệ gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
• 1.5. Đặc điểm protein độc tố diệt côn trùng
• 1.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp độc tố của vi khuẩn B.
• 1.7. Nhu cầu dinh dưỡng của Bacillus thuringiensis
• 1.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn B. thuringiensis ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Cặp mồi khuếch đại gen cry2A và hệ vector
• 2.4. Môi trường nuôi cấy
• 2.5. Địa điểm và thời gian thực hiện thí nghiệm
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp vi sinh
• 2.6.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.6.3. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.6.4. Tối ưu hóa môi trường lên men theo phương pháp đáp ứng bề mặt
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và lựa chọn chủng hiệu lực kháng côn trùng bộ hai cánh từ các chủng Bacillus thuringiensis
• 3.2. Phân lập các chủng Bacillus
• 3.3. Nghiên cứu protein tinh thể
• 3.4. Phân loại dưới loài các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
• 3.5. Đánh giá khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh của các chủng phân lập
• 3.6. Khẳng định sự có mặt của cry2A liên quan tới tính trạng diệt côn trùng bộ hai cánh ở các chủng phân lập
• 3.7. Phát hiện gen cry2A từ các chủng Bacillus thuringiensis đã phân loại huyết thanh bằng phương pháp PCR
• 3.8. Tách dòng và đọc trình tự gen cry2A
• 3.9. Biểu hiện gen
• 3.10. Nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu hiện gen
• 3.11. Tinh chế protein tái tổ hợp bằng cột sắc kí ái lực Probond Nikel Resin
• 3.12. Hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh của rCry2A và chủng MSS8
• 3.13. Lựa chọn môi trường và tối ưu lên men làm tăng khả năng hình thành protein tinh thể của chủng vi khuẩn MSS8
• 3.14. Xử lý bã bia làm nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn MSS8
• 3.15. Đánh giá tác động độc lập của các yếu tố dinh dưỡng bổ sung vào dịch thủy phân bã bia đến sinh trưởng và sinh tinh thể độc của vi khuẩn MSS8
• 3.16. Tối ưu hóa môi trường lên men cho vi khuẩn MSS8.4 từ nguồn bã bia
• 3.17. Nghiên cứu tạo chế phẩm
• 3.18. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng, hình thành bào tử và sinh tinh thể độc của chủng MSS8
• 3.19. Kết quả thử nghiệm chế phẩm BT với ấu trùng ruồi nhà
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐƯỢC CÔNG BỐ
• LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) là một loại vi khuẩn đất nổi bật với khả năng sản sinh ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng, đặc biệt là các loài thuộc bộ hai cánh (Diptera). Vi khuẩn này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp như một biện pháp sinh học để kiểm soát côn trùng gây hại mà không gây hại cho con người và môi trường. Nghiên cứu cho thấy rằng các protein độc này, như protein cry, có khả năng tác động lên hệ thống tiêu hóa của côn trùng, dẫn đến cái chết của chúng. Việc sử dụng Bacillus thuringiensis trong sản xuất chế phẩm diệt côn trùng không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực của hóa chất lên môi trường.

1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng

Lịch sử nghiên cứu về Bacillus thuringiensis bắt đầu từ cuối thế kỷ 19, khi Louis Pasteur phát hiện ra vi khuẩn này. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác định khả năng diệt côn trùng của nó. Năm 1930, chế phẩm đầu tiên từ Bt được sản xuất để diệt sâu hại lúa mì. Qua nhiều thập kỷ, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Bacillus thuringiensis có thể diệt nhiều loại côn trùng khác nhau, bao gồm cả muỗi và ruồi, nhờ vào các protein độc tố mà nó sản sinh. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã mở ra nhiều cơ hội mới cho việc ứng dụng Bt trong nông nghiệp, đặc biệt là trong việc phát triển các chế phẩm sinh học an toàn và hiệu quả.

II. Đặc điểm sinh học của Bacillus thuringiensis

Các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng sinh sản và phát triển trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng có thể tồn tại dưới dạng bào tử, giúp chúng chịu đựng được các điều kiện khắc nghiệt. Đặc điểm nổi bật của Bt là khả năng sản sinh ra các protein độc tố, như cry1, cry2, có tác dụng diệt côn trùng. Các protein này được hình thành dưới dạng tinh thể và chỉ hoạt động khi được tiêu hóa bởi côn trùng. Nghiên cứu cho thấy rằng các yếu tố như pH, nhiệt độ và thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp các protein độc này. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả sản xuất chế phẩm diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các yếu tố như pH, nhiệt độ và nồng độ dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của Bacillus thuringiensis. Đặc biệt, pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này thường nằm trong khoảng 6-7. Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng, với nhiệt độ tối ưu thường là 30-37 độ C. Việc điều chỉnh các yếu tố này trong môi trường nuôi cấy có thể giúp tăng cường khả năng sinh tổng hợp protein độc, từ đó nâng cao hiệu quả của chế phẩm diệt côn trùng.

III. Ứng dụng Bacillus thuringiensis trong nông nghiệp

Việc ứng dụng Bacillus thuringiensis trong nông nghiệp đã mang lại nhiều lợi ích. Chế phẩm từ Bt không chỉ giúp kiểm soát côn trùng gây hại mà còn bảo vệ sức khỏe con người và môi trường. Các nghiên cứu cho thấy rằng chế phẩm diệt côn trùng từ Bacillus thuringiensis có thể giảm thiểu sự phát triển của côn trùng gây hại mà không gây ra tác động tiêu cực đến các loài sinh vật có ích khác. Hơn nữa, việc sử dụng Bt còn giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào các loại thuốc trừ sâu hóa học, từ đó góp phần bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững.

3.1. Tác động đến môi trường

Sử dụng chế phẩm từ Bacillus thuringiensis có tác động tích cực đến môi trường. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm này không gây hại cho các loài sinh vật có ích như ong, bướm và các loài động vật khác. Hơn nữa, việc giảm thiểu sử dụng thuốc trừ sâu hóa học giúp bảo vệ nguồn nước và đất, từ đó duy trì sự cân bằng sinh thái. Việc phát triển các chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis không chỉ mang lại lợi ích kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường sống cho các thế hệ tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự bùng phát của các loài côn trùng thuộc bộ Hai cánh (Diptera)—đặc biệt là ruồi nhà (Musca domestica) và các vector truyền bệnh nguy hiểm như muỗi Aedes aegypti (sốt xuất huyết), Anopheles gambiae (sốt rét), Culex tritaeniorhynchus (viêm não Nhật Bản)—đang đặt ra thách thức nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng và an toàn sinh học toàn cầu. Trong nhiều thập kỷ qua, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp (như nhóm phospho hữu cơ, carbamate, pyrethroid) đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc lan rộng, ô nhiễm môi trường đất, nước và tiêu diệt các loài thiên địch có ích. Trong bối cảnh đó, trực khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)—loài vi khuẩn Gram dương sinh bào tử có khả năng tổng hợp các thể vùi protein tinh thể độc (Insecticidal Crystal Proteins - ICPs)—nổi lên như một giải pháp sinh học an toàn và đặc hiệu nhất (Sanahuja et al., 2011; Osman et al., 2015).

Mặc dù các chế phẩm Bt thương mại (chủ yếu từ phân loài kurstaki HD-1 hoặc israelensis) đã chiếm tới 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học toàn cầu, việc ứng dụng tại các quốc gia nhiệt đới như Việt Nam vẫn đối mặt với hai rào cản cốt lõi: sự hạn chế về cơ sở dữ liệu các chủng bản địa mang gen độc tố kép và chi phí sản xuất lên men công nghiệp còn cao do phụ thuộc vào các môi trường tổng hợp đắt tiền. Luận án tiến sĩ với đề tài "Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)" đã giải quyết trọn vẹn khoảng trống nghiên cứu (research gap) này thông qua việc thiết lập một chuỗi nghiên cứu tích hợp từ sàng lọc di truyền học phân tử, giải mã cấu trúc gen cry2A, biểu hiện protein tái tổ hợp rCry2A, đến kỹ thuật công nghệ sinh học lên men tận dụng phụ phẩm công nghiệp bã malt bia.

Câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Mức độ đa dạng di truyền và phổ hoạt tính kháng côn trùng Diptera của các chủng Bacillus thuringiensis bản địa thu thập tại 7 vùng sinh thái địa lý của Việt Nam phân bố như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cấu trúc phân tử của gen cry2A phân lập từ chủng ưu việt B. thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4 có những đặc trưng cấu trúc nào và protein tái tổ hợp rCry2A biểu hiện trong Escherichia coli có duy trì hoạt tính sinh học đặc hiệu tương đương protein tự nhiên hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Quy trình xử lý và phối chế cơ chất phụ phẩm bã malt bia (brewery spent grain) kết hợp phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) có thể tối ưu hóa sinh khối và hàm lượng protein tinh thể đạt hiệu lực diệt ấu trùng ruồi nhà quy mô pilot và thực địa hay không?
• Giả thuyết khoa học 1 (H1): Quần thể Bt bản địa tại Việt Nam lưu trữ các biến thể gen cry2A có hoạt tính lưỡng năng đối với cả côn trùng cánh vảy (Lepidoptera) và hai cánh (Diptera).
• Giả thuyết khoa học 2 (H2): Hệ thống vector pET-22b(+) trong vật chủ E. coli BL21 cho phép biểu hiện chính xác và tinh sạch protein rCry2A có độc lực cao chống lại ấu trùng Musca domestica.
• Giả thuyết khoa học 3 (H3): Nguồn dinh dưỡng carbon và nitrogen hữu cơ từ dịch thủy phân bã malt bia kết hợp ion khoáng vi lượng (Mg²⁺, Mn²⁺) hoàn toàn có thể thay thế môi trường bán tổng hợp đắt tiền, nâng cao tỷ lệ tạo bào tử và tinh thể độc đạt trên 90%.

Khung lý thuyết của công trình được định vị trên: Thuyết cơ chế độc tố đục lỗ màng tế bào (Pore-Forming Toxin Model) của Grochulski et al. (1995), Lý thuyết cấu trúc 3 miền (Three-Domain Toxin Architecture) của Li et al. (1991) và Boonserm et al. (2006), cùng Nguyên lý động học lên men vi sinh và Tối ưu hóa bề mặt đáp ứng thực nghiệm (Box & Wilson, 1951). Đóng góp mang tính đột phá của nghiên cứu là xác lập luận cứ khoa học: "Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B. thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học". Quy mô thực nghiệm bao trùm 7 vùng sinh thái tự nhiên, phân lập hàng trăm chủng Bt, sàng lọc chọn lọc 7 chủng mang gen mục tiêu, tinh sạch protein kích thước ~70 kDa và thử nghiệm sinh học trên ấu trùng ruồi nhà từ quy mô phòng thí nghiệm (in vitro) đến hiện trường thực địa.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu trực khuẩn Bacillus thuringiensis trải qua hơn một thế kỷ tiến hóa khoa học, bắt đầu từ phát hiện ban đầu của Louis Pasteur (1870) trên tằm dâu (Bacillus bombyces), tiếp nối bởi Sigetane Ishiwata (1901) và Ernst Berliner (1911) khi phân lập từ sâu bướm Anagasta kuhniella tại Thuringen (Đức). Các công trình kinh điển của Hannay & Fitz-James (1953) và Angus (1956) đã xác định bản chất thể vùi tinh thể độc là protein (delta-endotoxin). Đến năm 1962, de Barjac & Bonnefoi đặt nền móng cho hệ thống phân loại huyết thanh học dựa trên kháng nguyên lông roi H (flagellar H-antigen), hiện đã ghi nhận 69 typ huyết thanh và 82 thứ huyết thanh được Trung tâm Quốc tế Bacillus thuringiensis (Institut Pasteur, Paris) chuẩn hóa (Lecadet et al., 1999; Ngô Đình Bính et al., 2002; Zheng et al., 2017).

Trong kho tàng hơn 780 gen cry được khám phá thuộc 70 nhóm protein (Crickmore et al., 1998; Sanahuja et al., 2011), các dòng độc tố Cry thể hiện tính chuyên biệt cao đối với từng bộ côn trùng: Cry1 kháng Lepidoptera (Takashi & Gary, 1993), Cry3 và Cry8 kháng Coleoptera (Li et al., 1991; Thanh et al., 2012), Cry4 và Cyt1 kháng Diptera (Boonserm et al., 2005, 2006). Trong bức tranh phân loại đó, nhóm độc tố Cry2 (đặc biệt là Cry2A) giữ một vị thế lý thuyết vô cùng đặc biệt. Khác với Cry2B và Cry2C chỉ gây độc trên côn trùng cánh vảy, Cry2A sở hữu phổ tác động kép hiếm có (dual specificity), gây độc đồng thời trên cả bộ Cánh vảy (Manduca sexta, Helicoverpa zea) và bộ Hai cánh (Aedes aegypti, Musca domestica) (Widner & Whiteley, 1989; Dankocsik et al., 1990; Dwu et al., 1991).

Literature quốc tế ghi nhận hai luồng tranh luận học thuật sâu sắc:

1. Tranh luận về cấu trúc quyết định tính đặc hiệu (Receptor Specificity Determinants): Mô hình tinh thể học tia X của Morse et al. (2001) đối với Cry2Aa và Boonserm et al. (2005, 2006) đối với Cry4Ba chỉ ra rằng dù cấu trúc bậc ba gồm 3 miền (Domain I: bó xoắn α đục màng; Domain II: lăng trụ tấm β; Domain III: kẹp β kiểu "jelly roll") được bảo tồn cao, các vòng lặp (apical loops) tại Miền II có sự biến thiên chiều dài và điện tích sâu sắc giữa các họ độc tố. de Maagd et al. (2001, 2003) lập luận rằng tính đặc hiệu kép của Cry2A phát sinh từ cấu trúc linh hoạt của Miền II trong tương tác với các thụ thể cadherin hoặc aminopeptidase N (APN) trên màng vi nhung mao ruột giữa côn trùng.
2. Tranh luận về cơ chế điều hòa biểu hiện operon và nạp nếp protein: Yamamoto & McLaughlin (1981) và Duong et al. (2013) chỉ ra rằng cry2A thường nằm ở vị trí thứ ba trong operon gồm ba khung đọc mở (Orf1, Orf2, cry2A), trong đó Orf2 đóng vai trò như một chaperone phân tử bắt buộc để Cry2A kết tinh. Ngược lại, Dankocsik et al. (1990) chứng minh khi tái tổ hợp gen vào các vector biểu hiện mạnh có promoter T7, cry2A có thể tự gấp cuộn độc lập mà không cần cụm Orf hỗ trợ, mở đường cho việc sản xuất protein hòa tan trong E. coli.

Về mặt công nghệ sinh học lên men, thị trường toàn cầu bị chi phối bởi Abbott Laboratories và Novartis (chiếm 70% sản lượng) sử dụng môi trường tổng hợp tiêu chuẩn (Osman et al., 2015). Các nghiên cứu quốc tế gần đây chuyển dịch mạnh sang tận dụng cơ chất phế phụ phẩm nông công nghiệp nhằm hạ giá thành: Subbiah et al. (2012) tại Ấn Độ sử dụng bột lông vũ gia cầm; Maria et al. (2001) tại Canada tận dụng bùn thải xử lý nước; Songqing et al. (2014) tại Trung Quốc lên men Bt trên giá thể trồng nấm thải đạt hoạt tính 1.487 UI/mg. Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây của Đặng Trọng Lương et al. (1999), Võ Thị Thứ et al. (2000), Ngô Đình Bính et al. (2002, 2007) chủ yếu tập trung vào gen cry1 kháng sâu hại cây trồng hoặc cry4A diệt muỗi. Luận án này định vị chính xác vào khoảng trống: khảo sát toàn diện gen cry2A từ nguồn vi sinh vật bản địa Việt Nam, kết hợp tái tổ hợp di truyền và thiết kế công nghệ lên men tuần hoàn từ bã malt nhà máy bia.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc Thuyết tương tác độc tố - màng sinh học và Cấu trúc ba miền của họ protein δ-endotoxin (Li et al., 1991; Grochulski et al., 1995; Boonserm et al., 2006). Thông qua việc giải mã trình tự nucleotide và suy diễn trình tự 633 axit amin của gen cry2A từ chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4, công trình đã xác lập các luận điểm lý thuyết:

• Mệnh đề lý thuyết 1 (P1): Cấu trúc phân tử của protein Cry2Aa bản địa bảo tồn nguyên vẹn 5 khối trình tự bảo thủ (conserved sequence blocks) và kiến trúc 3D đặc trưng gồm Miền I (7 chuỗi xoắn α lưỡng cực dài >30 Å đảm nhiệm chức năng hình thành kênh ion Na⁺/K⁺ không chọn lọc), Miền II (3 tấm β đối song song dạng lăng trụ tiếp xúc dung môi) và Miền III (cấu trúc β-sandwich tương đồng với domain liên kết carbohydrate CBMs).
• Mệnh đề lý thuyết 2 (P2): Hoạt tính diệt ấu trùng Diptera của Cry2A không đòi hỏi sự có mặt của độc tố tế bào Cyt1A (như trường hợp của Cry4A/Cry4B), chứng minh cơ chế gây độc độc lập thông qua gắn kết thụ thể đặc thù trên màng ruột giữa Musca domestica.
• Mệnh đề lý thuyết 3 (P3): Cơ chế kích hoạt độc tính tuân thủ mô hình đa bước: hòa tan trong dịch ruột -> cắt tiền độc tố bởi protease -> hoạt hóa độc tố trung gian qua thụ thể tế bào ruột -> kích thích dòng ion gây rối loạn thẩm thấu và làm vỡ tế bào biểu mô ruột.

       +-------------------------------------------------------------+
       |   Chủng Bt bản địa: B. thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4 |
       +-------------------------------------------------------------+
                                      |
                     [Phân tích Gen & Protein Tái tổ hợp]
                                      v
       +-------------------------------------------------------------+
       |  Gen cry2A (Khối lượng ~70 kDa; 633 aa; Vector pET-22b(+))  |
       |  - Miền I: Đục lỗ màng & tạo kênh ion (7 chuỗi xoắn alpha)   |
       |  - Miền II: Nhận diện thụ thể đặc hiệu ruồi Diptera         |
       |  - Miền III: Ổn định cấu trúc & liên kết carbohydrate       |
       +-------------------------------------------------------------+
                                      |
                     [Bioprocess: Lên men cơ chất Bã Malt Bia]
                                      v
       +-------------------------------------------------------------+
       | Tối ưu hóa RSM (Design-Expert 10): Bột đậu tương, Mg2+, Mn2+ |
       |      pH ban đầu 6.8-7.2 | Nhiệt độ 28-30°C | 48 giờ lên men  |
       +-------------------------------------------------------------+
                                      |
                                      v
       +-------------------------------------------------------------+
       |  Chế phẩm sinh học BT diệt ấu trùng Musca domestica (Dòi)   |
       |     (Quy mô Pilot & Thực địa: Hiệu lực diệt dòi triệt để)    |
       +-------------------------------------------------------------+

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba trụ cột lý thuyết: Di truyền học vi sinh vật phân tử (Molecular Microbial Genetics), Công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp (Recombinant Expression Dynamics) và Động học tối ưu hóa quá trình sinh học (Bioprocess Optimization Kinetics).

Cách tiếp cận phân tích mới bao gồm:

1. Phễu sàng lọc đa tầng (Multi-tier Screening Pipeline): Kết hợp định danh kiểu hình hình thái (kính hiển vi đối pha 1.000x - 10.000x), phân loại huyết thanh học kháng nguyên H, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi đặc hiệu cho gen cry2A, và tinh sạch protein ái lực His-tag qua cột niken.
2. Khung chuyển hóa sinh học phụ phẩm (Bio-waste Valorization Framework): Xây dựng quy trình thủy phân enzyme bã malt bia (chứa carbon hữu cơ, nitrogen và các hợp chất khoáng tồn dư) làm cơ chất thay thế hoàn toàn môi trường LB/peptone đắt tiền, xác lập điều kiện biên (boundary conditions) về nồng độ chất khô tổng số (TS), tỷ lệ phối chế dinh dưỡng bổ sung và chế độ cấp khí.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực chứng (positivism) và cơ chế luận thực nghiệm (mechanistic empirical research), vận hành qua mô hình đa tầng:

• Tầng vi mô (Molecular Level): Khuếch đại, tách dòng, giải mã trình tự gen cry2A và biểu hiện trong hệ thống prokaryote E. coli.
• Tầng tế bào/lên men (Cellular & Fermentation Level): Đánh giá động học sinh trưởng, tỷ lệ hình thành bào tử (SC), tổng tế bào sống (TCC) và nồng độ protein tinh thể delta-endotoxin trên hệ thống thiết bị lên men chìm (submerged fermentation).
• Tầng sinh thái/hiện trường (Bioassay & Field Level): Thử nghiệm độc lực sinh học trên quần thể ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện trường chăn nuôi/bãi rác.

Cỡ mẫu và nguồn thu thập: Khảo sát mẫu đất và mẫu lá cây trên toàn bộ 7 vùng sinh thái địa lý của Việt Nam. Tuyển chọn được 7 chủng Bt mang gen cry2A, trong đó chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4 được xác định là đối tượng trung tâm cho toàn bộ nghiên cứu chuyên sâu.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình nghiên cứu tuân thủ các chuẩn mực quốc tế khắt khe:

• Phân lập và phân loại huyết thanh: Phân lập vi khuẩn theo phương pháp xử lý nhiệt chọn lọc; định danh chủng theo phản ứng ngưng kết ngưng tụ kháng thể kháng nguyên lông roi H theo quy trình chuẩn của Viện Pasteur Paris (de Barjac & Bonnefoi, 1962; Lecadet et al., 1999).
• Tách dòng di truyền và sinh học phân tử: DNA tổng số được tách chiết tinh sạch; khuếch đại gen cry2A bằng cặp mồi đặc hiệu; nhân dòng vào vector giải trình tự và phân tích mối quan hệ phả hệ bằng phần mềm chuyên dụng; đối chiếu ngân hàng gen quốc tế GenBank/NCBI và mô phỏng cấu trúc không gian 3D.
• Hệ thống biểu hiện và tinh sạch protein: Sử dụng vector biểu hiện pET-22b(+) (kích thước 5.493 bp, mang promoter T7, lac operator, chuỗi tín hiệu pelB và đuôi polyhistidine His-Tag tại đầu C) biến nạp vào chủng chủ E. coli BL21. Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng sinh tổng hợp với nồng độ chất cảm ứng Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) từ 0,2 mM đến 1,0 mM tại các dải nhiệt độ 25°C, 30°C và 37°C. Phân tích protein tái tổ hợp trên gel điện di polyacrylamide 12,6% (SDS-PAGE) và khẳng định tính đặc hiệu bằng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blot với kháng thể đặc hiệu. Tinh sạch protein rCry2A qua cột sắc ký ái lực niken ProBond Nickel Chelating Resin (Invitrogen).
• Phương pháp tam giác giác đạc (Triangulation): Kiểm tra chéo độc lực sinh học bằng cả dịch nuôi cấy thô của chủng tự nhiên MSS8.4, dịch tinh thể tinh sạch và protein tái tổ hợp rCry2A trên cùng một quần thể ấu trùng chỉ thị.

Data và phân tích

Phần mềm thống kê chuyên dụng Design-Expert phiên bản 10 được áp dụng để thiết kế ma trận thực nghiệm tối ưu hóa môi trường lên men theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) kết hợp phương pháp quy hoạch Box-Behnken hoặc ma trận trực giao.

• Các biến đầu vào (Independent variables): Nồng độ dịch thủy phân bã bia (DTPBB), hàm lượng bột đậu tương bổ sung (0 - 40 g/L), nồng độ muối khoáng MgSO₄ (0,1 - 0,5%) và MnSO₄ (0,01 - 0,05%), độ pH ban đầu (5,5 - 8,5), nhiệt độ nuôi cấy (20 - 40°C).
• Các biến đáp ứng (Response outputs): Nồng độ protein tinh thể (g/L), tổng tế bào sống (TCC, CFU/mL), số lượng bào tử sống (SC, Spores/mL), tỷ lệ chuyển hóa bào tử (%) sau 48 giờ nuôi cấy.
• Kiểm định thống kê: Phân tích phương sai (ANOVA), đánh giá hệ số tương quan R², hệ số R² hiệu chỉnh (Adjusted R²), giá trị kiểm định F-test với mức ý nghĩa p < 0,05, khoảng tin cậy 95%. Tính toán các chỉ số độc lực LC₅₀ (nồng độ gây chết 50%) và LT₅₀ (thời gian gây chết 50%) trên ấu trùng Musca domestica.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Sàng lọc thành công nguồn gen bản địa quý hiếm: Trong hàng trăm chủng Bt thu thập từ 7 vùng sinh thái tự nhiên của Việt Nam, đã tuyển chọn chính xác 7 chủng mang gen cry2A. Chủng B. thuringiensis phân lập ký hiệu MSS8.4 được định danh chính xác thuộc serovar kurstaki (kháng nguyên H3a3b3c) có khả năng sinh tinh thể hình lập phương/vuông lưỡng tính với kích thước vượt trội dưới kính hiển vi đối pha (10.000x).
2. Giải mã hoàn chỉnh cấu trúc phân tử gen cry2A: Gen cry2A từ chủng MSS8.4 được tách dòng và đọc toàn bộ trình tự nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide gồm 633 axit amin với trọng lượng phân tử tính toán ~70,8 kDa. Mô hình phân tích phả hệ và cấu trúc 3D cho thấy độ tương đồng >98% với các chuỗi Cry2Aa chuẩn quốc tế, bảo tồn cấu trúc 3 miền kinh điển và các vòng lặp nhận diện thụ thể ruột côn trùng Hai cánh.
3. Biểu hiện xuất sắc protein hòa tan rCry2A trong E. coli BL21: Protein tái tổ hợp rCry2A được biểu hiện ở mức độ cao khi cảm ứng bằng IPTG 0,5 mM tại 30°C trong 4 - 6 giờ. Điện di SDS-PAGE 12,6% và Western blot ghi nhận một băng protein đơn nhất sắc nét tại vị trí ~70 kDa. Sau khi tinh sạch qua cột ái lực ProBond Nickel Resin, protein rCry2A duy trì hoạt tính sinh học cực mạnh, gây tỷ lệ tử vong trên 85% đối với ấu trùng tuổi 2 của ruồi nhà Musca domestica.
4. Đột phá công nghệ lên men từ phụ phẩm bã malt bia: Công trình đã xác lập công thức môi trường tối ưu trên nền dịch thủy phân bã bia: "Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dưỡng (carbon, nitơ, chất khoáng…) cho sự sinh trưởng của vi khuẩn B. thuringiensis và được sử dụng như một nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT". Khi bổ sung nồng độ bột đậu tương thích hợp kết hợp với các ion khoáng kích hoạt enzyme (Mg²⁺, Mn²⁺), pH ban đầu điều chỉnh ở mức 7,0 và nhiệt độ lên men 28 - 30°C, hàm lượng protein tinh thể thu hồi đạt mức cực đại, tỷ lệ bào tử hóa đạt trên 92% chỉ sau 48 giờ lên men chìm.
5. Hiệu lực chế phẩm thực địa vượt trội: Chế phẩm BT dạng bột thấm ướt (wettable powder) sản xuất ở quy mô pilot 50 - 100 lít từ chủng MSS8.4 trên cơ chất bã bia khi thử nghiệm trên các ổ đẻ và bãi rác sinh hoạt cho hiệu quả diệt dòi (ấu trùng ruồi nhà) đạt 88 - 95% sau 48 - 72 giờ xử lý, ức chế hoàn toàn sự phát triển thành nhộng và ruồi trưởng thành.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm củng cố mô hình cấu trúc - chức năng của họ độc tố Cry2A; chứng minh tính tương thích hoàn hảo giữa hệ thống biểu hiện nhân tạo prokaryote và việc tái lập hoạt tính độc học của delta-endotoxin.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình khép kín từ sàng lọc PCR khuẩn lạc, cắt enzyme giới hạn BamHI/XhoI, tinh chế His-tag đến tối ưu hóa RSM bằng Design-Expert 10, tạo khung phương pháp chuẩn cho nghiên cứu độc tố vi sinh vật tại các nước đang phát triển.
• Về mặt ứng dụng thực tiễn: Cung cấp giải pháp chế phẩm sinh học diệt ruồi, muỗi hiệu quả cao, thay thế thuốc hóa học độc hại trong các trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm và các khu xử lý rác thải đô thị.
• Về mặt chính sách và kinh tế tuần hoàn: Đặt nền móng cho mô hình kinh tế sinh học tuần hoàn (Circular Bioeconomy), biến hàng nghìn tấn bã thải nhà máy bia gây ô nhiễm môi trường thành nguyên liệu đầu vào cho ngành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học giá rẻ.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận các giới hạn nghiên cứu:

1. Độ ổn định ngoài hiện trường: Bào tử và tinh thể độc Cry2A mẫn cảm với bức xạ tia cực tím (UV) trong ánh nắng mặt trời (bị suy giảm hoạt tính tới 80% sau khi chiếu xạ trực tiếp 3.200 Lux trong 1 giờ), đòi hỏi phải nghiên cứu sâu hơn về các chất phụ gia bảo vệ quang học (photoprotectants như diatomite, lignosulfonate).
2. Quy mô lên men công nghiệp: Thực nghiệm mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm và thiết bị lên men pilot, chưa khảo sát các thông số truyền khối oxy (kLa) và động học tạo bọt ở quy mô công nghiệp hàng chục mét khối.
3. Phổ đối tượng côn trùng: Các thử nghiệm thực địa tập trung chuyên sâu vào ruồi nhà Musca domestica, trong khi hoạt tính trên các loài muỗi truyền bệnh (Aedes aegypti, Culex tritaeniorhynchus) mới được đánh giá ở mức độ phòng thí nghiệm sơ bộ.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối trong giai đoạn 5 - 10 năm:

• Nghiên cứu kỹ thuật vi bọc (microencapsulation) tinh thể độc rCry2A nhằm tăng độ bền nhiệt và kháng quang phân hủy UV ngoài trời.
• Ứng dụng kỹ thuật chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 hoặc kỹ thuật protein (protein engineering - tái cấu trúc các vòng lặp Miền II) để tạo ra các biến thể Cry2A siêu độc lực.
• Mở rộng quy trình lên men quy mô công nghiệp 5.000 - 10.000 lít sử dụng liên hợp các chủng Bt đa độc tố (mang đồng thời cry1, cry2, cry4 và cyt1).
• Đánh giá toàn diện tác động sinh thái dài hạn trên hệ vi sinh vật đất và các loài thủy sinh không phải đích (non-target aquatic organisms).

Tác động và ảnh hưởng

Công trình luận án tạo ra những tác động lan tỏa trên nhiều bình diện:

• Tác động học thuật: Bổ sung vào Ngân hàng Gen Quốc tế (GenBank) các chuỗi dữ liệu phân tử mới về gen cry2A của các chủng Bt bản địa Việt Nam, thúc đẩy các công bố quốc tế chất lượng cao trong ngành công nghệ sinh học vi sinh và kiểm soát sinh học.
• Chuyển đổi công nghiệp: Mở ra hướng đi thương mại hóa cho ngành sản xuất chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật và thú y, liên kết trực tiếp giữa các nhà máy bia (nguồn cung cơ chất bã thải) và các doanh nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Giảm thiểu 40 - 60% chi phí môi trường lên men so với nhập khẩu pepton/cao nấm men; bảo vệ sức khỏe cho hàng triệu người dân nông thôn và công nhân môi trường thông qua việc kiểm soát bền vững mật độ vector truyền bệnh mà không gây tồn dư hóa chất độc hại trong chuỗi thức ăn.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học: Tiếp cận bộ dữ liệu phân loại huyết thanh học chuẩn xác, quy trình tách dòng vector pET-22b(+) và mô hình tối ưu hóa RSM đa biến có độ tin cậy cao.
• Doanh nghiệp R&D & Nhà máy công nghệ sinh học: Sở hữu ngay chủng vi sinh vật ưu việt MSS8.4 và công nghệ chế biến dịch thủy phân bã malt bia sẵn sàng chuyển giao công nghệ lên men quy mô pilot.
• Cơ quan quản lý y tế dự phòng & Thú y: Có thêm công cụ sinh học mạnh mẽ để kiểm soát các đợt bùng phát dịch tả, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản và kiểm soát ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi.
• Cộng đồng & Môi trường: Hưởng lợi từ môi trường sống không rác thải hữu cơ, nguồn nước không bị ô nhiễm hóa chất diệt côn trùng.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng Thuyết cấu trúc ba miền của protein δ-endotoxin (Boonserm et al., 2006) trên đối tượng chủng bản địa Việt Nam B. thuringiensis serovar kurstaki MSS8.4, chứng minh rằng độc tố Cry2A với cấu trúc phân tử đơn lẻ (~70 kDa) có khả năng kích hoạt phản ứng đục lỗ màng biểu mô ruột của ấu trùng Diptera mà không bắt buộc phải có sự hiện diện đồng thời của protein hiệp đồng Cyt1A như các độc tố nhóm Cry4 truyền thống.

2. Đột phá về mặt phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây được thể hiện thế nào? So với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam vốn chủ yếu dừng lại ở việc thử nghiệm dịch nuôi cấy thô hoặc tách dòng các gen cry1 truyền thống (Đặng Trọng Lương et al., 1999; Võ Thị Thứ et al., 2000), luận án đã thiết lập quy trình tích hợp toàn diện: từ định danh huyết thanh H, tinh sạch protein tái tổ hợp chuẩn bằng cột ái lực niken ProBond Ni-NTA, đến ứng dụng mô hình toán học đáp ứng bề mặt RSM (Design-Expert 10) để giải quyết bài toán kinh tế công nghệ sử dụng phụ phẩm bã bia thay thế môi trường tổng hợp.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong quá trình thực nghiệm là gì? Sự bổ sung vi lượng cation kim loại hóa trị hai (đặc biệt là Mg²⁺ và Mn²⁺) vào dịch thủy phân bã bia đóng vai trò "công tắc sinh học" quyết định sự tổng hợp tinh thể độc. Nếu thiếu các ion này, vi khuẩn vẫn sinh trưởng sinh dưỡng nhưng tỷ lệ hình thành tinh thể giảm mạnh; khi tối ưu hóa nồng độ MgSO₄ và MnSO₄, nồng độ protein tinh thể delta-endotoxin tăng vọt đồng thời rút ngắn chu kỳ lên men xuống còn 48 giờ với tỷ lệ bào tử hóa đạt trên 90%.

4. Quy trình nghiên cứu có cung cấp giao thức nhân bản (replication protocol) chi tiết không? Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ điều kiện thực nghiệm: nồng độ mồi PCR, chu trình nhiệt luân chuyển, nồng độ gel polyacrylamide 12,6%, vector pET-22b(+), chủng chủ E. coli BL21, nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM, tỷ lệ phối chế dịch thủy phân bã bia và hàm lượng khoáng chất, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử và công nghệ lên men nào cũng có thể tái lập kết quả một cách chính xác.

5. Định hướng nghiên cứu 10 năm tiếp theo được xác định ra sao? Chiến lược 10 năm tập trung vào: (1) Nghiên cứu công nghệ nano/vi bọc chống phân hủy quang học UV; (2) Kỹ thuật tái tổ hợp đa gen (co-expression) kết hợp cry2A và vip3 để mở rộng phổ diệt sâu bệnh; (3) Nâng quy mô lên men công nghiệp tự động hóa 10.000 lít và đăng ký lưu hành chế phẩm thương mại sinh học bảo vệ môi trường quy mô quốc gia.

Kết luận

1. Phân lập và tuyển chọn thành công 7 chủng Bacillus thuringiensis bản địa mang gen cry2A từ 7 vùng sinh thái tự nhiên của Việt Nam có hoạt lực diệt côn trùng bộ Hai cánh cao.
2. Xác định chủng vi khuẩn ưu việt MSS8.4 thuộc Bacillus thuringiensis serovar kurstaki (kháng nguyên H3a3b3c), giải mã toàn bộ trình tự nucleotide và suy diễn 633 axit amin của gen cry2A mã hóa protein tinh thể ~70 kDa.
3. Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rCry2A trong vật chủ E. coli BL21 sử dụng vector pET-22b(+), tinh sạch qua cột ái lực ProBond Ni-NTA, xác nhận trên SDS-PAGE 12,6% và Western blot, chứng minh hoạt tính diệt ấu trùng ruồi nhà Musca domestica đạt trên 85%.
4. Tiên phong xây dựng công nghệ chế biến và tối ưu hóa môi trường lên men chìm từ phụ phẩm dịch thủy phân bã malt bia bằng phần mềm Design-Expert 10, nâng cao sản lượng protein tinh thể và tỷ lệ bào tử hóa đạt trên 90% sau 48 giờ.
5. Sản xuất thành công chế phẩm sinh học BT dạng bột thấm ướt quy mô pilot, kiểm chứng hiệu lực diệt ấu trùng ruồi nhà đạt 88 - 95% ngoài thực địa, mở ra hướng đi bền vững cho nông nghiệp sinh thái và kiểm soát dịch bệnh cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Bacillus thuringiensis là vi khuẩn có khả năng sinh sản ra các protein tinh thể độc có khả năng diệt côn trùng thuộc các bộ khác nhau mà không gây độc hại cho con ngƣời và môi trƣờng sinh thái và sinh vật có ích. Trong nhiều năm qua, thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng để diệt trừ côn trùng có hại đối với cây trồng cũng nhƣ bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Càng ngày thuốc trừ sâu sinh học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis càng đƣợc sử dụng một cách rộng rãi bởi nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch ngày càng cao. Không những thế thuốc trừ sâu sinh học BT còn có những ƣu điểm rất vƣợt trội từ việc khắc phục đƣợc tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại, không ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời.

Côn trùng bộ hai cánh là một trong những bộ lớn trong lớp côn trùng với số lƣợng và thành phần đa dạng. Côn trùng thuộc bộ hai cánh rất đa dạng về mặt sinh thái học và chủ yếu là các tác nhân gây hại trong nông nghiệp (ruồi đục quả) hay cho con ngƣời nhƣ ruồi, muỗi. Chúng là tác nhân trung gian chủ yếu truyền bệnh giữa ngƣời với ngƣời hay giữa động vật và ngƣời. Các bệnh do muỗi truyền có thể gây tử vong cao nhƣ Anopheles gambiae là trung gian truyền bệnh sốt rét cho ngƣời.

Aedes aegypti truyền bệnh sốt xuất huyết. Culex tritaeniorhynchus truyền bệnh viêm não Nhật Bảncòn ruồi là tác nhân truyền khoảng 100 bệnh nhƣng chủ yếu là các bệnh nguy hiểm nhƣ: bại liệt, bệnh đau mắt hột, viêm gan (A, E), sốt hồi qui do Rickettsiae,lỵ, tả, thƣơng hàn, liên cầu khuẩn (Streptococcus) và tụ cầu vàng (Staphyloccocus). Ngày nay, có nhiều phƣơng pháp diệt côn trùng bộ hai cánh khác nhau mà con ngƣời áp dụng. Biện pháp diệt đƣợc sử dụng phổ biến nhất là dùng các loại thuốc diệt ruồi, muỗi.

Tuy nhiên, những loại thuốc này hiện nay thƣờng có giá thành cao, chủ yếu có nguồn gốc từ hóa chất nên dễ gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời, động vật, không diệt trừ tận gốc mầm bệnh. Việc nghiên cứu hoạt tính diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh của các 1 chủng Bacillus thuringiensisphân lập ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm tìm ra những chủng mang gen tự nhiên có hoạt tính mạnh phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học diệt ấu trùng một số côn trùng bộ hai cánh. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillusthuringiensis phục vụ tạo chế phẩm diệt côn trùng bộ hai cánh (Diptera)” 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.

Mục tiêu chung Tuyển chọn đƣợc chủng Bacillus thuringiensis bản địa có khả năng sinh protein tinh thể độc diệt côn trùng thuộc bộ hai cánh (Diptera) cao. Biểu hiện, tinh sạch đƣợc protein mã hóa tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh trong vi khuẩn E.coli phục vụ nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất đƣợc chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt ấu trùng ruồi nhà (Musca domestica) từ bã thải nhà máy bia. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ các mẫu đất, lá tại một số tỉnh của Việt nam có khả năng sinh gen cry2A mã hóa protein tinh thể độc diệt côn trùng bộ hai cánh và xác định đƣợc trình tự nucleotide của gen cry2A này. - Biểu hiện và tinh sạch đƣợc protein tái tổ hợp (rCry2A) trong E.

- Tìm ra đƣợc phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. thuringiensis và nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. Đồng thời đánh giá đƣợc sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm BT từ vi khuẩn B.

Nội dung nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh. - Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự đƣợc gen cry2 của các chủng Bt phân lập từ đất, lá có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánhcủa chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn.

- Nghiên biểu hiện gen mã hóa protein Cry2 diệt côn trùng bộ hai cánh của chủng vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn. - Nghiên cứu các phƣơng pháp xử lý bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn B. Hoàn thiện môi trƣờng lên men vi khuẩn B.

thuringiensis từ bã malt bia. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp protein tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis tuyển chọn khi sử dụng bã malt bia làm môi trƣờng nuôi cấy ở quy mô phòng thí nghiệm. - Lên men sản xuất chế phẩm sinh học diệt côn trùng bộ hai cánh từ vi khuẩn B.

thuringiensis tuyển chọn và đánh giá sơ bộ hiệu quả diệt côn trùng bộ hai cánh của chế phẩm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực địa. Những đóng góp mới của luận án - Phân lập và tuyển chọn đƣợc 7 chủng vi khuẩn B. thuringiensis mang gen cry2A có hoạt tính diệt côn trùng bộ hai cánh cao. - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về gen cry2A từ chủng vi khuẩn B.

Thuringiensis serovar kurstaki MSS 8.4 của Việt Nam có khả năng diệt côn trùng bộ hai cánh phục vụ cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học. - Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen cry2A của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng về sau. 3 - Sử dụng bã malt bia là một chất thải của ngành sản xuất đồ uống làm nguồn nguyên liệu cung cấp các chất dinh dƣỡng (các bon, nitơ, chất khoáng…) cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn B.

thuringiensis và đƣợc sử dụng nhƣ một nguyên liệu thay thế cho các hợp chất hữu cơ tổng hợp đắt tiền để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học BT. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu một cách hệ thống và đầy đủ về gen cry2A là cơ sở khoa học đáng tin cậy cho những nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn Bacillus thuringiensis nói chung và gen cryA nói riêng. Trên cơ sở đánh giá đƣợc tác động của gen cryA mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt đƣợc một số côn trùng bộ hai cánh nhƣ ruồi nhà là một bƣớc đi mới để mở ra khả năng tạo ra đƣợc các chế phẩm sinh học diệt các côn trùng này.

Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men chế phẩm BT từ nguồn nguyên liệu thay thế rẻ tiền là phế thải của ngành sản xuất bia. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án góp phần khai thác có hiệu quả nguồn gen của vi sinh vật nói chung và gen cry2A của vi khuẩn B. thuringiensis nói riêng để góp phần tạo ra các chế phẩm sinh học diệt một số côn trùng bộ hai cánh.Mặt khác sử dụng bã malt bia - một loại chất thải của ngành sản xuất công nghiệp đƣợc xử lý thành nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất khác chế phẩm BT là rất cần thiết. Đây là một hƣớng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị của bã malt bia, tạo ra sản phẩm thân thiện môi trƣờng phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững.

4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis Năm 1870, Louis Pasteur phát hiện một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho tằm và ông đặt tên loại vi khuẩn này là Bacillus bombyces. Năm 1901, Bacillus soto đƣợc nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata phát hiện và đặt tên khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu.

Đến mƣời năm sau (1911), loài vi khuẩn này đƣợc nhà khoa học ngƣời Đức là Berliner phân lập đƣợc từ xác ấu trùng bƣớm Địa Trung Hải (Anagasta kuhniella) và ông đã có những mô tả đầu tiên về loài vi khuẩn đất này, đó là vi khuẩn đất có tế bào hình que, có khả năng sinh bào tử. Đến năm 1915, vi khuẩn này chính thức mang tên Bacillus thuringiensisdo phân lập từ nhà máy bột vùng Thuringen của Đức. Từ đó, chế phẩm sử dụng B. thuringiensis để diệt sâu đục thân có hại Angasta kuhniella ở châu Âu đƣợc ra đời năm 1930 tên là chế phẩm BT.

Chế phẩm thƣơng mại đầu tiên đƣợc sản xuất để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp năm 1938. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh đƣợc hoạt tính diệt sâu của B. thuringiensislà do tinh thể độc này đƣợc sinh ra từ tế bào và bào tử vi khuẩn.

Trong suốt những năm 1960, nhiều chế phẩm thƣơng mại của B. thuringiensis đã đƣợc sản xuất ở nhiều quy mô khác nhau tại Mỹ, Pháp, Đức. Sau đó, Howard Dulmage và Clayton Beesle của viện nghiên cứu Nông Nghiệp USDA đã thu thập đƣợc bộ sƣu tầm đầu tiên về các chủng B. Năm 1962, De Barjac và Bonnefoi đã đƣa ra phƣơng pháp phân loại mới cho các chủng B.

sphaericus (Bs) bằng phƣơng pháp huyết thanh. Năm 1970, Dulmage đã phân lập đƣợc chủng HD-1 và cho đến nay nó vẫn đƣợc sử dụng cho nhiều nghiên cứu và trong chế phẩm B. Trong những năm 1970 và 1980, rất nhiều nghiên cứu về B. Thuringiensis 5 đƣợc thực hiện nhằm tìm ra phổ côn trùng đích của B.

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra B. isralensis diệt đƣợc cả ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Đặc biệt, gen mã hóa protein tinh thể diệt sâu đầu tiên đƣợc tách dòng và đọc trình tự năm 1981. Từ đó trở đi, rất nhiều gen của vi khuẩn B.

thuringiensis đã đƣợc tách dòng và nghiên cứu đặc tính diệt côn trùng. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phát hiện dƣới loài Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu Tenebrio molitar. Sau đó không lâu thì công ty Mycogen phát hiện chủng tƣơng tự B.

morrisoni đặt tên là B. sandiego và đã tổng hợp đƣợc chuỗi gen độc tố của chúng. Đặc biệt, vi khuẩn này còn đƣợc phát hiện ra hoạt tính đối với giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đáng chú ý, đây cũng là giai đoạn diễn ra những nghiên cứu đầu tiên về chuyển gen B.

thuringiensis vào cây trồng (1985).