Đặt vấn đề Hiện nay tại các vùng trồng rau chuyên canh ở nước ta đã áp dụng nhiều kỹ thuật tiến bộ mới, làm cho năng suất rau không ngừng được nâng lên. Tuy nhiên càng thâm canh thì sâu bệnh hại rau xuất hiện ngày lại càng nhiều lên. Để đảm bảo năng suất người nông dân đã sử dụng nhiều biện pháp như: lạm dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học, phân bón hoá học thiếu chọn lọc và không đúng phương pháp,. điều đó đã khiến môi trường xung quanh bị ô nhiễm và rau xanh có lượng độc tố vượt quá ngưỡng cho phép.
Các nghiên cứu khoa học đã chỉ ra rằng sử dụng thuốc vi sinh vật giữ được quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất và không thể phát triển được thành dịch, bảo vệ được các loại côn trùng và các vi sinh vật có ích khác, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rau, bảo vệ môi trường sống và sức khoẻ cộng đồng. Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học được nghiên cứu từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được ứng dụng ngày càng phổ biến. Việc tìm ra các chủng Bt mới thực sự có giá trị, ý nghĩa và tiềm năng ứng dụng to lớn là cơ sở để bảo tồn nguồn gen quý và tạo ra các chế phẩm sinh học phục vụ trong nông nghiệp. Xuất phát từ những cơ sở lý luận về khoa học và thực tiễn nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài "Phân lập, tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu hại rau tại Thái Nguyên".
Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn được một số chủng Bacillus thuringiensis có khả năng tiêu diệt sâu tơ (Plutellidae xylostella) tại Thái Nguyên. Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn được 1 - 2 chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu cao nhất từ các chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc phân lập được. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa trong khoa học - Đánh giá mức độ đa dạng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis được phân lập từ các mẫu đất khác nhau tại địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
- Phân loại các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực diệt sâu tơ (Plutella xylostella) cao. Ý nghĩa thực tiễn - Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần xác định được một số đặc điểm về hình thái tế bào và khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. - Giúp sinh vên tiếp cận với công tác khoa học, qua đó nâng cao trình độ chuyên môn và đồng thời tạo cho bản thân sinh viên tác phong làm việc nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học. n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis 1. Đặc điểm sinh lý của Bt Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3 - 6µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào (Nester E.
Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8 - 10µm. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn. Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6 - 2µm.
Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng. Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp. Tinh thể có kích thước 0,6 - 2µm, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu).
Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (Theiry và cs, 1997) [16]. Đặc điểm sinh hoá của Bt Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose. Có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7 có phản ứng với lòng đỏ trứng gà.
Bt không có khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối sulfate (www.phenyl alanine tailieu. Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15 - 45 oC. Nhiệt độ tối ưu là 28 - 32oC (Ngô Đình Bính và cs, 2000) [3]. Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH=7.
Bt có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo chu trình Embden-Meyerhoff-Panas (Ngô Đình Bính và cs, 2002) [2], (Ngô Đình Bính và cs, 2005) [4]. Đặc điểm phân loại của Bt Có rất nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau: Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus, 1958). Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên -H.
Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau. Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể. Phân loại theo loại hình enzym lipase. Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế.
Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết thanh - H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương n 5 pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập được.
Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typee huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B. Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B. thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H. Phân loại gene độc tố của Bt Kích thước hệ gene của B.
thuringiensis vào khoảng 2,4 - 5,7 triệu bp. Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có 1 NST duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép.
Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt. Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên cho một số chủng B.
Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene cry, cyt, vip mã hóa. Gene cry Gene cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gene độc tố quan trọng nhất của Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc do gene cry mã hóa.
Các gene cry thường nằm trên các plasmid có hệ số sao chép thấp. n 6 Những nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số lượng plasmid dao động từ 2 - 12 trong các chủng nghiên cứu (Đặng trọng lượng và cs, 1999) [9], [14]. Theo công bố mới nhất trên website: http://www.uk/home/NeilCrickmore/Bt/toxins2.html: đã phát hiện tới hơn 759 gene thuộc 73 họ gene cry của Bt. Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam: Bảng 2.1: Phân loại gene cry của Bt Hình dạng Khối lƣợng phân Hoạt tính diệt Gene tinh thể tử protein (kDa) côn trùng cry1A- cry1L Lưỡng tháp 130 – 138 Cánh vảy cry2A- cry2C Cầu 69 – 71 Cánh vảy, hai cry3A- cry3C Lập phương 73 – 74 cánh cứng Cánh cry4A- cry4D Cầu 73 – 74 Hai cánh cry5 Lưỡng tháp 81 Tuyến trùng cry8 Lập phương 130 Cánh cứng Các gene cry còn Đa dạng 35 – 129 Đa dạng lại Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố là không đáng kể.
Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc 3 lớp cyt1, cyt2 và cyt3 mã hóa protein gây độc với côn trùng và động vật không xương sống. Nhóm gene cyt mã hóa protein 27 kDa và chiếm khoảng 40 - 50% tinh thể, protein này có tác dụng gây độc với côn trùng bộ hai cánh và giun tròn. n 7 Gene vip Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein). Độc tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao gồm Vip3A và Vip3B.
Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát hiện được côn trùng kháng độc tố này. Các nhà khoa học đã phát hiện được 85 gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon, Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa (Ngô Đình Bính, 2005)[4]. Các loại độc tố của Bt Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố: Ngoại độc tố α(α - exotoxin), ngoại độc tố β(β - exotoxin), ngoại độc tố γ(γ - exotoxin), nội độc tố δ(δ - endotoxin).
Trong đó nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất (Ngô Đình Bính và cs, 2010) [6].