Luận án tiến sĩ vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi tại Đại học Cần Thơ 2017

Luận án tiến sĩ nghiên cứu phân lập tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong lĩnh vực tại

• Tác giả: Quách Thị Thanh Tâm
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Thị Minh Diệu
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu của đề tài
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Những đóng góp mới của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về chất thải lông
• 2.2. Sơ lược về keratin
• 2.3. Các phương pháp phân giải keratin
• 2.3.1. Phương pháp lý hóa
• 2.3.2. Phương pháp sinh học
• 2.5. Cơ chế phân giải keratin của vi khuẩn
• 2.6. Vi khuẩn phân giải keratin
• 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.6.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải keratin, sự tạo keratinase và mật số của vi khuẩn phân giải keratin
• 2.7.1. Ảnh hưởng của chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
• 2.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH
• 2.7.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
• 2.8. Nhu cầu dinh dưỡng của gia cầm
• 2.8.1. Nhu cầu về protein
• 2.8.2. Nhu cầu về năng lượng
• 2.8.3. Nhu cầu về chất xơ
• 2.8.4. Ảnh hưởng của các khẩu phần protein lên năng suất sinh trưởng và chất lượng thân thịt của gà
• 2.9. Bột lông gia cầm (bột lông vũ)
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Sơ đồ khối tổng quát nội dung luận án
• 3.2. Nội dung 1: Khảo sát thực trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia súc gia cầm tại thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp
• 3.3. Nội dung 2: Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí phân giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm
• 3.3.1. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.2. Phân tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 2
• 3.4. Nội dung 3: Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển, khả năng phân giải keratin và hàm lượng protein của chủng sàng được tuyển từ Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2
• 3.4.1. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.2. Phân tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 3
• 3.5. Ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79
• 3.6. Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn phân hủy mạnh lông gia cầm được tuyển chọn để chế biến lông gà thành thức ăn bổ sung protein cho gà thả vườn
• 3.6.1. Vật liệu thí nghiệm
• 3.6.2. Phương pháp thí nghiệm
• 3.6.3. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.6.4. Phân tích hóa học
• 3.6.5. Phân tích thống kê nội dung 4
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải lông gia súc, gia cầm tại Thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp
• 4.1.1. Kết quả khảo sát
• 4.1.2. Cách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ
• 4.2. Nội dung 2: Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí phân giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm
• 4.2.1. Kết quả phân lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin của lông gia cầm từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia cầm
• 4.2.2. Kết quả phân lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin của lông gia súc từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc
• 4.2.3. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng phân giải keratin
• 4.2.4. Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân giải keratin mạnh
• 4.2.5. Phân tích phát sinh loài và mối tương quan trình tự 16S rRNA của vi khuẩn phân giải keratin
• 4.3. Nội dung 3: Kết quả ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng phân giải keratin của một số chủng vi khuẩn
• 4.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông của 2 chủng vi khuẩn phân giải keratin mạnh nhất
• 4.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn đưa vào đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110
• 4.3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110
• 4.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển, khả năng phân hủy lông gia súc và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110
• 4.3.5. Ảnh hưởng của thời gian đến sự phân hủy sợi lông nguyên của 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110
• 4.3.6. Tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn phân giải keratin trong luận án
• 4.3.7. Phương thức bảo quản bộ giống – các chủng vi khuẩn phân giải keratin
• 4.3.8. Kiểm tra tính ổn định hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn đã định danh
• 4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn phân hủy mạnh lông gia cầm được tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà thả vườn
• 4.4.1. Tính an toàn sinh học của chủng Bacillus megaterium K79
• 4.4.2. Sử dụng chủng Bacillus megaterium K79 để ủ lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà ta thả vườn
• 4.4.3. Kết quả kiểm tra Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột lông sinh học thu được từ lông gia cầm phân hủy bởi chủng vi khuẩn K79
• 4.4.4. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của bột lông sinh học thu được từ lông gia cầm được phân hủy bởi chủng vi khuẩn K79
• 4.4.5. Kết quả thí nghiệm nuôi gà
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1
• PHỤ LỤC 2
• PHỤ LỤC 3
• PHỤ LỤC 4
• PHỤ LỤC 5
• PHỤ LỤC 6
• PHỤ LỤC 7
• PHỤ LỤC 8
• PHỤ LỤC 9

Tóm tắt

I. Phân lập vi khuẩn phân giải keratin

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải keratin từ các mẫu chất thải chăn nuôi. Tổng cộng 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa đã được phân lập, trong đó 115 chủng có khả năng phân giải keratin hiệu quả. Các mẫu được thu thập từ đất, nước và lông gia cầm tại các cơ sở giết mổ ở Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn này có khả năng giảm khối lượng bột lông gia cầm từ 20,87% đến 84,31% sau một tuần ủ ở 37°C. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn phân giải keratin trong xử lý chất thải chăn nuôi.

1.1. Phương pháp phân lập

Các mẫu được thu thập từ môi trường tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường chứa bột lông gia cầm làm nguồn carbon và nitơ duy nhất. Quá trình phân lập bao gồm việc sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinase trên môi trường azokeratin. Kết quả phân tích cho thấy 115 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy keratin hiệu quả, được chọn để tiếp tục nghiên cứu.

1.2. Đánh giá hiệu quả phân hủy

Các chủng vi khuẩn được đánh giá dựa trên khả năng giảm khối lượng bột lông gia cầm. Kết quả cho thấy, sau một tuần ủ, khối lượng bột lông giảm đáng kể, từ 20,87% đến 84,31%. Điều này chứng minh hiệu quả của vi khuẩn phân giải keratin trong xử lý chất thải chăn nuôi.

II. Tuyển chọn vi khuẩn phân giải keratin

Từ 429 chủng vi khuẩn phân lập, 26 chủng có khả năng phân hủy keratin hiệu quả nhất được tuyển chọn. Các chủng này được định danh bằng hệ thống phân loại Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy phần lớn các chủng thuộc lớp Bacilli (73,08%), trong đó Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 là hai chủng có khả năng phân hủy keratin tốt nhất. Hai chủng này được chọn để nghiên cứu sâu hơn về điều kiện nuôi cấy và ứng dụng thực tế.

2.1. Định danh vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được định danh bằng hệ thống phân loại Bergey và giải trình tự gen 16S rRNA. Kết quả cho thấy phần lớn các chủng thuộc lớp Bacilli, với Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 là hai chủng có khả năng phân hủy keratin tốt nhất.

2.2. Phân tích phát sinh loài

Phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy mối liên hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn được tuyển chọn. Kết quả này giúp xác định rõ hơn về nguồn gốc và đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân giải keratin.

III. Ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi

Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi tập trung vào việc sản xuất bột lông sinh học từ lông gia cầm. Bacillus megaterium K79 được sử dụng để ủ lông gia cầm trong 10 tuần, tạo ra sản phẩm bột lông sinh học an toàn vi sinh. Sản phẩm này được bổ sung vào khẩu phần ăn của gà thả vườn với tỷ lệ 2%, 5% và 8%. Kết quả cho thấy, tỷ lệ bổ sung 5% giúp gà sinh trưởng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100% và các chỉ tiêu thân thịt tương đương với nhóm đối chứng.

3.1. Sản xuất bột lông sinh học

Bacillus megaterium K79 được sử dụng để ủ lông gia cầm trong 10 tuần, tạo ra sản phẩm bột lông sinh học an toàn vi sinh. Sản phẩm này có giá trị dinh dưỡng cao và được sử dụng làm thức ăn bổ sung protein cho gà thả vườn.

3.2. Hiệu quả trong chăn nuôi

Bột lông sinh học được bổ sung vào khẩu phần ăn của gà thả vườn với tỷ lệ 2%, 5% và 8%. Kết quả cho thấy, tỷ lệ bổ sung 5% giúp gà sinh trưởng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100% và các chỉ tiêu thân thịt tương đương với nhóm đối chứng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Chất thải lông gia súc và gia cầm phát sinh từ hoạt động chăn nuôi và giết mổ chiếm khối lượng lớn trong chất thải nông nghiệp. Đến năm 2016, tổng sản lượng thịt tiêu thụ tại Việt Nam đạt hàng triệu tấn (thịt trâu 86,6 nghìn tấn; thịt bò 308,6 nghìn tấn; thịt heo 3,7 triệu tấn; thịt gia cầm 961,6 nghìn tấn), kéo theo sự tập trung của hơn 28.000 điểm giết mổ trên toàn quốc, phần lớn là các cơ sở nhỏ lẻ chưa có hệ thống xử lý chất thải đạt chuẩn. Lông gia súc, gia cầm chứa hàm lượng protein thô cao (trên 90%), trong đó thành phần chủ yếu là keratin bền vững, rất khó phân hủy tự nhiên. Các phương pháp xử lý truyền thống như đốt hoặc chôn lấp gây ô nhiễm môi trường đất, không khí và nguồn nước ngầm. Phương pháp thủy phân lý hóa (nhiệt độ và áp suất cao) đòi hỏi chi phí năng lượng lớn, đồng thời làm phá hủy các acid amin thiết yếu nhạy cảm với nhiệt như methionine, lysine, tryptophan và tạo ra các hợp chất khó tiêu hóa như lanthionine, lysinoalanine. Hướng tiếp cận sinh học sử dụng vi khuẩn bản địa có khả năng sinh enzyme keratinase ngoại bào để phân giải keratin và tái chế thành bột lông sinh học giàu dinh dưỡng là giải pháp cần được nghiên cứu thực nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể như sau:

1. Tuyển chọn và định danh được một số chủng vi khuẩn từ các cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm của vùng Đồng bằng sông Cửu Long có khả năng phân hủy hiệu quả lông gia súc, gia cầm.
2. Thiết kế được quy trình nuôi cấy thích hợp cho một số chủng vi khuẩn được tuyển chọn có khả năng phân giải keratin mạnh.
3. Ứng dụng chủng vi khuẩn được tuyển chọn để xử lý nguồn chất thải lông gia cầm nhằm tạo thành thức ăn bổ sung protein cho ngành chăn nuôi.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa có khả năng phân giải keratin, chất thải lông gia súc (lông heo), lông gia cầm (lông gà), sản phẩm bột lông sinh học và gà thịt thả vườn (giống gà ta Gò Công).
• Phạm vi không gian: Khảo sát hiện trạng và thu thập mẫu môi trường (đất, nước thải, lông) tại các cơ sở giết mổ và trại chăn nuôi gia súc, gia cầm thuộc thành phố Cần Thơ, tỉnh Vĩnh Long và tỉnh Đồng Tháp; các thí nghiệm phân tích vi sinh, sinh học phân tử và thử nghiệm chăn nuôi được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ.
• Phạm vi thời gian: Các nội dung điều tra, phân lập, khảo sát điều kiện nuôi cấy và thử nghiệm dinh dưỡng được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các công trình nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận khả năng phân giải keratin của nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Về nhóm nấm, các nghiên cứu của Dozie et al. (1994) trên Chrysosporium keratinophilum và Sanghvi et al. (2011) trên Chrysosporium asperatum đã chứng minh hoạt tính keratinase chịu nhiệt. Đối với nhóm xạ khuẩn, Letourneau et al. (1998) nghiên cứu Streptomyces albidoflavus, Chitte et al. (1999) khảo sát Streptomyces thermoviolaceus SD8, De Azeredo et al. khảo sát Streptomyces cereus 594, và Böckle et al. (1995, 1997) công bố các phát hiện về Streptomyces pactum DSM 40530. Về nhóm vi khuẩn, Williams et al. (1990) và Lin et al. (1995) đã phân lập, giải mã trình tự gen kerA của Bacillus licheniformis PWD-1; Matikevičienė et al. (2009) khảo sát Bacillus licheniformis 511 và Bacillus subtilis 103; Geun-Tae Park et al. (2009) nghiên cứu khả năng phân giải lông của Bacillus megaterium F7-1; Friedrich and Antranikian (1996), Nam GW (2002), cùng Yong-Jik Lee et al. (2015) khảo sát các vi khuẩn cực hạn chịu nhiệt thuộc chi Fervidobacterium (F. pennavorans, F. islandicum AW-1). Ngoài ra, các chi vi khuẩn khác như Chryseobacterium (Riffel and Brandelli, 2002), Vibrio (Sangali and Brandelli, 2000), Kocuria rosea (Bernal et al., 2006) cũng được ghi nhận khả năng phân hủy keratin.

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về vi sinh vật phân giải keratin còn hạn chế. Nguyễn Đình Quyến và Trần Thị Lan Phương (2001) đã phân lập 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus từ đất cơ sở giết mổ tại miền Bắc. Nguyễn Huy Hoàng và ctv. (2010) phân lập các chủng Bacillus và Chryseobacterium có khả năng thủy phân lông vũ từ 75% đến 90% sau 1 tuần. Nguyễn Thu Hiền và ctv. (2010, 2013) nghiên cứu chủng Chryseobacterium phân hủy lông vũ. Các công trình này chủ yếu dừng lại ở mức độ khảo sát đặc tính sinh học trong phòng thí nghiệm tại khu vực phía Bắc.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là:

• Chưa có nghiên cứu hệ thống về việc phân lập, sàng lọc tập đoàn vi khuẩn phân giải keratin bản địa thích nghi với điều kiện sinh thái vùng Đồng bằng sông Cửu Long.
• Chưa có nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy đối với các chủng vi khuẩn phân giải keratin bản địa nhằm nâng cao hiệu suất phân hủy cơ chất tự nhiên.
• Chưa có quy trình ứng dụng chủng vi khuẩn bản địa để sản xuất bột lông sinh học quy mô phòng thí nghiệm và đánh giá thực nghiệm việc sử dụng bột lông sinh học làm nguồn protein thay thế trong khẩu phần thức ăn chăn nuôi gia cầm thả vườn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc hóa sinh của keratin và cơ chế xúc tác enzyme vi sinh vật:

• Cấu trúc keratin: Keratin là protein dạng sợi thuộc tế bào biểu mô động vật có xương sống, gồm $\alpha$-keratin (cấu trúc chuỗi xoắn $\alpha$, liên kết hydro, phổ biến ở lông mao, móng vuốt gia súc) và $\beta$-keratin (cấu trúc phiến gấp $\beta$, liên kết chéo dày đặc bằng cầu nối disulfide $-S-S-$, phổ biến ở lông vũ gia cầm).
• Cơ chế phân giải keratin của vi khuẩn: Theo cơ chế phối hợp giữa hệ thống phân giải protein (proteolytic) và phân giải sulfit (sulfitolytic). Sự phân hủy gồm hai giai đoạn: phá vỡ các cầu nối disulfide nhờ enzyme disulfide reductase và các chất khử do tế bào vi khuẩn tiết ra, tiếp theo là sự phân cắt các liên kết peptide dọc theo khung polypeptide bởi enzyme ngoại bào keratinase (EC 3.4.21/EC 3.4.99).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ:

• Phương pháp điều tra: Sử dụng phiếu điều tra thu thập thông tin về công suất giết mổ, khối lượng chất thải và phương thức xử lý lông tại các cơ sở trên địa bàn Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp.
• Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Thu 198 mẫu (đất, nước thải, lông gia súc, lông gia cầm). Sử dụng môi trường khoáng tối thiểu bổ sung bột lông gia cầm (MT1) hoặc bột lông gia súc (MT3) làm nguồn carbon và nitơ duy nhất để phân lập. Đánh giá hoạt tính keratinase bằng cơ chất azokeratin (đo mật độ quang OD) và xác định tỷ lệ phân hủy bột lông thông qua phương pháp sấy khô, cân chênh lệch khối lượng cơ chất trước và sau nuôi cấy lắc ở các nhiệt độ 37°C, 45°C, 50°C, 55°C.
• Phương pháp định danh vi khuẩn: Kết hợp phương pháp hình thái học, đặc điểm hóa sinh theo khóa phân loại Bergey (35 nhóm) và kỹ thuật sinh học phân tử. Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB, khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt, giải trình tự gen, tra cứu độ tương đồng trên GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST và thiết lập cây phát sinh loài bằng phần mềm chuyên dụng.
• Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy: Bố trí thí nghiệm đơn yếu tố và đa yếu tố khảo sát nhiệt độ (30°C đến 45°C), pH ban đầu (5,0 đến 9,0), nồng độ dịch vi khuẩn đưa vào (2%, 5%, 8%, 10%), nguồn carbon bổ sung (glucose, fructose, sucrose, maltose, tinh bột, rỉ đường...), nguồn nitơ bổ sung (peptone, cao thịt, cao nấm men, urê, muối amon, muối nitrat...) và thời gian nuôi ủ sợi lông nguyên (từ 1 đến 10 tuần).
• Phương pháp đánh giá an toàn và giá trị dinh dưỡng: Kiểm tra mật số vi sinh vật chỉ thị gây bệnh (Salmonella, Coliforms, E. coli) theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7136:2002 và Thông tư 14/2011/TT-BNNPTNT. Phân tích thành phần hóa học (vật chất khô, protein thô, lipid, khoáng tổng số, xơ thô, canxi, phospho), hàm lượng các acid amin và tỷ lệ tiêu hóa protein in vitro.
• Phương pháp thử nghiệm chăn nuôi: Thí nghiệm nuôi dưỡng trên gà ta Gò Công qua hai giai đoạn (5–10 tuần tuổi và 11–14 tuần tuổi) với 4 nghiệm thức khẩu phần (bổ sung 0%, 2%, 5%, 8% bột lông sinh học thay thế protein thức ăn cơ sở). Theo dõi tăng trọng, lượng thức ăn tiêu thụ, hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR), tỷ lệ sống và các chỉ tiêu thân thịt (tỷ lệ thân thịt, tỷ lệ thịt đùi, tỷ lệ thịt ức, tỷ lệ mỡ bụng).
• Phân tích thống kê: Xử lý số liệu bằng phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Duncan trên phần mềm thống kê để so sánh sự sai khác giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng ô nhiễm môi trường do chất thải lông gia súc, gia cầm tại các cơ sở giết mổ vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Tác giả xác định mục tiêu tổng quát là tuyển chọn các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tính keratinase mạnh, thiết lập quy trình nuôi cấy tối ưu và ứng dụng sản xuất bột lông sinh học bổ sung vào khẩu phần nuôi gà thịt. Nội dung nghiên cứu gồm 4 hợp phần với 12 thí nghiệm thực nghiệm. Chương cũng nêu rõ các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 tổng hợp cơ sở lý luận và các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến đề tài. Nội dung bao gồm:

• Đặc điểm hóa học và phân loại keratin ($\alpha$-keratin và $\beta$-keratin).
• Đánh giá so sánh các phương pháp phân giải keratin lý hóa và sinh học.
• Bản chất enzyme keratinase, trọng lượng phân tử (từ 18 đến 200 kDa), điều kiện hoạt động tối ưu và các tác nhân ức chế/kích hoạt ion kim loại.
• Cơ chế phân giải phối hợp giữa enzyme khử cầu nối disulfide và protease cắt mạch peptide.
• Điểm luận các công trình nghiên cứu về vi khuẩn phân giải keratin thuộc các chi Bacillus, Streptomyces, Fervidobacterium, Chryseobacterium, Pseudomonas, Vibrio.
• Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp keratinase (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitơ).
• Nhu cầu dinh dưỡng ở gia cầm, vai trò của các acid amin thiết yếu (lysine, methionine) và các nghiên cứu về việc sử dụng bột lông vũ làm thức ăn chăn nuôi.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả chi tiết vật liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình thực hiện 12 thí nghiệm thuộc 4 nội dung nghiên cứu:

• Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng tại các cơ sở giết mổ ở Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp.
• Nội dung 2: Quy trình thu mẫu, phân lập trên môi trường chọn lọc (MT1, MT3), tăng sinh (MT2, MT4); phương pháp đo hoạt tính keratinase trên azokeratin và đánh giá tỷ lệ giảm khối lượng bột lông; phương pháp nhuộm Gram, thử nghiệm sinh hóa theo Bergey; quy trình tách DNA, chạy PCR nhân bản gen 16S rRNA và phân tích cây phát sinh loài.
• Nội dung 3: Bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, tỷ lệ giống cấy, nguồn carbon và nitơ đến mật số tế bào, tỷ lệ phân hủy bột lông và hàm lượng protein hòa tan của 2 chủng được tuyển chọn (Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110); quy trình ủ sợi lông nguyên trong thời gian 10 tuần.
• Nội dung 4: Quy trình công nghệ sản xuất bột lông sinh học bằng chủng K79; phương pháp kiểm tra vi sinh an toàn; phương pháp phân tích thành phần hóa học; quy trình bố trí thí nghiệm nuôi dưỡng 120 cá thể gà ta Gò Công theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm và thảo luận khoa học:

1. Hiện trạng chất thải lông: Kết quả điều tra cho thấy phần lớn cơ sở giết mổ tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp có quy mô nhỏ lẻ, phương thức xử lý chất thải lông chủ yếu là đốt, chôn lấp hoặc thải trực tiếp ra hệ thống thoát nước chung, gây ô nhiễm cục bộ.

2. Kết quả phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn:

• Phân lập được tổng số 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa:
  • 115 chủng phân giải lông gia cầm từ 42 mẫu thu tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp; tỷ lệ làm giảm khối lượng bột lông gia cầm dao động từ 20,87% đến 84,31% sau 1 tuần lắc ở 37°C.
  • 225 chủng phân giải lông gia súc từ 126 mẫu; tỷ lệ làm giảm khối lượng bột lông heo dao động từ 6,27% đến 63,38%.
  • 89 chủng chịu nhiệt từ 30 mẫu (23 mẫu đất, 7 mẫu nước); tỷ lệ làm giảm khối lượng bột lông gia cầm đạt từ 7,54% đến 66,66% ở 45°C.

Nhóm vi khuẩn phân lập	Số mẫu thu thập	Số chủng phân lập	Tỷ lệ phân hủy bột lông sau 1 tuần (%)
Vi khuẩn phân giải lông gia cầm	42	115	20,87 - 84,31 (ở 37°C)
Vi khuẩn phân giải lông heo	126	225	6,27 - 63,38 (ở 37°C)
Vi khuẩn chịu nhiệt phân giải lông	30	89	7,54 - 66,66 (ở 45°C)

• Tuyển chọn 26 chủng có hiệu suất phân hủy cao nhất để định danh theo hệ thống Bergey kết hợp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. Kết quả phân loại cho thấy sự đa dạng gồm 4 lớp vi khuẩn: Bacilli chiếm ưu thế với 73,08% (19 chủng), Gammaproteobacteria chiếm 15,38% (4 chủng), Flavobacteriia chiếm 7,69% (2 chủng), và Betaproteobacteria chiếm 3,85% (1 chủng).
• Tuyển chọn được 2 chủng ưu việt nhất: chủng Bacillus megaterium K79 (phân hủy lông gia cầm mạnh nhất) và chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 (phân hủy lông gia súc mạnh nhất).

3. Kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu:

• Đối với Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110, điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất đạt được tại: nhiệt độ 35°C, pH 8,0, nồng độ dịch vi khuẩn cấy ban đầu là 10% (v/v).
• Môi trường chỉ sử dụng cơ chất bột lông tự nhiên làm nguồn carbon và nitơ duy nhất cho hiệu suất phân giải tối ưu, việc bổ sung thêm các nguồn đường đơn hay muối nitơ vô cơ không làm tăng đáng kể hiệu suất phân hủy lông.
• Thử nghiệm ủ cơ chất lông nguyên vẹn: Sau 10 tuần nuôi ủ, chủng Bacillus megaterium K79 phân hủy hoàn toàn 100% sợi lông gà nguyên; chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 đạt hiệu suất phân hủy 38,5% sợi lông heo nguyên.

4. Ứng dụng chế biến bột lông sinh học và thử nghiệm nuôi gà:

• Sản phẩm bột lông sinh học thu được từ quá trình ủ lông gà với chủng Bacillus megaterium K79 đạt độ an toàn vi sinh vật: không phát hiện Salmonella, mật số Coliforms và E. coli nằm trong giới hạn cho phép theo TCVN 7136:2002 và Thông tư 14/2011/TT-BNNPTNT.
• Hàm lượng protein thô và tỷ lệ acid amin hòa tan trong bột lông sinh học được cải thiện đáng kể so với bột lông xử lý nhiệt cơ học.
• Thử nghiệm nuôi dưỡng gà ta Gò Công (5–14 tuần tuổi): Nghiệm thức bổ sung 5% bột lông sinh học vào khẩu phần cho kết quả tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn và tỷ lệ nuôi sống (đạt 100%) tương đương với nghiệm thức đối chứng sử dụng thức ăn tiêu chuẩn; các chỉ tiêu thân thịt (tỷ lệ thân thịt, tỷ lệ thịt đùi, thịt ức) không có sự sai khác mang ý nghĩa thống kê so với đối chứng.

Nghiệm thức khẩu phần	Tỷ lệ nuôi sống (%)	Khối lượng xuất chuồng lúc 14 tuần (g/con)	Tỷ lệ thân thịt (%)	Tỷ lệ mỡ bụng (%)
Đối chứng (0% bột lông sinh học)	100	Đạt tiêu chuẩn sinh trưởng	Tương đương đối chứng	Không sai khác có ý nghĩa
Bổ sung 2% bột lông sinh học	100	Sinh trưởng tốt	Tương đương đối chứng	Không sai khác có ý nghĩa
Bổ sung 5% bột lông sinh học	100	Tương đương đối chứng	Tương đương đối chứng	Không sai khác có ý nghĩa
Bổ sung 8% bột lông sinh học	100	Thấp hơn mức 5%	Tương đương đối chứng	Không sai khác có ý nghĩa

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Chương cuối cùng tổng kết các kết quả đạt được của toàn bộ 4 nội dung nghiên cứu và đưa ra các đề xuất kỹ thuật:

• Kết luận: Đã phân lập, định danh tập đoàn 429 chủng vi khuẩn phân giải keratin bản địa, tuyển chọn được 2 chủng Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 có hoạt tính cao, xác lập các thông số môi trường nuôi cấy tối ưu và chứng minh khả năng sử dụng bột lông sinh học K79 ở tỷ lệ 5% trong khẩu phần nuôi gà thịt thả vườn.
• Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ rút ngắn thời gian ủ phân hủy lông, thử nghiệm sản xuất chế phẩm enzyme keratinase cố định và mở rộng ứng dụng trên các đối tượng gia súc, gia cầm khác.

Kết quả và những đóng góp mới

Về mặt học thuật và lý luận:

• Cung cấp dẫn liệu khoa học có tính hệ thống đầu tiên về đặc tính sinh học, hoạt tính enzyme keratinase và cấu trúc phân loại của tập đoàn vi khuẩn bản địa phân giải keratin từ nguồn chất thải chăn nuôi, giết mổ tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
• Xác định được sự phân bố phát sinh loài của 26 chủng vi khuẩn phân giải keratin mạnh dựa trên trình tự gen 16S rRNA, trong đó lớp Bacilli chiếm tỷ lệ ưu thế (73,08%), bên cạnh các đại diện thuộc Gammaproteobacteria (15,38%), Flavobacteriia (7,69%) và Betaproteobacteria (3,85%).
• Bổ sung 26 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin mạnh vào bộ sưu tập giống vi sinh vật hữu ích của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.

Về mặt thực tiễn và ứng dụng:

• Xác lập được các thông số môi trường tối ưu (nhiệt độ 35°C, pH 8,0, nồng độ dịch vi khuẩn 10%, cơ chất bột lông tự nhiên) cho 2 chủng vi khuẩn bản địa Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110.
• Xây dựng quy trình ủ sinh học xử lý phế phẩm lông gia cầm bằng chủng Bacillus megaterium K79 trong 10 tuần, phân hủy hoàn toàn 100% sợi lông nguyên và tạo ra sản phẩm bột lông sinh học đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh vi sinh vật.
• Chứng minh tính khả thi của việc sử dụng bột lông sinh học thay thế protein thức ăn với tỷ lệ bổ sung 5% trong khẩu phần nuôi gà ta Gò Công thả vườn, giúp gà duy trì tăng trọng tốt, đạt tỷ lệ sống 100% và các chỉ tiêu thân thịt tương đương lô đối chứng.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

• Đề xuất áp dụng quy trình xử lý lông gia cầm bằng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 tại các cơ sở chăn nuôi và giết mổ gia cầm quy mô vừa và nhỏ để giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo nguồn nguyên liệu thức ăn giàu đạm.
• Khuyến nghị bổ sung bột lông sinh học ở mức 5% vào công thức phối trộn thức ăn cho gà thịt thả vườn nhằm giảm giá thành thức ăn chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Thời gian ủ phân giải hoàn toàn sợi lông gà nguyên bản bằng phương pháp vi sinh kéo dài (10 tuần), chưa tối ưu hóa cho quy mô công nghiệp sản xuất liên tục.
• Hiệu suất phân hủy cơ chất sợi lông heo nguyên vẹn của chủng Brevibacillus parabrevis Kr110 sau 10 tuần nuôi cấy mới đạt 38,5%, do cấu trúc keratin của lông gia súc có mật độ liên kết disulfide cao và độ cứng lớn hơn lông vũ.
• Thử nghiệm chăn nuôi mới dừng lại ở quy mô nông hộ thí nghiệm trên đối tượng gà ta Gò Công, chưa khảo sát trên các giống vật nuôi khác hoặc trong điều kiện nuôi thâm canh quy mô lớn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Nghiên cứu phối hợp các chủng vi sinh vật hoặc bổ sung các enzyme khử disulfide nhằm rút ngắn thời gian phân hủy cơ chất lông nguyên.
• Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme keratinase từ chủng Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 để ứng dụng trong các quy trình sinh học nhanh.
• Thử nghiệm mở rộng ứng dụng sản phẩm bột lông sinh học trên các đối tượng vật nuôi khác như vịt, heo, thủy sản và đánh giá hiệu quả kinh tế trên quy mô trang trại thương mại.

Giá trị tham khảo

Luận án cung cấp nguồn tư liệu và giá trị ứng dụng cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ Sinh học: Tham khảo phương pháp luận phân lập vi sinh vật bằng môi trường cơ chất chọn lọc duy nhất, quy trình kết hợp phân loại Bergey với phân tích trình tự gen 16S rRNA, cùng các kỹ thuật xác định hoạt tính keratinase bằng cơ chất azokeratin.
• Nhà nghiên cứu và chuyên gia dinh dưỡng động vật thuộc ngành Chăn nuôi - Thú y: Tham khảo dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học, tỷ lệ tiêu hóa acid amin của bột lông sinh học và phương pháp bố trí thí nghiệm dinh dưỡng trên gia cầm thả vườn.
• Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi và cán bộ quản lý môi trường nông nghiệp: Sử dụng quy trình kỹ thuật ủ vi sinh phế phẩm giết mổ làm cơ sở xây dựng các mô hình xử lý chất thải hữu cơ tuần hoàn, thân thiện với môi trường tại các địa phương thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn phân giải keratin và thu thập từ những nguồn mẫu nào?
Tác giả đã phân lập được tổng cộng 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa từ 198 mẫu môi trường (đất, nước thải, lông) thu tại Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Trong đó gồm: 115 chủng phân giải lông gia cầm (từ 42 mẫu), 225 chủng phân giải lông heo (từ 126 mẫu), và 89 chủng chịu nhiệt phân giải lông gia cầm (từ 30 mẫu).

2. Hai chủng vi khuẩn nào được tuyển chọn có hoạt tính phân giải keratin mạnh nhất và kết quả định danh loài của chúng là gì?
Hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn có hiệu suất cao nhất là:

• Chủng K79: Định danh là Bacillus megaterium K79, có khả năng phân hủy bột lông gia cầm cao nhất và phân hủy 100% sợi lông gà nguyên sau 10 tuần nuôi ủ.
• Chủng Kr110: Định danh là Brevibacillus parabrevis Kr110, có khả năng phân giải lông heo mạnh nhất và phân hủy 38,5% sợi lông heo nguyên sau 10 tuần.

3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho hai chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 được xác định như thế nào?
Cả hai chủng vi khuẩn đều đạt hiệu quả phân hủy lông cao nhất trong điều kiện môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 35°C, pH 8,0, nồng độ dịch vi khuẩn cấy truyền ban đầu là 10% (v/v), và sử dụng trực tiếp cơ chất bột lông tự nhiên làm nguồn carbon và nitơ duy nhất mà không cần bổ sung thêm nguồn đường hay đạm ngoài.

4. Bột lông sinh học từ chủng Bacillus megaterium K79 có đáp ứng tiêu chuẩn an toàn vi sinh không và tỷ lệ bổ sung tối ưu trong khẩu phần gà thịt là bao nhiêu?
Sản phẩm bột lông sinh học đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh theo TCVN 7136:2002 và Thông tư 14/2011/TT-BNNPTNT (không phát hiện vi khuẩn Salmonella, mật số Coliforms và E. coli nằm trong ngưỡng cho phép). Khi bổ sung vào khẩu phần nuôi gà ta Gò Công thả vườn ở mức 5%, gà sinh trưởng tốt, tỷ lệ nuôi sống đạt 100%, các chỉ tiêu tăng trọng và phẩm chất thân thịt tương đương nghiệm thức đối chứng.

5. Kết quả phân tích sinh học phân tử đoạn gen 16S rRNA của 26 chủng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy đặc điểm đa dạng loài như thế nào?
Phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA và thiết lập cây phát sinh loài của 26 chủng vi khuẩn có hoạt tính cao cho thấy: 73,08% số chủng thuộc lớp Bacilli, 15,38% thuộc lớp Gammaproteobacteria, 7,69% thuộc lớp Flavobacteriia và 3,85% thuộc lớp Betaproteobacteria.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Quách Thị Thanh Tâm đã thực hiện nghiên cứu thực nghiệm có hệ thống về việc phân lập, tuyển chọn và định danh 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa phân giải chất thải lông tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Nghiên cứu đã xác định được hai chủng ưu việt là Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110, đồng thời thiết lập các thông số nuôi cấy tối ưu ở 35°C và pH 8,0 trên cơ chất bột lông tự nhiên. Quy trình ứng dụng chủng Bacillus megaterium K79 ủ lông gà trong 10 tuần đã tạo ra sản phẩm bột lông sinh học đạt tiêu chuẩn an toàn vi sinh, giàu dinh dưỡng và thay thế hiệu quả 5% nguồn đạm trong khẩu phần nuôi gà ta thả vườn. Kết quả luận án cung cấp cơ sở khoa học và giải pháp kỹ thuật xử lý chất thải hữu cơ giàu keratin phục vụ phát triển chăn nuôi bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH HÂN CẦN THƠ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC TS B I TH MINH DI U PGS TS NGUYỄN NH T U N DUNG CẦN THƠ - 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VI T NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh thực hiện Quách Th Thanh T mKER TIN TỪ CHẤT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 1 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 2SÖC - GI CẦ TS B I TH MINH DI UM PGS.TS NGUYỄN NH T U N DUNG i LỜI CÁM ƠN Với tất cả lòng biết ơn s u sắc, tôi xin ch n thành cám ơn TS i Th Minh iệu và PGS. Nguy n Nhựt Xu n ung đã tận tình hƣớng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án này ô là ngƣời truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ Xin cám ơn Cô đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp tôi có đƣợc ngh lực và đ nh hƣớng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự quan t m, hỗ trợ của an lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học-trƣờng Đại học ần Thơ, quý Thầy ô Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học, quý Thầy ô Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đại học ần Thơ, đã giúp tôi có thêm nhiều ngh lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu Xin cám ơn: án bộ phòng Thí nghiệm chuyên s u, phòng thí nghiệm Sinh học ph n tử Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ sinh học-Trƣờng Đại học ần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu ạn Kim Ngọc, các bạn Nghiên cứu sinh, học viên ao học và các em Sinh viên đã đồng hành c ng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia s những khó khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu uối c ng, xin đƣợc gởi lời biết ơn đến Trƣờng ao đ ng ộng Đồng Vĩnh Long đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành kế hoạch học tập toàn khóa trong chƣơng trình đào tạo tiến sĩ h n thành cám ơn ii TÓM LƢỢC L ng gi s gia cầm là phế phẩm đượ t o r với khối lượng lớn từ hăn nu i và giết mổ gi s gia cầm. Với thành phần chính là keratin (90%), lông khó phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến m i trường.

Sử dụng vi huẩn để phân hủy nguồn chất thải này đ ng là hướng đi mới, vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm m i trường l i vừa tận dụng sản phẩm để bổ sung vào thứ ăn hăn nu i ho làm ph n n sinh h Luận án bao gồm 4 nội dung với 12 thí nghiệm nhằm phân lập, tuyển ch n, định danh và khảo sát á điều kiện nuôi cấy phù hợp của các hủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy hất thải l ng gi s gi ầm hiệu quả cao, từ đ ứng ụng ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 thành bột lông sinh h c dùng nuôi gà thả vườn. Tổng cộng có 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chất thải l ng được phân lập. Trong đ 115 hủng vi huẩn phân giải er tin được phân lập trên m i trường với bột lông gia cầm đượ ùng như nguồn carbon và nitơ uy nhất từ 42 mẫu (đất, nước và lông gia cầm) thu ở á ơ sở giết mổ gi ầm thuộc thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp; 225 hủng vi huẩn ng đượ ph n lập từ 126 mẫu (đất, nướ và l ng heo ở á ơ sở giết mổ gi s Đ c biệt 89 chủng vi khuẩn hịu nhiệt hiếu h hả năng ph n hủy l ng gi ầm ng được phân lập từ 23 mẫu đất và 7 mẫu nước thu t i ơ sở giết mổ và tr i hăn nu i gi ầm ở Vĩnh Long và Đồng Tháp Các hủng vi huẩn phân lập đượ đều thể hiện ho t t nh er tin se trên ơ hất azokeratin. Kết quả ph n t h hả năng ph n hủy ột l ng ho thấy 115 hủng vi huẩn ph n hủy ột l ng gi ầm đ làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 20,87% đến 84,31% s u một tuần lắ ủ ở 37o ; 225 hủng vi huẩn ph n hủy l ng heo đ làm giảm hối lượng ột l ng heo từ 6,27% đến 63,38% và 89 hủng vi huẩn hịu nhiệt ng làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 7,54% đến 66,66% Trong 429 hủng vi huẩn này, 26 hủng vi huẩn hả năng ph n hủy l ng gi s , gi ầm hiệu quả nhất đượ tuyển h n và định nh theo hệ thống ph n lo i ergey ết hợp với giải tr nh t đo n gen 16S rRN y phát sinh loài đượ v từ á tr nh t đo n gen 16S rRN ủ 26 hủng vi huẩn đượ tuyển h n đ thể hiện mối liên hệ i truyền gi h ng Ngoài r , ết quả n ho thấy phần lớn vi huẩn đượ tuyển h n thuộ lớp Bacilli (73,08% , á hủng vi huẩn n l i thuộ lớp et proteo teri (3,85% , lớp l vo teri (7,69% và lớp mm proteo teri (15,38% iii hủng vi huẩn illus meg terium K79 ph n hủy l ng gi ầm tốt nhất và hủng vi huẩn revi illus p r revis Kr110 ph n hủy l ng gi s tốt nhất đượ tuyển h n để tiếp tụ nghiên ứu về m i trường nu i ấy Kết quả nghiên ứu ho thấy hả năng ph n hủy ột l ng gi ầm ủ illus megaterium K79 và hả năng ph n hủy ột l ng heo ủ revi illus p r revis Kr110 ùng đ t hiệu quả o nhất trong m i trường nu i ấy nhiệt độ 35o và p 8,0 với nồng độ ị h vi huẩn đư vào 10% và h ột l ng là nguồn inh ư ng hứ r on và nitơ Thời gi n nu i ủ sợi l ng gi ầm nguyên với illus meg terium K79 trong 10 tuần ho ết quả ph n hủy là 100% và thời gi n nu i ủ sợi l ng heo nguyên với revi illus p r revis Kr110 trong 10 tuần ho hiệu suất ph n hủy là 38,5% Trong th nghiệm nu i gà, hủng vi huẩn illus meg terium K79 đượ ứng ụng để ủ l ng gi ầm trong 10 tuần đ t o đượ ột l ng sinh h đ t mứ n toàn vi sinh và đượ ùng như nguồn th liệu ung ấp đ m trong hẩu phần với mứ 2%, 5%, 8% ùng nu i ư ng gà thả vườn thành ng Với mứ ổ sung 5% ột l ng sinh h vào hẩu phần đ gi p gà sinh trưởng tốt, t lệ nu i sống o (100% với á h tiêu sinh trưởng và á h tiêu th n thịt tốt đ t tương đương với nghiệm thứ đối hứng T m l i, vi huẩn ph n giải er tin ản đị trong nghiên ứu này có tiềm năng ứng ụng th tế nhờ đáp ứng tốt 3 yêu ầu qu n tr ng: gi p xử lý nguồn nhiễm m i trường từ phế phẩm l ng gi s , gi ầm; gi p tái hế iến nguồn phế phẩm này thành thứ ăn ổ sung protein với giá trị inh ư ng và hả năng tiêu h o cho vật nu i; t o m i trường th n thiện Từ khoá: Bacillus megaterium, Brevibacillus parabrevis Kr110, bột lông sinh học, ch tiêu th n th t tốt, gà thả vƣờn, t l ph n hủy lông iv ABSTRACT Feather and cattle hair were the waste generated in large quantity from livestock and slaughterhouses.

Because their main component is keratin (90%), they are difficultly degraded and become a serious environmental pollutants. Using bacteria to decompose these wastes was a new solution to solve the environmental pollution and used the product as animal supplement feed or bio-fertilizer. This dissertation was carried out on 4 contents with 12 experiments to isolate, screen, identify and survey the suitable culture conditions of two selected keratinolytic bacteria isolates that showing the most effective capacity in feather and pig hair degradation and apply one of them for production biological feather meal as feed supplementation for raising backyard chicken. A total of 429 indigenous aerobic keratinolytic bacteria were isolated.

Specifically, 115 keratinolytic bacterial strains were isolated on agar medium with feather powder used as the sole carbon and nitrogen source from 42 samples (soil, waste water and poultry feather) collecting from the poultry slaughterhouse in Can Tho city, Vinh Long and Dong Thap; 225 keratinolytic bacterial strains were also isolated from 126 samples (soil, waste water and pig hair) collecting from the cattle slaughterhouses. Especially 89 thermophilic keratinolytic strains were isolated from 23 samples of soil, 7 waste water samples collecting from the poultry processing plants and farm in Vinh Long and Dong Thap. All isolated bacteria showed keratinase activity on azokeratin. Results of feather degrading capacity analysis showing 115 strains isolated on feather powder media reduced the feather powder from 20,87% to 84,31% after shaking incubation for a week at 37°C; 225 pig hair strains revealed decomposed capacity from 6,27% to 63,38% in pig hair powder decomposition; and 89 thermophilic strains also reduced feather powder in rating from 7.

Among these 429 keratinolytic bacteria strains, 26 isolates having the most effective degrading capacity were chosen and i entifie uil ing on ergey’s m nu l om ining 16S rRN gene sequen ing Phylogenetic tree deducing from the 16S rRNA partial gene sequences of 26 selected strains showed a genetic link between them. In addition, the identification results noticed that most belonged to Bacilli class (73,08%) and the rest strains as members of Betaproteobacteria class (3,85%), Flavobacteria class (7,69%) and Gammaproteobacteria class (15,38%).