ĐẶT VẤN ĐỀ Tiêu chảy là một trong những bệnh thường gặp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe và chất lượng sống của con người, đặc biệt ở trẻ em. Theo Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 1,7 tỷ lượt trẻ em bị tiêu chảy và là nguyên nhân gây tử vong của khoảng 525.000 trẻ em trên toàn thế giới [63]. Tại Việt Nam, ước tính có khoảng hơn 1 triệu ca tiêu chảy mỗi năm, dịch thường diễn ra trong 4 tháng, từ tháng 4 đến tháng 7 hàng năm [4]. Tây Bắc Bộ, Tây Nguyên và Đồng bằng Sông Hồng là những khu vực có tỷ lệ mắc tiêu chảy cao nhất, các vùng có tỷ lệ tiêu chảy thấp nhất là Đông Nam Bộ và Bắc Trung Bộ [4].
Tiêu chảy còn là nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng, chậm phát triển cả về thể chất và tinh thần của trẻ và là gánh nặng về kinh tế cho gia đình và cho toàn xã hội, đặc biệt ở những nước đang phát triển trong đó có Việt Nam [1], [53], [63]. Có nhiều tác nhân đường ruột gây tiêu chảy đã được ghi nhận như vi khuẩn, vi rút, kí sinh trùng, nấm. Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy thì vi khuẩn E. coli thường gặp hơn cả, chiếm khoảng 20% trong số các tác nhân gây tiêu chảy [5].
Dựa trên đặc điểm độc lực, các chủng vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người được phân thành các nhóm: STEC (shiga toxin producing E. coli), ETEC (enterotoxigenic E. coli), EPEC (enteropathogenic E.
coli), EIEC (enteroinvasive E. coli), EHEC (enterohemorrhagic E. coli), EaggEC (enteroaggregative E. coli) và DAEC (diffusely adherent E.
Những bệnh lý tiêu chảy do vi khuẩn E. coli có sự phối hợp của các gen độc lực khác nhau giúp cho vi khuẩn gắn bám, giải phóng yếu tố tan máu và các độc tố ruột [2]. Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả những phương pháp truyền thống và các phương pháp phân tử hiện đại. Tuy nhiên, trong chẩn đoán tiêu chảy do vi khuẩn E.
coli các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc, thử các tính chất sinh hóa có thể phát hiện vi khuẩn E. coli nhưng không thể phân biệt giữa các vi khuẩn E. coli hội sinh cư trú bình thường ở đường ruột với các vi khuẩn E. coli mang gen độc lực gây bệnh.
Các phương pháp sinh học phân tử như: PCR, RT-PCR, multiplex PCR. khắc phục 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com được những nhược điểm này do có khả năng phát hiện chính xác các gen độc lực gây bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này mất nhiều thời gian và cần các máy móc chuyên dụng đắt tiền, do vậy chỉ có thể tiến hành ở những nơi có điều kiện cở sở vật chất được trang bị tốt, khó áp dụng được cho các tuyến y tế cơ sở. Với mong muốn tìm ra một phương pháp chẩn đoán nhanh nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác, có thể tiến hành bằng các thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tại các tuyến y tế cơ sở nhằm góp phần nâng cao hiệu quả trong phòng chống, kiểm soát và điều trị vi khuẩn E.
coli gây tiêu chảy ở người chúng tôi tiến hành đề tài: “Sử dụng chỉ thị màu phát hiện nhanh vi khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy ở ngƣời bằng kỹ thuật phân tử” Với mục tiêu sau: 1. Phát hiện nhanh vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy ở người bằng kĩ thuật LAMP. Xây dựng được sơ đồ phát hiện vi khuẩn E.
coli mang gen eae gây tiêu chảy bằng kĩ thuật LAMP ở quy mô phòng thí nghiệm. Nội dung nghiên cứu: - Phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy thu được tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên. - Xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng E.
coli và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa rDNA 16S của một số chủng E. - Sử dụng kĩ thuật PCR để phát hiện gen độc lực eae của vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy ở người. - Sử dụng kĩ thuật LAMP để phát hiện gen độc lực eae của vi khuẩn E.
coli và nhận biết sản phẩm phản ứng bằng các chỉ thị màu. - Xây dựng sơ đồ phát hiện vi khuẩn E. coli mang gen eae gây tiêu chảy bằng phương pháp LAMP và nhận biết bằng các chỉ thị màu. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát bệnh tiêu chảy ở ngƣời 1. Khái niệm về tiêu chảy Tiêu chảy là tình trạng đi ngoài phân lỏng bất thường (phân tóe nước, phân có nhày máu, mủ.) từ 3 lần trở lên trong vòng 24 giờ. Kèm theo các triệu chứng như nôn, sốt, đau bụng, chóng mặt, mệt mỏi.
Trên lâm sàng, tiêu chảy được chia làm ba loại: tiêu chảy cấp tính với thời gian từ vài giờ đến không quá 14 ngày bao gồm cả dịch tả, tiêu chảy máu cấp tính hay còn được gọi là bệnh lỵ và tiêu chảy kéo dài với thời gian trên 14 ngày [1], [63]. Tiêu chảy có thể gặp ở mọi lứa tuổi, ở người lớn bệnh thường ít nguy hiểm đến tính mạng nhưng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, khả năng lao động và sinh hoạt của người bệnh. Tiêu chảy rất nguy hiểm đối với trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là ở trẻ từ 0 đến 2 tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình ở trẻ em dưới 5 tuổi là trên 3 lần/ trẻ em/ năm.
Tuy nhiên, ở một số nước đang phát triển con số này có thể cao tới 12 lần/trẻ em/năm [63]. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ là 2,2 lần [1]. Đây là bệnh đứng thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp, trong đó hơn 80% số ca tử vong ở trẻ từ 0-2 tuổi [1], [63]. Nguyên nhân chính gây tử vong khi bị tiêu chảy là do mất nước và điện giải, tiếp theo là suy dinh dưỡng.
Suy dinh dưỡng và tiêu chảy tạo thành một vòng xoắn bệnh lý: tiêu chảy dẫn đến suy dinh dưỡng và khi trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy cơ bị tiêu chảy cao hơn [1], [63]. Nguyên nhân gây tiêu chảy Có nhiều tác nhân dẫn đến tiêu chảy. Trong đó, vi rút là nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ em. Những loại vi rút gây tiêu chảy thường gặp là Rotavirus, Adenovirus, Norwalk virus, trong đó Rotavirus là tác nhân chính gây bệnh cho trẻ em dưới 2 tuổi.
Một số vi khuẩn cũng là nguyên nhân gây tiêu chảy thường gặp như: E. coli, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae. coli đường ruột được xác định là nguyên nhân hàng đầu gây ra số ca tiêu chảy cấp từ 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com vừa tới nặng ở người. coli O157H7 gây ra vụ dịch đầu tiên vào năm 1982, ở Mỹ, kể từ đó, E.
coli O157H7 trở thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây qua thực phẩm [49]. Gần đây nhất, năm 2011, E. coli O104H4 được xác định là nguyên nhân gây ra dịch tiêu chảy kèm theo tan máu - urê ở miền Bắc nước Đức và lan ra 15 nước Châu Âu. Chỉ tính riêng ở Đức E.
coli O104H4 đã gây ra hơn 4000 ca nhiễm bệnh và 60 ca tử vong [14]. Nhiễm kí sinh trùng và các đơn bào Entamoeba histolytica, Giardia lamblia. cũng thường được phát hiện là nguyên nhân gây tiêu chảy. Suy dinh dưỡng, dị ứng thức ăn, hay tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh ở các nước đang phát triển cũng góp phần làm cho nguy cơ mắc tiêu chảy gia tăng [1], [55], [63].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Yến Bình (2003), trong số các tác nhân gây tiêu chảy thường gặp ở trẻ em Việt Nam thì đứng đầu là Rotavirus chiếm tỷ lệ cao nhất (39,3%), tiếp theo là vi khuẩn E. Đường lây truyền Cũng giống như hầu hết các tác nhân gây tiêu chảy khác, vi khuẩn E. coli lây truyền chủ yếu qua đường tiêu hóa, thông qua thực phẩm nhiễm khuẩn, nước uống bị nhiễm phân của người hoặc súc vật mang mầm bệnh. Theo WHO, trên toàn thế giới có khoảng 780 triệu người không được tiếp cận với nguồn nước sạch và 2,5 tỷ người thiếu kiện điều vệ sinh [1], [55], [63].
Do đó, đây là điều kiện thuận lợi cho tiêu chảy do nhiễm trùng lan rộng khắp các nước đang phát triển. Tại Việt Nam, tập quán chăn nuôi gia súc thả rông, giết mổ nhỏ lẻ tại nhà dân không qua kiểm dịch, nguồn nước dùng cho chăn nuôi, nuôi trồng sử dụng trong canh tác nông nghiệp ô nhiễm tiềm ẩn rất nhiều nguy cơ bùng phát dịch tiêu chảy. Ngoài ra, vi khuẩn E. coli cũng lây truyền từ người này sang người khác thông qua tiếp xúc, chủ yếu qua bàn tay, đồ vật nhiễm bẩn với phân của người bệnh.
Đây là đường lây quan trọng giữa các thành viên trong gia đình, nhất là ở những gia đình có trẻ mắc tiêu chảy và lây giữa các thành viên trong một tập thể như trường học, nhà trẻ [1]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. coli gây tiêu chảy ở ngƣời Vi khuẩn E. coli được phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 bởi nhà nghiên cứu người Đức là Theodor Escherich [2].
Theo phân loại khoa học, vi khuẩn E. coli thuộc: - Giới: Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Escherichia - Loài: coli - Tên khoa học: Escherichia coli 1. Hình thái Vi khuẩn E. coli là trực khuẩn, kích thước dài ngắn khác nhau, trung bình từ 2-3 µm, rộng 0,5 µm, đôi khi trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn dài 6-8 µm, trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (có thể một số chủng không di động), không sinh nha bào và bắt màu Gram âm [2].
coli (A): kính hiển vi điện tử và (B) nhuộm Gram. Hình ảnh của: Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH 1. Tính chất nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu kị khí tuỳ tiện, phát triển được ở nhiệt độ 15-40oC, tốt nhất là ở 37oC, pH 7,0-7,2.
Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ vi khuẩn E. coli 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đã làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục nhiều, sau vài ngày có thể có váng mỏng trên bề mặt môi trường, để lâu vi khuẩn lắng xuống đáy ống. Trên môi trường thạch thường, sau 18-24 giờ khuẩn lạc có hình tròn, bờ đều, bóng, không màu hay màu xám nhẹ, đường kính 2-3 mm. Trên môi trường phân lập, vi khuẩn E.