Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Paracetamol và caffein là hai thành phần hoạt chất phổ biến trong các chế phẩm thuốc giảm đau, hạ sốt không kê đơn lưu hành trên thị trường. Paracetamol (N-acetyl-p-aminophenol) có tác dụng hạ sốt và giảm đau tương đương aspirin ở liều điều trị thông qua cơ chế tác động lên trung tâm điều nhiệt ở vùng dưới đồi và ức chế sinh tổng hợp prostaglandin tại hệ thần kinh trung ương, đồng thời không gây kích ứng hay tổn thương niêm mạc dạ dày. Caffein là một dẫn xuất xanthin có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, giải tỏa cảm giác mệt mỏi, gây co mạch ngoại vi, từ đó làm tăng hiệu lực giảm đau của paracetamol và giúp người bệnh tỉnh táo. Tuy nhiên, việc sử dụng không đúng chỉ định hoặc lạm dụng thuốc có thể dẫn đến nhiều nguy cơ dược lý nghiêm trọng: paracetamol khi dùng quá liều (trên 10 g/ngày) sẽ bị chuyển hóa tại gan tạo thành lượng lớn N-acetylbenzoquinonimin làm cạn kiệt glutathion, gây hoại tử tế bào gan cấp tính; caffein liều cao gây mất ngủ, kích động, rối loạn nhịp tim và co giật.
Để kiểm soát chất lượng dược phẩm phối hợp, việc phân tích định lượng đồng thời hai hoạt chất là yêu cầu cần thiết. Tại Việt Nam vào thời điểm nghiên cứu (2013), các phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) hoặc quang phổ đạo hàm thường được ứng dụng để định lượng đồng thời, trong khi kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phần lớn chỉ được sử dụng để phân tích đơn lẻ từng chất. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài "Xác định đồng thời hàm lượng paracetamol và caffein trong một số dược phẩm bằng phương pháp HPLC" được thực hiện tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh với hai mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng điều kiện phân tích đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS phù hợp với điều kiện trang thiết bị phòng thí nghiệm.
- Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng đồng thời paracetamol và caffein trong một số mẫu dược phẩm thương mại thông dụng (cụ thể là thuốc viên nén Panadol Extra).
Đối tượng nghiên cứu của khóa luận gồm chất chuẩn Paracetamol (hàm lượng nguyên trạng 99,87%), chất chuẩn Caffein (hàm lượng nguyên trạng 99,70%) và chế phẩm viên nén Panadol Extra (chứa 500 mg paracetamol và 65 mg caffein/viên, số đăng ký VNB-0891-03 do Công ty liên doanh Dược phẩm Sanofi-Synthelabo Việt Nam sản xuất). Phạm vi nghiên cứu tập trung vào việc khảo sát các thông số sắc ký (pha động, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện), khoảng tuyến tính của đường chuẩn, quy trình chiết tách mẫu và định lượng thực tế tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa phân tích trong năm 2013.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết sắc ký phân bố pha đảo (RP-HPLC), trong đó pha tĩnh kém phân cực và pha động phân cực di chuyển qua cột dưới áp suất cao nhằm phân tách các cấu tử dựa trên sự khác biệt về ái lực tương tác giữa chất tan với hai pha ($F_1$: tương tác chất tan - pha tĩnh, $F_2$: tương tác chất tan - pha động, $F_3$: tương tác pha tĩnh - pha động). Các đại lượng sắc ký cơ bản được tác giả thiết lập và tính toán bao gồm: thời gian lưu tổng cộng ($t_R$), thời gian không lưu giữ ($t_0$), thời gian lưu thực ($t'_R = t_R - t_0$), hệ số phân bố ($K$), hệ số dung lượng ($k'$), hệ số tách ($\alpha$), số đĩa lý thuyết ($N$), chiều cao đĩa lý thuyết ($H = L/N$) và độ phân giải ($R$). Để xác định lưu lượng pha động tối ưu nhằm đạt hiệu quả tách cao nhất (chiều cao đĩa $H$ nhỏ nhất), tác giả vận dụng phương trình Van Deemter:
$$H = A + \frac{B}{u} + (C_S + C_M)u$$
Phương pháp định lượng được áp dụng là phương pháp đường chuẩn, dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký ($S_p$) hoặc chiều cao pic ($H$) với nồng độ chất phân tích ($C$). Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê để tính giá trị trung bình ($\bar{x}$), độ lệch chuẩn ($s$) và độ lệch chuẩn tương đối ($RSD%$).
Hệ thống thiết bị và hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu:
- Thiết bị: Hệ thống Perkin Elmer Series 200 gồm bơm cao áp (Pump), bộ loại khí chân không (Vacuum Degasser), detector UV-VIS; van nạp mẫu vòng 20 µL (Injector 20 µL, syringe Hamilton 100 µL); cột sắc ký pha đảo Brownlee Columns RP-18 ($5\ \mu\text{m}, 220 \times 4,6\text{ mm}$); phần mềm điều khiển và xử lý TotalChrom Workstation ver 6.3; máy đo quang Perkin Elmer Lambda 25 UV/Vis Spectrometer; máy lắc KS130 Basic IKA; máy đánh siêu âm Elmasonic S100H; cân phân tích Sartorius; máy lọc nước siêu sạch Water Pro PS LABCONCO.
- Hóa chất, dung môi: Chuẩn Paracetamol (lô QT009 121911 và QT009 130312, 99,87%), chuẩn Caffein (lô QT028080411 và QT028100313, 99,70%); dung môi Acetonitril, Methanol, Nước chuẩn dùng cho HPLC (Merck KGaA, độ tinh khiết $\ge 99,80%$); Acid Phosphoric 85%, NaOH, Chloroform, Aceton.
Nội dung chính theo từng chương
CHƯƠNG 1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Chương này trình bày có hệ thống về nguyên lý cấu tạo và hoạt động của hệ thống HPLC (gồm 5 bộ phận cơ bản: bơm cao áp 0–400 bar tạo lưu lượng 0,5–3 ml/phút, van bơm mẫu 6 chiều vòng mẫu 20–100 µL, cột tách phân tích kích thước 10–25 cm đường kính 2–5 mm, detector quang phổ UV-VIS, bộ phận ghi nhận và xử lý tín hiệu); bản chất quá trình sắc ký trong cột và các thông số đặc trưng ($t_R, K, k', \alpha, N, R$, phương trình Van Deemter); cơ sở phương pháp định lượng đường chuẩn và thống kê sai số.
Đồng thời, chương 1 tổng quan chi tiết đặc tính dược lý, dược động học, liều dùng, chỉ định, chống chỉ định, độc tính của paracetamol và caffein, kèm theo tổng hợp các công trình phân tích đã công bố trong và ngoài nước:
- Phân tích paracetamol đơn lẻ: Sinan Suzen và Cemal Akay (1998) dùng HPLC cột $C_{18}$, pha động methanol:nước (1:2), tốc độ 1,78 ml/phút tại 193,3 nm, thu hồi đạt $98,8 \pm 0,83%$; Shulin Zhao (2006) dùng điện di mao quản có giới hạn phát hiện $5,6 \times 10^{-8}\text{ M}$.
- Phân tích caffein đơn lẻ: Wenrui Jin (2000) dùng điện di mao quản với giới hạn phát hiện $2,9 \times 10^{-4}\text{ mM}$; Guzin Alpdogan (2000) dùng phổ đạo hàm đối chiếu HPLC cột $C_{18}$, pha động methanol:nước (30:70).
- Phân tích đồng thời paracetamol và caffein: H. Sheikhaei (2009) dùng phương pháp thêm chuẩn điểm H tạo phức Cu(I) neocuproine tại 453 nm; Vijaya Vichare (2010) dùng trắc quang; M. Prodan dùng HPLC cột $C_{18}$, pha động methanol:nước (40:60), tốc độ 0,5 ml/phút tại 249 nm và 279 nm; Levent Altun dùng HPLC cột $C_8$ phân tích đồng thời paracetamol, caffein và dipyrone; Viswanath Reddy Pyreddy (2011) chạy gradient dung dịch đệm phosphate và acetonitril; SM Ashraful Islam (2011) dùng đệm phosphate pH 5,5:methanol (60:40) tại 273 nm; Thái Duy Thìn dùng HPLC cột $C_{18}$ ($250 \times 4\text{ mm}, 10\ \mu\text{m}$) với pha động axit photphoric 0,75% trong methanol:nước (35:65), tốc độ 1 ml/phút, thời gian lưu paracetamol 2,219 phút và caffein 6,041 phút.
CHƯƠNG 2. Hóa chất, dụng cụ
Chương 2 mô tả danh mục hóa chất, nguồn gốc chất chuẩn, tiêu chuẩn dung môi tinh khiết HPLC của hãng Merck và thông số các thiết bị phân tích của hãng Perkin Elmer. Nội dung thực nghiệm tập trung vào:
- Lựa chọn van nạp mẫu thể tích vòng mẫu 20 µL để tránh hiện tượng doãng chân pic khi nạp lượng mẫu quá lớn.
- Lựa chọn cột pha đảo Brownlee Columns RP-18 ($5\ \mu\text{m}, 220 \times 4,6\text{ mm}$).
- Thiết kế quy trình khảo sát thành phần pha động (methanol và nước ở các tỷ lệ) và khảo sát tốc độ pha động (0,8 đến 1,4 ml/phút) ở bước sóng 270 nm.
- Thiết kế quy trình chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn từ dung dịch gốc 1200 ppm để xác định khoảng tuyến tính trên phần mềm Microsoft Excel.
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu viên nén: cân 10 viên Panadol Extra, nghiền mịn, cân lượng mẫu đại diện $m$ (g), lắc chiết với 30 ml pha động trong 15 phút bằng máy lắc KS130 Basic ở tốc độ 240 vòng/phút, lọc tách dịch và kiểm tra phần dịch chiết ở các lần lọc kế tiếp trên HPLC cho đến khi không còn tín hiệu pic của hoạt chất.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ- THẢO LUẬN
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:
- Tối ưu hóa pha động: Khảo sát hệ dung môi methanol:nước cho thấy với tỷ lệ 100% methanol, hai pic tách rời hoàn toàn, pic cân đối, sắc nét và thời gian rửa giải nhanh hơn tỷ lệ 90% methanol.
- Tối ưu hóa tốc độ dòng: Khảo sát tốc độ pha động ở các mức 0,8; 1,0; 1,2 và 1,4 ml/phút. Dựa vào đường cong Van Deemter, tại tốc độ 1,2 ml/phút, chiều cao đĩa lý thuyết $H$ đạt giá trị nhỏ nhất đối với cả hai chất (paracetamol $H = 7461,28$; caffein $H = 12702,78$), tương ứng hiệu quả tách sắc ký là tối ưu.
- Khoảng tuyến tính và phương trình đường chuẩn:
- Paracetamol: khảo sát dãy nồng độ 6; 12; 24; 48; 96; 192; 240 ppm, thiết lập phương trình hồi quy $y = 12323x - 85277$ với hệ số tương quan $r = 0,997$.
- Caffein: khảo sát dãy nồng độ 2,4; 6; 12; 24; 48; 96; 192 ppm, thiết lập phương trình hồi quy $y = 15415x + 67467$ với hệ số tương quan $r = 0,996$.
- Khảo sát chiết tách và định lượng mẫu thuốc: Cân 1,375 g bột thuốc Panadol Extra (tương đương khối lượng 2 viên, khối lượng 10 viên cân được là 6,875 g). Tiến hành lắc và lọc phân đoạn; kết quả diện tích pic giảm dần sau mỗi lần lọc và đến lần thứ 6 thì không còn xuất hiện pic trên sắc ký đồ, khẳng định hoạt chất được chiết kiệt sau 5 lần lọc. Dịch lọc gộp 5 lần được định mức thành 250 ml (mẫu PE1), sau đó pha loãng 20 lần (hút 0,5 ml định mức thành 10 ml) để chạy sắc ký lặp lại 3 lần trên các mẫu PE1, PE2, PE3.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu đã xác lập bộ thông số tối ưu cho quy trình RP-HPLC phân tích đồng thời paracetamol và caffein, đồng thời áp dụng định lượng thành công trên mẫu thuốc Panadol Extra.
| Thông số sắc ký |
Điều kiện tối ưu được xác lập |
| Cột sắc ký |
Brownlee Columns RP-18 ($5\ \mu\text{m}, 220 \times 4,6\text{ mm}$) |
| Pha động |
100% Methanol ($CH_3OH$) |
| Tốc độ dòng |
1,2 ml/phút |
| Detector |
UV-VIS tại bước sóng $\lambda = 270\text{ nm}$ |
| Thể tích nạp mẫu |
20 µL |
| Thời gian lưu ($t_R$) |
Paracetamol: 1,729 phút; Caffein: 2,036 phút |
Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động đến thời gian lưu và chiều cao đĩa lý thuyết:
| Tốc độ pha động $u$ (ml/phút) |
$t_R$ Paracetamol (phút) |
$H$ Paracetamol |
$t_R$ Caffein (phút) |
$H$ Caffein |
| 0,8 |
2,654 |
12416,71 |
3,118 |
25426,13 |
| 1,0 |
2,080 |
10550,11 |
2,451 |
17402,01 |
| 1,2 |
1,729 |
7461,28 |
2,036 |
12702,78 |
| 1,4 |
1,505 |
8030,38 |
1,770 |
15594,63 |
Kết quả chiết phân đoạn mẫu Panadol Extra qua các lần lọc:
| Lần lọc |
Diện tích pic Paracetamol ($S_p$) |
Diện tích pic Caffein ($S_p$) |
| Lần 2 |
2880962,83 |
677185,42 |
| Lần 3 |
759619,68 |
171843,16 |
| Lần 4 |
341910,87 |
74303,69 |
| Lần 5 |
273094,01 |
64054,84 |
| Lần 6 |
Không xuất hiện pic |
Không xuất hiện pic |
Kết quả định lượng nồng độ trong các mẫu thuốc Panadol Extra sau pha loãng:
| Mẫu thử |
$S_p$ Paracetamol |
$S_p$ Caffein |
Nồng độ Paracetamol (ppm) |
Nồng độ Caffein (ppm) |
| PE1 |
1907923,63 |
428688,63 |
162,56 |
23,43 |
| PE2 |
1981550,56 |
419057,54 |
167,72 |
22,81 |
| PE3 |
2114343,02 |
446152,09 |
178,50 |
24,57 |
| Giá trị trung bình |
- |
- |
$170 \pm 25$ |
$23,60 \pm 2,7$ |
Đóng góp của khóa luận thể hiện ở việc xây dựng một quy trình HPLC pha đảo đẳng dòng sử dụng pha động đơn giản (100% methanol tinh khiết), không cần phối trộn phức tạp với các hệ đệm muối phosphate hay chất tạo cặp ion như nhiều nghiên cứu trước, giúp rút ngắn tổng thời gian rửa giải xuống dưới 2,5 phút cho mỗi lượt chạy mẫu mà vẫn đảm bảo độ phân giải tách biệt rõ rệt giữa hai hoạt chất.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế:
- Quy trình phân tích thực nghiệm chỉ mới được khảo nghiệm trên một chế phẩm thương mại duy nhất là thuốc viên nén Panadol Extra (hàm lượng 500 mg paracetamol và 65 mg caffein).
- Số lượng mẫu phân tích thực tế còn hạn chế (3 mẫu lặp lại PE1, PE2, PE3), dẫn đến khoảng sai số của giá trị trung bình nồng độ còn dao động tương đối rộng ($170 \pm 25\text{ ppm}$ đối với paracetamol và $23,60 \pm 2,7\text{ ppm}$ đối với caffein).
- Khóa luận chưa tiến hành đầy đủ các bước thẩm định phương pháp phân tích nâng cao theo hướng dẫn ICH/Dược điển như xác định độ đúng (hiệu suất thu hồi recovery), độ lặp lại trong ngày/khác ngày, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Hướng nghiên cứu tiếp:
- Mở rộng ứng dụng quy trình phân tích trên các dạng bào chế khác chứa paracetamol và caffein lưu hành trên thị trường (như viên nén sủi bọt, siro, gói thuốc bột, viên đạn đặt trực tràng).
- Khảo sát mở rộng quy trình phân tích để xác định đồng thời paracetamol, caffein cùng các hoạt chất phối hợp khác thường gặp trong thuốc cảm cúm (như clopheniramin maleat, pseudoephedrin, dextromethorphan).
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:
- Sinh viên, học viên và nghiên cứu viên thuộc ngành Hóa học (chuyên ngành Hóa phân tích), Dược học và Kiểm nghiệm thuốc đang tìm hiểu quy trình xây dựng phương pháp HPLC phân tích nhóm thuốc giảm đau, hạ sốt.
- Các cán bộ kiểm nghiệm tại các phòng phân tích cơ bản cần tham khảo phương pháp tối ưu hóa tốc độ dòng dựa trên đường cong thực nghiệm Van Deemter (chiều cao đĩa lý thuyết $H$).
- Nội dung quy trình chiết phân đoạn 5 lần bằng dung môi pha động có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho việc xử lý mẫu dạng viên nén có chứa tá dược không tan trước khi chạy sắc ký lỏng.
Câu hỏi thường gặp
1. Điều kiện tối ưu của hệ thống HPLC được tác giả xác định trong nghiên cứu là gì?
Điều kiện tối ưu bao gồm: Cột Brownlee Columns RP-18 ($5\ \mu\text{m}, 220 \times 4,6\text{ mm}$); pha động 100% Methanol; tốc độ dòng 1,2 ml/phút; detector UV-VIS đo ở bước sóng 270 nm; thể tích vòng nạp mẫu 20 µL. Tại điều kiện này, thời gian lưu của paracetamol là 1,729 phút và caffein là 2,036 phút.
2. Khoảng tuyến tính và phương trình đường chuẩn của hai hoạt chất được xác định như thế nào?
Khoảng tuyến tính của paracetamol nằm trong khoảng từ 6 đến 240 ppm với phương trình hồi quy $y = 12323x - 85277$ ($r = 0,997$). Khoảng tuyến tính của caffein nằm trong khoảng từ 2,4 đến 192 ppm với phương trình hồi quy $y = 15415x + 67467$ ($r = 0,996$).
3. Tại sao tác giả kết luận cần thực hiện chiết mẫu viên nén qua 5 lần lắc lọc?
Khi thực hiện khảo sát chiết phân đoạn từ 1,375 g bột thuốc Panadol Extra với 30 ml pha động (lắc 15 phút ở tốc độ 240 vòng/phút), diện tích pic của cả hai chất giảm dần từ lần lọc 2 đến lần lọc 5, và đến lần lọc thứ 6 thì trên sắc ký đồ không còn xuất hiện pic tín hiệu, chứng tỏ toàn bộ hoạt chất đã được chiết kiệt sau 5 lần lọc đầu.
4. Kết quả định lượng nồng độ paracetamol và caffein trong các mẫu dung dịch thuốc Panadol Extra đạt bao nhiêu?
Sau khi pha loãng dung dịch mẫu chiết 20 lần, nồng độ xác định được ở 3 mẫu thử PE1, PE2, PE3 lần lượt là: Paracetamol đạt 162,56 ppm, 167,72 ppm và 178,50 ppm (trung bình $170 \pm 25\text{ ppm}$); Caffein đạt 23,43 ppm, 22,81 ppm và 24,57 ppm (trung bình $23,60 \pm 2,7\text{ ppm}$).
5. Hệ thống máy HPLC và phần mềm điều khiển cụ thể được sử dụng trong đề tài là gì?
Nghiên cứu sử dụng hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Perkin Elmer Series 200 (gồm Bơm cao áp, Bộ loại khí chân không Vacuum Degasser, Detector UV/Vis Series 200) kết nối máy tính điều khiển và xử lý dữ liệu qua phần mềm TotalChrom Workstation version 6.3.
Kết luận
Khóa luận đã nghiên cứu và thiết lập thành công quy trình phân tích đồng thời paracetamol và caffein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo RP-HPLC trên cột Brownlee RP-18 với pha động 100% methanol ở tốc độ 1,2 ml/phút và bước sóng phát hiện 270 nm. Quy trình cho phép tách hoàn toàn hai hoạt chất trong thời gian ngắn (dưới 2,5 phút), đường chuẩn đạt độ tương quan tuyến tính cao trong dải nồng độ khảo sát (6–240 ppm đối với paracetamol và 2,4–192 ppm đối với caffein). Kết quả ứng dụng trên viên nén Panadol Extra đã chứng minh tính khả thi của quy trình chiết mẫu qua 5 lần lọc và định lượng ổn định hai thành phần hoạt chất trong mẫu dược phẩm thực tế.
