Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ hóa học của tác giả Nguyễn Quang Huy với đề tài "Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glucosamin, một số vitamin nhóm B và khoáng chất trong dược phẩm, thực phẩm chức năng" được thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, thuộc chuyên ngành Hóa phân tích (mã số: 9440112.03), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Thị Ánh Hường và PGS. Nguyễn Thị Minh Thư.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Glucosamin là một amino-monosaccharide đóng vai trò là nguyên liệu tổng hợp proteoglycan và glycosaminoglycan, thành phần chính cấu tạo nên sụn và mô xương khớp, đã được Cơ quan Đánh giá Dược phẩm Châu Âu xếp vào danh mục thuốc cải thiện cấu trúc xương khớp. Trong các chế phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng (TPCN), glucosamin thường được phối trộn cùng canxi – khoáng chất thiết yếu trong quá trình hình thành và khoáng hóa khung xương. Bên cạnh đó, magie và vitamin B6 là hai vi chất đóng vai trò coenzym trong hơn 300 phản ứng chuyển hóa protein, glucid, lipid, điều hòa dẫn truyền thần kinh, kiểm soát đường huyết và bảo vệ tim mạch. Đồng thời, các vitamin nhóm B tan trong nước khác như vitamin B1 (thiamin), vitamin B5 (acid pantothenic) và vitamin B9 (acid folic) giữ vai trò then chốt trong quá trình trao đổi chất tế bào, tạo máu và phòng ngừa dị tật ống thần kinh.

Do cơ thể người không thể tự tổng hợp hoặc tổng hợp không đáp ứng đủ nhu cầu các vi chất này, việc bổ sung qua đường uống từ dược phẩm và TPCN là rất phổ biến. Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lượng các sản phẩm phối trộn trên thị trường hiện nay gặp rào cản lớn: các phương pháp phân tích truyền thống như quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), điện hóa, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay điện di mao quản với detector UV (CE-UV) hầu hết chỉ xác định đơn lẻ từng chất hoặc chỉ tách được các chất có cùng bản chất hóa học. Rất khó để phân tích đồng thời các hợp chất có tính chất hóa lý hoàn toàn khác biệt (khoáng vô cơ mang điện tích cao như $\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}$ cùng với các phân tử hữu cơ như glucosamin và các vitamin nhóm B) trong cùng một quy trình phân tích. Khoảng trống này đòi hỏi phải phát triển một phương pháp phân tích mới, tích hợp, có khả năng phân tách đồng thời, độ nhạy cao, vận hành đơn giản và chi phí thấp.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án là xây dựng 03 quy trình phân tích đồng thời các hoạt chất phối trộn trong dược phẩm và thực phẩm chức năng bằng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-$\text{C}^4\text{D}$), bao gồm:

  1. Quy trình 1: Xác định glucosamin đồng thời với canxi.
  2. Quy trình 2: Xác định vitamin B6 đồng thời với magie.
  3. Quy trình 3: Xác định đồng thời các vitamin nhóm B gồm vitamin B1, vitamin B5 và vitamin B9.

Câu hỏi và nội dung nghiên cứu

Để hiện thực hóa các mục tiêu trên, luận án triển khai 4 nội dung nghiên cứu cụ thể:

  1. Nghiên cứu, khảo sát xác định các điều kiện tối ưu để phân tách và định lượng đồng thời các chất phân tích bằng phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$:
    • Khảo sát hệ đệm dung dịch điện ly: thành phần chất đệm, giá trị pH và nồng độ chất điện ly.
    • Khảo sát điện thế tách ($V$).
    • Khảo sát các thông số bơm mẫu thủy động học kiểu xi phông: thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu.
  2. Thẩm định và đánh giá giá trị phương pháp phân tích theo các chỉ số:
    • Xây dựng khoảng tuyến tính và phương trình đường chuẩn.
    • Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
    • Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp khi có mặt tá dược và các ion cản trở.
    • Đánh giá độ chụm (độ lặp lại của thời gian di chuyển $t_{dc}$ và diện tích pic $S_{pic}$).
    • Đánh giá độ đúng (độ thu hồi qua phương pháp thêm chuẩn).
  3. Ứng dụng quy trình đã tối ưu hóa để phân tích đồng thời hàm lượng canxi và glucosamin; magie và vitamin B6; vitamin B1, vitamin B5 và vitamin B9 trong các mẫu dược phẩm và TPCN thương mại.
  4. Thực hiện phân tích đối chứng bằng các phương pháp tiêu chuẩn nhằm kiểm chứng độ tin cậy của phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các hoạt chất gồm Glucosamin (ở các dạng muối sulfate, hydrochloride, N-acetylglucosamin, glucosamin sulfate potassium chloride), khoáng chất canxi ($\text{Ca}^{2+}$), magie ($\text{Mg}^{2+}$) và các vitamin nhóm B: vitamin B1 (thiamin), vitamin B5 (acid pantothenic, calci pantothenat, dexpanthenol), vitamin B6 (pyridoxine hydrochloride) và vitamin B9 (acid folic).
  • Phạm vi đối tượng mẫu: Các chế phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng lưu hành trên thị trường ở các dạng bào chế khác nhau (viên nén, viên nang, dung dịch uống).
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với sự hỗ trợ trang thiết bị từ Công ty 3Sanalysis; hoàn thành vào năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu tiền đề

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về phân tích glucosamin, khoáng chất và các vitamin nhóm B thông qua 4 nhóm phương pháp chính:

Nhóm phương pháp Tác giả & Tài liệu Chất phân tích & Nền mẫu Thông số kỹ thuật & Giới hạn phát hiện (LOD)
Quang phổ (UV-Vis, ICP-OES) Priya Gaonkar và cs. [65] Glucosamin sulfat (TPCN dạng viên nén) UV-Vis dẫn xuất phenylthiourea ở $240\text{ nm}$; Tuyến tính $5\text{--}25\ \mu\text{g/mL}$; $\text{RSD} = 1,1%$
Yamaguchi và cs. [73] Glucosamin (TPCN dạng viên nén) UV-Vis với phức Palladium(II) ở $630\text{ nm}$; Tuyến tính $0,02\text{--}0,18\ \mu\text{g/mL}$; $\text{RSD} = 1,08%$
Nhóm tác giả Syria [69] Canxi (Dược phẩm, TPCN dạng viên) Phức bromocresol tím (BCP) ở $405\text{ nm}$; Tuyến tính $2,20\text{--}35,2\ \mu\text{g/mL}$; $\text{LOD} = 0,367\ \mu\text{g/mL}$; $\text{LOQ} = 1,112\ \mu\text{g/mL}$
Zeriet O. Tesfaldet và cs. [85] Magie (Dược phẩm dạng viên nén) Phức CPC ở $570\text{ nm}$; Tuyến tính $0\text{--}20\text{ mg/L}$; $\text{LOD} = 0,24\text{ mg/L}$; $\text{RSD} < 2,0%$
Mohamed Benamor và cs. [51] Canxi và Magie đồng thời (Dược phẩm) Phức với Tween 80; $\text{Ca: } 544,5\text{ nm}$, $\text{LOD} = 0,0575\ \mu\text{g/mL}$; $\text{Mg: } 570\text{ nm}$, $\text{LOD} = 0,03\ \mu\text{g/mL}$
Anna Krejcova và cs. [11] Canxi và Magie (TPCN dạng bột) ICP-OES thủy phân vi sóng với $\text{HNO}_3\ 65%$; $\text{LOD Ca} = 5,13\text{ mg/g}$; $\text{LOD Mg} = 7,93\text{ mg/g}$
Abua Ikem và cs. [9] Canxi, Magie và 24 nguyên tố khác (Sữa bột trẻ em) ICP-OES vi sóng Milestone Ethos-PLUS; Hàm lượng Canxi tìm thấy $344\text{--}662\ \mu\text{g/g}$
Phân tích điện hóa Mojtaba và cs. [52] Canxi (Dược phẩm) Điện cực carbon biến tính vòng diamide ionophore; $\text{LOD} = 7,9\cdot 10^{-6}\text{ M}$
Olayemi và cs. [60] Canxi (TPCN dạng uống) Von-ampe vòng trên điện cực vàng; Tuyến tính $3,76\text{--}5,4\text{ mM}$; $\text{LOD} = 6,91\cdot 10^{-4}\text{ M}$
Joseany và cs. [39] Canxi Von-ampe sóng vuông điện cực than thủy tinh; Đệm amoni $104\ \mu\text{M}$ pH 9,4 + EDTA; $\text{LOD} = 1,6\cdot 10^{-3}\ \mu\text{M}$
Dilgin [30] Canxi dobesilate (Dược phẩm) Điện cực than chì; Tuyến tính $0,2\text{--}100\ \mu\text{M}$; $\text{LOD} = 0,065\ \mu\text{M}$; $\text{RSD} = 1,1\text{--}2,0%$
Westmacott và cs. [80] Vitamin B1, B2, B6 đồng thời (Dược phẩm, TPCN) Von-ampe vòng điện cực carbon, đệm photphat $0,1\text{ M}$ pH 11; $\text{LOD B1} = 3,5\ \mu\text{g/mL}$; $\text{B2} = 0,1\ \mu\text{g/mL}$; $\text{B6} = 0,4\ \mu\text{g/mL}$
Kwok-Keung Shiu và Kang Shi [40] Vitamin B2 Điện cực than thủy tinh anot hóa trong $\text{H}_2\text{SO}_4\ 0,5\text{ M}$; Tuyến tính $0,1\text{--}3\ \mu\text{M}$; $\text{RSD} = 7%$
Sắc ký lỏng (HPLC, RP-HPLC, HILIC) Sắc ký khúc xạ / DAD / UV / PDA [6, 12, 13, 68, 75, 79] Glucosamin / Glucosamin sulfate (Dược phẩm, TPCN) HPLC-DAD: $\text{LOD} = 0,014\text{ mg/L}$, $\text{LOQ} = 0,046\text{ mg/L}$; HPLC-UV: $\text{LOD} = 0,0039\text{--}2,939\ \mu\text{g/mL}$; HPLC-PDA: Tuyến tính $600\text{--}1400\ \mu\text{g/mL}$
Rada Amid và cs. [10] Vitamin B1, B3, B6, B9, B12 (TPCN) RP-HPLC cột Supelcosil ABZ+, detector UV $290\text{ nm}$; Tuyến tính $10\text{--}30\ \mu\text{g/mL}$; $\text{LOD} = 0,625\text{--}1,25\ \mu\text{g/mL}$
Kadakal và cs. [21] Vitamin B1, B2, B5, B6, B9 (TPCN) RP-HPLC cột C18, pha động $\text{KH}_2\text{PO}_4\ 0,1\text{ M}$ (pH 7,0) + Methanol (90:10); $\text{LOD} = 0,1\text{--}0,5\text{ mg/L}$
Jin Tan, Rong Li, Zi-Tao Jiang [35] Vitamin B1 (TPCN) HILIC cột titania, pha động đệm phosphate $2\text{ mM}$ pH 6,5 trong $60%\text{ MeCN}$, UV $240\text{ nm}$; $\text{LOD} = 75\text{ ng/mL}$; $R^2 = 0,9997$
Điện di mao quản (CE) Susanne Nussbaumer và cs. [59] $\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}, \text{K}^+, \text{Na}^+$ (TPCN dạng tiêm) $\text{CE-C}^4\text{D}$, mao quản silica $64,5\text{ cm} \times 50\ \mu\text{m}\text{ ID}$, đệm Tris-acetate $100\text{ mM}$ (pH 4,5) + ACN (80:20), thế $+30\text{ kV}$; $\text{LOD} = 0,02\text{ mM}$
Patcharin Chaisuwan và cs. [62] Glucosamin (Dược phẩm) $\text{CE-C}^4\text{D}$, mao quản $35\text{ cm} \times 100\ \mu\text{m}\text{ ID}$, đệm MES/His $20\text{ mM}$ (pH 6,0), thế $+7\text{ kV}$; Tuyến tính $0,10\text{--}2,50\text{ mg/mL}$; $\text{RSD} < 1,91%$
Pavel Jác và cs. [63] Glucosamin (Dược phẩm, TPCN) $\text{CZE-C}^4\text{D}$, mao quản $75\text{ cm} \times 50\ \mu\text{m}\text{ ID}$, đệm acetate $30\text{ mM}$ (pH 5,2), thế $+30\text{ kV}$; Tuyến tính $100\text{--}300\ \mu\text{g/mL}$; $\text{LOD} = 9,2\ \mu\text{g/mL}$
L. Fotsing và cs. [25] Vitamin B1, B2, B3, B5, B6, C (Dược phẩm) CE-UV, đệm borat $50\text{ mM}$ (pH 8,5), thế $+25\text{ kV}$, bước sóng $215\text{ nm}$ và $225\text{ nm}$; $R^2 > 0,99$
Marina Franco, Renata Jasionowska, Elisa Salvatore [47] Vitamin B1, B2, B3, B5, B6, B9 (Dược phẩm, thuốc thú y) CZE-DAD, mao quản $59,5\text{ cm} \times 50\ \mu\text{m}\text{ ID}$, đệm tetraborat $20\text{ mM}$ (pH 9,2), thế $+20\text{ kV}$; $\text{LOD} = 0,9\text{--}9,0\ \mu\text{g/mL}$

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các phân tích tổng quan cho thấy:

  • Phương pháp quang phổ và điện hóa có quy trình đơn giản nhưng độ chọn lọc hạn chế, dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu và không thể phân tích đồng thời các hỗn hợp đa thành phần phức tạp.
  • Phương pháp HPLC có hiệu năng tách cao nhưng chi phí đầu tư thiết bị và dung môi phân tích rất lớn; đặc biệt HPLC rất khó khăn trong việc tìm điều kiện pha động và cột tách để phân tích đồng thời một cation vô cơ (như $\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}$) cùng một phân tử hữu cơ phân cực (như glucosamin hoặc vitamin B6) trong cùng một lần tiêm mẫu.
  • Phương pháp CE ghép nối detector quang phổ hấp thụ phân tử (CE-UV/DAD) bị giới hạn nghiêm trọng do bề dày lớp đo quang trong lòng mao quản rất nhỏ ($50\ \mu\text{m}$), làm giảm độ nhạy; đồng thời các ion vô cơ ($\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}$) và glucosamin không có nhóm mang màu hấp thụ quang mạnh ở vùng UV-Vis, đòi hỏi phải tạo dẫn xuất phức tạp trước khi đo.

Do đó, luận án đã lựa chọn giải pháp sử dụng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$\text{C}^4\text{D}$). Kỹ thuật này phát hiện trực tiếp chất phân tích dựa trên sự chênh lệch độ dẫn điện giữa vùng chứa ion chất phân tích và dung dịch điện ly nền, không phụ thuộc vào đặc tính quang học của chất, cho phép phát hiện đồng thời cả khoáng chất vô cơ và các hợp chất hữu cơ trong cùng một hệ dung dịch điện ly đơn giản, giải quyết triệt để khoảng trống nghiên cứu nêu trên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) tách các chất dựa trên sự khác biệt về độ linh điện di của các phần tử tích điện dưới tác dụng của một điện trường đồng nhất $E$ sinh ra bởi nguồn điện áp cao thế $V$.

Vận tốc di chuyển của phần tử tích điện ($v$) tỷ lệ thuận với cường độ điện trường: $$v = \mu \cdot E \quad (1.1)$$ Trong đó $\mu$ là độ linh điện di của phần tử chất trong điều kiện điện di xác định.

Khi phần tử tích điện chuyển động trong chất lỏng dưới điện trường, nó chịu tác dụng của lực điện trường $F_e$ và lực cản ma sát của môi trường $F_f$: $$F_e = q \cdot E \quad (1.2)$$ $$F_f = -6 \pi \eta r v \quad (1.3)$$ Trong đó $q$ là điện tích của phần tử, $\eta$ là độ nhớt của dung dịch điện ly, $r$ là bán kính thủy động học (bán kính hydrat hóa) của ion. Khi tốc độ di chuyển đạt trạng thái ổn định, hai lực này cân bằng ($F_e = -F_f$), suy ra biểu thức tính độ linh điện di lý thuyết: $$\mu = \frac{q}{6 \pi \eta r} \quad (1.4)$$

Công thức (1.4) chỉ ra rằng ion có điện tích càng lớn và bán kính hydrat càng nhỏ sẽ di chuyển càng nhanh trong điện trường. Trong thực tế phân tích, sự di chuyển của chất phân tích còn bị chi phối bởi dòng điện di thẩm thấu (EOF - Electroosmotic Flow). Dòng EOF sinh ra do lớp điện kép hình thành trên bề mặt trong của mao quản silica tích điện âm (tạo nên điện thế Zeta - $V_{zet}$). Chiều và tốc độ dòng EOF phụ thuộc trực tiếp vào giá trị pH, nồng độ, bản chất dung dịch điện ly và thế tách áp vào hai đầu mao quản.

Nguyên lý của Detector độ dẫn không tiếp xúc ($\text{C}^4\text{D}$)

Detector $\text{C}^4\text{D}$ (Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detector) hoạt động dựa trên nguyên lý đo độ dẫn điện xoay chiều thông qua sự ghép nối điện dung. Cấu tạo của detector gồm hai điện cực hình ống bằng kim loại đặt đồng trục nối tiếp bao quanh bên ngoài mao quản phân tích.

  • Hai điện cực hình ống tạo với lớp dung dịch bên trong mao quản hai tụ điện có điện dung $C$.
  • Lớp dung dịch nằm trong khoảng không gian giữa hai điện cực đóng vai trò như một điện trở $R$.
  • Khi áp một nguồn điện áp xoay chiều $V$ có tần số cao $f$ (tối thiểu vài trăm kHz) vào điện cực kích thích thứ nhất, dung kháng $Z = (1 / 2\pi f C)^2$ của thành mao quản bị triệt tiêu. Tín hiệu cường độ dòng điện xoay chiều $I$ thu được tại điện cực thu nhận thứ hai được biểu diễn theo định luật Ohm: $$I = \frac{V}{R} \quad (1.6)$$
  • Độ dẫn điện $\sigma$ của khối dung dịch giữa hai điện cực tỷ lệ nghịch với điện trở $R$: $$\sigma = \frac{l}{R \cdot S} \quad (1.7)$$ Trong đó $l$ là khoảng cách giữa hai điện cực và $S$ là tiết diện ngang của lòng mao quản. Sự xuất hiện của pic chất phân tích trên điện di đồ tương ứng với sự biến thiên độ dẫn điện tổng cộng khi vùng chất phân tích di chuyển qua khe đo của detector $\text{C}^4\text{D}$.

Phương pháp và điều kiện thực nghiệm

  • Hệ thiết bị phân tích: Hệ điện di mao quản tích hợp detector $\text{C}^4\text{D}$ nguồn kích thích xoay chiều điện áp cao ($\text{HV-C}^4\text{D}$, $200\text{ V}$) do Công ty 3Sanalysis cung cấp. Sử dụng cột mao quản silica trần nung chảy (fused-silica capillary) có đường kính trong $\text{ID} = 50\ \mu\text{m}$ hoặc $100\ \mu\text{m}$.
  • Hóa chất và chất đệm: Các chất chuẩn phân tích có độ tinh khiết cao gồm Glucosamin hydrochloride, Glucosamin sulfate, muối $\text{CaCl}_2$, $\text{MgCl}_2$, Vitamin B1 (thiamin hydroclorid), Vitamin B5 (calci pantothenat), Vitamin B6 (pyridoxine hydroclorid), Vitamin B9 (acid folic). Hóa chất đệm và phụ gia gồm Acid acetic (Ace), Arginin (Arg), Histidin (His), 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) và dung môi Acetonitrile (ACN).
  • Kỹ thuật bơm mẫu: Bơm mẫu bằng phương pháp thủy động học kiểu xi phông (hydrodynamic siphon injection), thực hiện bằng cách nâng lọ chứa mẫu lên một độ cao xác định ($\Delta h$) so với lọ chứa dung dịch điện ly ở đầu ra trong một khoảng thời gian nhất định ($\Delta t$).
  • Quy trình xử lý mẫu thực tế: Mẫu viên nén hoặc viên nang được nghiền mịn thành bột đồng nhất, cân chính xác lượng mẫu thích hợp, hòa tan và chiết bằng nước cất hai lần hoặc hệ dung môi phù hợp, hỗ trợ chiết bằng bể siêu âm, ly tâm loại bỏ cặn tá dược không tan, sau đó lọc qua màng lọc cellulose acetate kích thước lỗ $0,45\ \mu\text{m}$ trước khi tiêm vào hệ thống CE.
  • Phương pháp đối chứng thẩm định:
    • Đối chứng định lượng Glucosamin: Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang (HPLC-FLD).
    • Đối chứng định lượng Canxi và Magie: Quang phổ phát xạ nguyên tử plasma kết hợp cảm ứng (ICP-OES).
    • Đối chứng định lượng Vitamin B6: Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng đi-ốt (HPLC-PDA).
    • Đối chứng định lượng Vitamin B1, B5, B9: Sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ hai lần (UPLC-MS/MS).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp tổng quan cơ sở lý thuyết và tài liệu khoa học bao gồm 5 phần trọng tâm:

  1. Tổng quan về glucosamin và canxi: Cấu trúc phân tử glucosamin ($\text{C}6\text{H}{13}\text{NO}_5$, khối lượng phân tử $179,17\text{ g/mol}$, tên IUPAC: (3R,4R,5S)-3-Amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol, $\text{p}K_a = 7,58 \pm 0,2$); các dạng muối thương mại (glucosamin sulfate, glucosamin hydrochloride, N-acetylglucosamin, glucosamin sulfate potassium chloride); đặc tính sinh lý của canxi ($98%$ tập trung ở xương, răng; $2%$ trong máu với $50%$ dạng $\text{Ca}^{2+}$ tự do; tỷ số khuyến nghị $\text{Ca/P} > 0,8$).
  2. Tổng quan về vitamin B6 và magie: Cấu trúc vitamin B6 ($\text{C}8\text{H}{12}\text{ClNO}_3$, khối lượng phân tử $205,64\text{ g/mol}$, $\text{p}K_a = 9,4$, tồn tại ở 3 dạng pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamin có thể chuyển hóa thành dạng hoạt tính pyridoxal 5'-phosphate - PLP); vai trò của magie (đồng yếu tố của hơn 300 hệ enzym, $50\text{--}70%$ nằm ở xương, nhu cầu khuyến nghị người lớn $310\text{--}400\text{ mg/ngày}$).
  3. Tổng quan về vitamin B1, vitamin B5 và vitamin B9:
    • Vitamin B1 (thiamin, $\text{C}{12}\text{H}{17}\text{N}_4\text{OS}^+$, khối lượng $265,355\text{ g/mol}$, $\text{p}K_a = 10,3$, phòng trị bệnh Beri-Beri và hội chứng não Wernicke).
    • Vitamin B5 (acid pantothenic, $\text{C}9\text{H}{17}\text{NO}_5$, khối lượng $219,235\text{ g/mol}$, $\text{p}K_a = 4,41$, thành phần tạo coenzym A).
    • Vitamin B9 (acid folic, $\text{C}{19}\text{H}{19}\text{N}7\text{O}6$, khối lượng $441,3975\text{ g/mol}$, $\text{p}K{a1} = 4,65$, $\text{p}K{a2} = 6,75$, $\text{p}K_{a3} = 9,00$, tham gia tổng hợp AND, ngừa dị tật ống thần kinh).
  4. Tổng quan các phương pháp phân tích: Đánh giá chi tiết ưu điểm, hạn chế và giới hạn phát hiện của các phương pháp quang phổ (UV-Vis, ICP-OES), phương pháp điện hóa (điện cực chọn lọc ion ISE, von-ampe xung/sóng vuông), phương pháp sắc ký lỏng (RP-HPLC, HILIC) và điện di mao quản.
  5. Tổng quan về phương pháp điện di mao quản và detector $\text{C}^4\text{D}$: Lịch sử phát triển từ Tiselius (1937), Hjerten (1967), Jorgenson (1980) đến việc phát triển detector $\text{C}^4\text{D}$ bởi Zemann, Da Silva, Do Lago (1998) và Hauser (2002); phân loại các kỹ thuật CE (CZE, IFF, ITP, CGE, MECC); cơ chế hình thành dòng EOF; cấu tạo mạch điện tương đương và nguyên tắc đo độ dẫn không tiếp xúc.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện hóa chất, thiết bị và các bước thiết kế thực nghiệm:

  • Liệt kê thông số kỹ thuật của hệ điện di mao quản CE-$\text{C}^4\text{D}$, nguồn cao thế, mao quản silica trần và các hóa chất chuẩn có độ tinh khiết cao.
  • Thiết lập quy trình khảo sát tối ưu hóa đơn biến các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách điện di: nồng độ và thành phần hệ đệm điện ly nền (BGE), giá trị pH, điện áp tách cao thế ($V$), thời gian và chiều cao bơm mẫu xi phông.
  • Thiết lập quy trình phân tích đối chứng sử dụng các thiết bị hiện đại: HPLC-FLD, ICP-OES, HPLC-PDA và UPLC-MS/MS.
  • Mô tả quy trình chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu chiết xuất đối với các dạng chế phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm.
  • Xác lập các công thức toán học và phương pháp thống kê để tính toán các thông số thẩm định phương pháp phân tích: đường chuẩn tuyến tính ($R^2$), giới hạn phát hiện ($\text{LOD} = 3\text{SD}/S$ hoặc theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu $S/N = 3$), giới hạn định lượng ($\text{LOQ} = 10\text{SD}/S$ hoặc $S/N = 10$), độ lặp lại ($\text{RSD}%$) và độ thu hồi ($\text{Recovery}%$) theo chuẩn AOAC và ICH.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm, chia thành 3 phần nghiên cứu độc lập tương ứng với 3 hệ phân tích:

1. Xác định đồng thời glucosamin và canxi bằng phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$

  • Khảo sát tối ưu hóa: Khảo sát thành phần và nồng độ dung dịch điện ly nền, giá trị pH, điện thế tách, thời gian và chiều cao bơm mẫu xi phông để đạt được độ phân giải pic tách tốt nhất giữa cation canxi ($\text{Ca}^{2+}$) và cation glucosaminium ($\text{Gluc}^+$) trong thời gian phân tích ngắn nhất.
  • Khảo sát độ chọn lọc và chất cản trở: Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần phối trộn phổ biến trong thuốc xương khớp như methylsulfonylmethane (MSM), chondroitin sulfate và các cation vô cơ cản trở ($K^+, Na^+, Zn^{2+}, Mg^{2+}$). Kết quả thực nghiệm cho thấy các chất này không gây ảnh hưởng đến diện tích pic và thời gian di chuyển của glucosamin và canxi.
  • Đánh giá phương pháp phân tích: Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ canxi và glucosamin; xác định các thông số phương trình hồi quy, hệ số tương quan $R^2$, giá trị LOD, LOQ, độ lặp lại ($\text{RSD} < 5%$) và độ thu hồi ($\text{Recovery} = 95\text{--}105%$).
  • Ứng dụng trên mẫu thực tế và đối chứng: Phân tích định lượng đồng thời glucosamin và canxi trong hàng loạt mẫu TPCN thương mại (mẫu M3, M5, M6, M13, M14...). Kết quả phân tích bằng CE-$\text{C}^4\text{D}$ cho thấy sự tương quan chặt chẽ và không có sai khác mang ý nghĩa thống kê khi so sánh đối chứng với phương pháp HPLC-FLD (đối với glucosamin) và phương pháp ICP-OES (đối với canxi), đồng thời phù hợp với hàm lượng công bố trên nhãn sản phẩm.

2. Xác định đồng thời vitamin B6 và magie bằng phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$

  • Khảo sát tối ưu hóa: Khảo sát lựa chọn hệ đệm điện ly nền thích hợp (khảo sát hệ đệm chứa Arginin - Arg), tỷ lệ dung môi hữu cơ Acetonitrile (ACN) thêm vào đệm, điều chỉnh pH hệ đệm, nồng độ Arg, điện áp thế tách, thời gian và chiều cao bơm mẫu thủy động học.
  • Đánh giá phương pháp phân tích: Xây dựng đường chuẩn tuyến tính của $\text{Mg}^{2+}$ và vitamin B6 (pyridoxine); xác định phương trình hồi quy, hệ số tương quan tuyến tính, giá trị LOD, LOQ, độ lặp lại và độ thu hồi. Kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp trên nền mẫu dược phẩm phối trộn.
  • Ứng dụng trên mẫu thực tế và đối chứng: Phân tích các mẫu thuốc và TPCN chứa đồng thời magie và vitamin B6 trên thị trường. Kết quả định lượng được kiểm chứng chéo với phương pháp đối chứng ICP-OES (đối với magie) và HPLC-PDA (đối với vitamin B6), khẳng định độ đúng và độ tin cậy của quy trình CE-$\text{C}^4\text{D}$.

3. Xác định đồng thời vitamin B1, vitamin B5 và vitamin B9 bằng phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$

  • Khảo sát tối ưu hóa: Do vitamin B1 tích điện dương, vitamin B5 và vitamin B9 tồn tại ở dạng anion ở pH kiềm/trung tính, việc phân tách đồng thời đòi hỏi khảo sát chi tiết thành phần dung dịch điện ly, tỷ lệ chất đệm, pH dung dịch đệm, nồng độ đệm, điện thế phân tách và thời gian bơm mẫu xi phông để kiểm soát chính xác dòng điện di thẩm thấu (EOF), đảm bảo cả 3 vitamin di chuyển qua cửa sổ detector $\text{C}^4\text{D}$ với độ phân giải cao.
  • Đánh giá phương pháp phân tích: Xây dựng phương trình đường chuẩn cho từng vitamin B1, B5, B9; xác định hệ số hồi quy $R^2$, giới hạn phát hiện LOD, độ chụm và hiệu suất thu hồi mẫu. Đánh giá độ đặc hiệu trên điện di đồ.
  • Ứng dụng trên mẫu thực tế và đối chứng: Áp dụng quy trình xác định hàm lượng vitamin B1, B5, B9 trong các chế phẩm TPCN và dược phẩm đa vitamin. Kết quả phân tích đối chứng bằng kỹ thuật khối phổ siêu hiệu năng UPLC-MS/MS cho thấy sự tương thích cao về số liệu, chứng minh phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$ hoàn toàn đáp ứng các yêu cầu kiểm nghiệm thực tế.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  • Luận án đã phát triển thành công 03 quy trình phân tích mới trên cùng một nền tảng thiết bị điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$\text{C}^4\text{D}$), cho phép xác định đồng thời các cặp và nhóm hợp chất có tính chất hóa lý rất khác nhau trong mẫu dược phẩm và thực phẩm chức năng:
    1. Phân tích đồng thời cation vô cơ $\text{Ca}^{2+}$ và hợp chất amino-sugar hữu cơ glucosamin.
    2. Phân tích đồng thời cation vô cơ $\text{Mg}^{2+}$ và vitamin B6 (pyridoxine).
    3. Phân tích đồng thời 3 vitamin nhóm B tan trong nước có điện tích khác biệt: vitamin B1, vitamin B5 và vitamin B9.
  • Chứng minh về mặt khoa học khả năng ứng dụng hiệu quả của detector đo độ dẫn không tiếp xúc $\text{C}^4\text{D}$ trong việc phát hiện trực tiếp đồng thời các chất phân tích không có nhóm mang màu hoặc có tính chất quang học khác biệt, không cần qua giai đoạn tạo dẫn xuất hóa học phức tạp.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Thiết lập các quy trình phân tích đơn giản, nhanh chóng, có độ tin cậy và độ chính xác cao, tiêu tốn lượng mẫu và hóa chất rất nhỏ (ở mức microlit), giảm thiểu tối đa lượng dung môi hữu cơ thải ra môi trường.
  • Thiết bị CE-$\text{C}^4\text{D}$ có kết cấu gọn nhẹ, chi phí đầu tư ban đầu và chi phí vận hành bảo trì thấp hơn rất nhiều so với các hệ thống HPLC, ICP-OES hay UPLC-MS/MS, hoàn toàn phù hợp với điều kiện kinh tế và năng lực trang thiết bị của các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm tại Việt Nam.
  • Cung cấp công cụ phân tích hữu hiệu phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lượng các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng lưu hành trên thị trường, góp phần bảo vệ quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng.

Kiến nghị và đề xuất

  • Đề xuất đưa các quy trình phân tích bằng CE-$\text{C}^4\text{D}$ đã xây dựng vào áp dụng thực tế tại các trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm - mỹ phẩm, các viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm và các cơ sở sản xuất TPCN.
  • Đề xuất mở rộng nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$ để phân tích đồng thời các nhóm khoáng chất và vitamin khác trong các dạng nền mẫu thực phẩm bổ sung phức tạp hơn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi đối tượng mẫu của luận án tập trung chủ yếu vào các dạng bào chế thương phẩm tương đối sạch của dược phẩm và thực phẩm chức năng (viên nén, viên nang, dung dịch), chưa tiến hành đánh giá trên các nền mẫu sinh học phức tạp (huyết thanh, nước tiểu) hoặc nền mẫu thực phẩm tự nhiên có hàm lượng chất béo, protein cao.
  • Kỹ thuật điện di mao quản phụ thuộc nhiều vào độ ổn định của dòng điện di thẩm thấu (EOF) và nhiệt độ môi trường buồng đo; sự dao động nhiệt độ hoặc thay đổi nhỏ của thành phần dung dịch điện ly có thể ảnh hưởng đến độ lặp lại của thời gian di chuyển giữa các ngày phân tích.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy trình phân tích CE-$\text{C}^4\text{D}$ cho các nhóm vi chất dinh dưỡng, acid amin và các nguyên tố vi lượng khác trong cùng một hệ mẫu.
  • Nghiên cứu hoàn thiện các quy trình tiền xử lý và làm giàu mẫu tự động trực tiếp trên cột (on-line preconcentration) để nâng cao hơn nữa độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện khi phân tích các mẫu có hàm lượng hoạt chất dạng vết.
  • Mở rộng phạm vi ứng dụng của phương pháp sang phân tích các mẫu sinh học, dược động học và thực phẩm tươi sống.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược, Kiểm nghiệm thuốc: Nguồn tài liệu học thuật giá trị về lý thuyết điện di mao quản, nguyên lý hoạt động của detector độ dẫn không tiếp xúc $\text{C}^4\text{D}$, phương pháp tối ưu hóa điều kiện tách điện di và quy trình thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn quốc tế (ICH, AOAC).
  • Giảng viên và các nhà nghiên cứu: Tài liệu tham khảo hữu ích trong công tác giảng dạy các học phần phân tích công cụ hiện đại, hóa học phân tích môi trường và kiểm nghiệm thực phẩm chức năng.
  • Kỹ thuật viên, chuyên viên phân tích tại các trung tâm kiểm nghiệm, viện nghiên cứu và nhà máy dược phẩm: Có thể tiếp nhận và áp dụng trực tiếp 03 quy trình phân tích thực nghiệm đã được thẩm định hoàn chỉnh để phân tích thường quy các chế phẩm bổ sung xương khớp, chế phẩm bổ sung thần kinh - chuyển hóa và các sản phẩm đa vitamin.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao nhất

  • Chương 2: Bảng thông số và quy trình thẩm định phương pháp phân tích (xây dựng đường chuẩn, tính toán LOD, LOQ, độ lặp lại, độ thu hồi và độ đặc hiệu).
  • Chương 3: Các bộ thông số tối ưu hóa thực nghiệm chi tiết (thành phần đệm, pH, thế tách, điều kiện bơm mẫu xi phông) cho 3 hệ phân tích đồng thời: Glucosamin - Canxi, Magie - Vitamin B6, và Vitamin B1 - B5 - B9.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$ có thể phân tích đồng thời các chất có bản chất khác biệt như Canxi ($\text{Ca}^{2+}$) và Glucosamin trong cùng một lần chạy?

Trong dung dịch đệm có pH thích hợp, canxi tồn tại ở dạng cation vô cơ $\text{Ca}^{2+}$ và glucosamin tồn tại ở dạng cation hữu cơ glucosaminium ($\text{Gluc}^+$) do nhóm $-\text{NH}_2$ bị proton hóa ($\text{p}K_a = 7,58$). Khi đặt dưới một điện trường $E$, hai cation này di chuyển với tốc độ khác nhau do sự khác biệt về tỷ số điện tích trên bán kính hydrat ($q/r$), dẫn đến sự phân tách không gian trong lòng mao quản. Detector $\text{C}^4\text{D}$ phát hiện các chất dựa trên sự thay đổi độ dẫn điện tổng cộng khi từng vùng ion di chuyển qua hai điện cực ngoài mao quản, mà không phụ thuộc vào khả năng hấp thụ quang học UV-Vis của chất phân tích, cho phép ghi nhận đồng thời cả hai tín hiệu trên cùng một điện di đồ.

2. Các phương pháp phân tích tiêu chuẩn nào đã được tác giả sử dụng để đối chứng và kiểm tra chéo độ tin cậy của phương pháp CE-$\text{C}^4\text{D}$?

Để khẳng định độ đúng và độ tin cậy của các quy trình CE-$\text{C}^4\text{D}$ tự xây dựng, tác giả đã sử dụng 4 phương pháp phân tích đối chứng độc lập:

  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang (HPLC-FLD) để đối chứng phân tích Glucosamin.
  • Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử plasma kết hợp cảm ứng (ICP-OES) để đối chứng phân tích Canxi và Magie.
  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector mảng đi-ốt (HPLC-PDA) để đối chứng phân tích Vitamin B6.
  • Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ hai lần (UPLC-MS/MS) để đối chứng phân tích hỗn hợp Vitamin B1, B5 và B9.

3. Kỹ thuật bơm mẫu nào được lựa chọn trong các khảo sát thực nghiệm CE-$\text{C}^4\text{D}$ của luận án?

Luận án sử dụng kỹ thuật bơm mẫu thủy động học kiểu xi phông (hydrodynamic siphon injection). Kỹ thuật này đưa mẫu vào đầu mao quản silica dựa trên sự chênh lệch áp suất thủy tĩnh tạo ra bởi sự chênh lệch độ cao ($\Delta h$) giữa lọ mẫu ở đầu vào và lọ đệm ở đầu ra trong một khoảng thời gian xác định ($\Delta t$). Các thông số về thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu đã được khảo sát tối ưu hóa chi tiết trong Chương 3 cho từng hệ chất phân tích.

4. Vì sao phương pháp quang phổ UV-Vis và điện di mao quản với detector UV (CE-UV) gặp khó khăn khi phân tích đồng thời Glucosamin và Canxi?

Glucosamin và ion canxi ($\text{Ca}^{2+}$) không có hệ thống nối đôi liên hợp mang màu (chromophore) mạnh để có thể hấp thụ trực tiếp bức xạ trong vùng tử ngoại - khả kiến (UV-Vis). Để đo được bằng UV-Vis, cần phải thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất màu hoặc tạo phức chất. Tuy nhiên, rất khó tìm được một tác nhân phản ứng tạo phức/dẫn xuất chung có thể phản ứng đồng thời và định lượng với cả một cation kim loại vô cơ ($\text{Ca}^{2+}$) và một amino-monosaccharide hữu cơ (glucosamin) trong cùng một điều kiện môi trường dung dịch.

5. Các dạng muối thường gặp của Glucosamin trên thị trường và công thức phân tử tương ứng được nêu trong luận án là gì?

Luận án tổng kết 4 dạng muối thương mại phổ biến của Glucosamin gồm:

  • Glucosamin sulfate: Công thức phân tử $(\text{C}6\text{H}{13}\text{NO}_5)_2\text{SO}_4$, khối lượng mol phân tử $456,52\text{ g/mol}$.
  • Glucosamin hydrochloride: Công thức phân tử $\text{C}6\text{H}{14}\text{ClNO}_5$, khối lượng mol phân tử $215,63\text{ g/mol}$.
  • N-Acetylglucosamin: Công thức phân tử $\text{C}8\text{H}{15}\text{NO}_6$, khối lượng mol phân tử $221,21\text{ g/mol}$.
  • Glucosamin sulfate potassium chloride: Công thức phân tử $\text{C}{12}\text{H}{28}\text{Cl}_2\text{K}_2\text{N}2\text{O}{14}\text{S}$, khối lượng mol phân tử $605,51\text{ g/mol}$.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Quang Huy đã phát triển và thẩm định thành công 03 quy trình phân tích đồng thời bằng phương pháp điện di mao quản tích hợp detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$\text{C}^4\text{D}$) để định lượng Canxi - Glucosamin, Magie - Vitamin B6, và Vitamin B1 - B5 - B9 trong các chế phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng. Các quy trình phân tích đạt độ đặc hiệu, độ lặp lại và độ thu hồi cao, có kết quả tương thích chặt chẽ với các phương pháp phân tích tiêu chuẩn hiện đại như HPLC-FLD, ICP-OES, HPLC-PDA và UPLC-MS/MS. Công trình cung cấp giải pháp kỹ thuật hiệu quả, kinh tế và thân thiện với môi trường, có khả năng áp dụng trực tiếp trong kiểm soát chất lượng dược phẩm và thực phẩm chức năng tại Việt Nam.