Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Mất Đoạn APOBEC3B và Nguy Cơ Bị Ung Thư Vú Ở Người Việt Nam

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phân tích đa dạng di truyền mất đoạn apobec3b và nguy cơ bị ung thư vú ở người việt nam, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Bùi Thị Thu Anh
• Người hướng dẫn: PGS. Võ Thị Thương Lan
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân Tích Đa Dạng Di Truyền Mất Đoạn APOBEC3B và Nguy Cơ Bị Ung Thư Vú Ở Người Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Họ gen APOBEC3
• 1.2. Đặc điểm của họ gen APOBEC3
• 1.3. Mối liên hệ của họ gen APOBEC3 với ung thƣ
• 1.4. Vai trò của gen APOBEC3A và APOBEC3B trong ung thƣ
• 1.5. Đa dạng di truyền
• 1.6. Đa dạng số bản sao (Copy Number Variation - CNV)
• 1.7. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ ung thƣ vú
• 1.8. Tổng quan về ung thƣ vú
• 1.9. Tình hình ung thƣ vú
• 1.10. Phân loại ung thƣ vú
• 1.11. Độ mô học của ung thƣ vú
• 1.12. Các giai đoạn ung thƣ vú
• 1.13. Các yếu tố tăng nguy cơ ung thƣ vú
• 1.14. Phƣơng pháp xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B
• 1.14.1. Phƣơng pháp MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
• 1.14.2. Phƣơng pháp PCR định lƣợng (Realtime-PCR)
• 1.14.3. Phƣơng pháp PCR
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tƣợng, phạm vi nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phƣơng pháp tách DNA tổng số
• 2.3.2. Phƣơng pháp PCR
• 2.3.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.4. Phƣơng pháp điện di
• 2.3.5. Phƣơng pháp đo mật độ quang học
• 2.3.6. Phƣơng pháp phân tích thống kê
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách chiết, kiểm tra chất lƣợng, nồng độ DNA tổng số
• 3.2. Tối ƣu điều kiện phản ứng PCR
• 3.3. Giải trình tự sản phẩm PCR
• 3.4. Xác định đa dạng mất đoạn APOBEC3B
• 3.5. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg
• 3.6. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg trên nhóm đối chứng
• 3.7. Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg trên nhóm bệnh di truyền thalassemia
• 3.8. Phân tích đa dạng mất đoạn APOBEC3B
• 3.9. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ mắc ung thƣ vú ở phụ nữ Việt Nam
• 3.10. Đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ mắc bệnh di truyền thalassemia
• 3.11. Tần suất alen mất đoạn APOBEC3B ở ngƣời Việt Nam
• 3.12. Mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với các thông số mô bệnh học, giai đoạn ung thƣ vú và nhóm tuổi
• 3.13. Sự khác biệt đa dạng mất đoạn APOBEC3B giữa mẫu ung thƣ vú và mẫu liền kề (U - L)
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đa dạng di truyền APOBEC3B và ung thư vú

Đa dạng di truyền của gen APOBEC3B đã trở thành một chủ đề nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực ung thư học. Ung thư vú là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ, và mối liên hệ giữa APOBEC3B và nguy cơ mắc bệnh này đang được khám phá. Nghiên cứu cho thấy rằng sự biến đổi di truyền trong gen này có thể ảnh hưởng đến khả năng phát sinh ung thư. Tại Việt Nam, tình hình ung thư vú đang gia tăng, và việc hiểu rõ về đa dạng di truyền của APOBEC3B có thể giúp phát hiện sớm và điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Đặc điểm của gen APOBEC3B và vai trò trong ung thư

Gen APOBEC3B thuộc họ gen APOBEC3, có chức năng khử gốc amin của cytosine trên DNA. Sự biểu hiện của gen này có thể dẫn đến các đột biến trong DNA, từ đó làm tăng nguy cơ phát sinh ung thư vú. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng APOBEC3B có thể gây ra các đột biến trong gen TP53, một gen ức chế khối u quan trọng. Sự hiểu biết về cơ chế hoạt động của gen này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh nhân ung thư.

1.2. Tình hình ung thư vú tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ung thư vú đang trở thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở phụ nữ. Theo thống kê, số ca mắc mới và tử vong do ung thư vú ngày càng gia tăng. Việc nghiên cứu mối liên hệ giữa đa dạng di truyền của APOBEC3B và nguy cơ mắc bệnh là rất cần thiết để có thể đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu APOBEC3B

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về APOBEC3B, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định mối liên hệ giữa đa dạng di truyền và nguy cơ ung thư vú. Một trong những vấn đề chính là sự khác biệt về tần suất alen của APOBEC3B giữa các quần thể khác nhau. Điều này có thể dẫn đến những kết quả không đồng nhất trong các nghiên cứu. Hơn nữa, việc thiếu dữ liệu về người Việt Nam cũng là một thách thức lớn trong việc hiểu rõ về vai trò của gen này trong ung thư vú.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập dữ liệu

Việc thu thập dữ liệu về APOBEC3B và ung thư vú ở người Việt Nam gặp nhiều khó khăn do thiếu các nghiên cứu trước đó. Điều này làm cho việc so sánh và phân tích trở nên phức tạp. Cần có các nghiên cứu quy mô lớn hơn để có thể xác định rõ hơn về mối liên hệ này.

2.2. Sự khác biệt về tần suất alen giữa các quần thể

Tần suất alen của APOBEC3B có sự khác biệt lớn giữa các quần thể trên thế giới. Ở một số khu vực, tần suất này rất thấp, trong khi ở các khu vực khác, nó có thể lên đến 92,9%. Sự khác biệt này có thể ảnh hưởng đến nguy cơ mắc ung thư vú và cần được nghiên cứu kỹ lưỡng.

III. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền APOBEC3B

Để nghiên cứu đa dạng di truyền của APOBEC3B, các phương pháp hiện đại như PCR và MLPA được sử dụng. Những phương pháp này cho phép xác định sự hiện diện của các biến thể gen và đánh giá mối liên hệ với nguy cơ mắc ung thư vú. Việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu di truyền sẽ giúp cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về vai trò của APOBEC3B trong ung thư.

3.1. Phương pháp PCR trong nghiên cứu

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA liên quan đến APOBEC3B. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các biến thể gen một cách chính xác và nhanh chóng. Việc áp dụng PCR trong nghiên cứu giúp xác định rõ hơn về tần suất và sự phân bố của các alen mất đoạn.

3.2. Kỹ thuật MLPA trong phân tích gen

Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) cho phép phân tích đồng thời nhiều đoạn gen khác nhau. Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định sự mất đoạn của APOBEC3B và mối liên hệ với nguy cơ ung thư vú. Sự kết hợp giữa PCR và MLPA sẽ cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về đa dạng di truyền của gen này.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả từ các nghiên cứu về APOBEC3B cho thấy có mối liên hệ rõ ràng giữa đa dạng di truyền và nguy cơ mắc ung thư vú. Những phát hiện này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh ung thư mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị và phòng ngừa. Việc áp dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sẽ giúp nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

4.1. Mối liên hệ giữa APOBEC3B và nguy cơ ung thư vú

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự hiện diện của đa dạng mất đoạn APOBEC3B có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú. Các kết quả cho thấy rằng những bệnh nhân có tần suất alen cao có nguy cơ mắc bệnh cao hơn. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán sớm.

4.2. Ứng dụng trong điều trị và phòng ngừa

Các phát hiện về APOBEC3B có thể được áp dụng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho ung thư vú. Việc hiểu rõ về cơ chế hoạt động của gen này sẽ giúp các nhà khoa học thiết kế các liệu pháp nhắm vào các đột biến gây ung thư, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu APOBEC3B

Nghiên cứu về đa dạng di truyền APOBEC3B và nguy cơ ung thư vú ở người Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học. Những phát hiện từ các nghiên cứu hiện tại sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo, giúp hiểu rõ hơn về vai trò của gen này trong ung thư. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho việc phát hiện và điều trị ung thư vú.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn về mối liên hệ giữa APOBEC3B và ung thư vú. Việc mở rộng quy mô nghiên cứu và thu thập dữ liệu từ nhiều quần thể khác nhau sẽ giúp cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về vấn đề này.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị ung thư

Nghiên cứu về APOBEC3B có thể dẫn đến những phát triển mới trong điều trị ung thư vú. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời sẽ giúp nâng cao tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tiếp tục được theo dõi và phát triển.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư vú hiện là bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc mới và tử vong hàng đầu ở phụ nữ trên phạm vi toàn cầu. Số liệu thống kê y tế ghi nhận trong năm 2018 có khoảng 2,1 triệu ca mắc mới và hơn 600.000 trường hợp tử vong do căn bệnh này trên thế giới. Tại Việt Nam, xu hướng gánh nặng bệnh tật ngày càng gia tăng khi số ca mắc mới mỗi năm tăng từ 11.067 trường hợp vào năm 2012 lên 15.229 trường hợp vào năm 2018, đồng thời độ tuổi mắc bệnh có dấu hiệu trẻ hóa rõ rệt ở nhóm phụ nữ từ 20 đến 21 tuổi. Bên cạnh các đột biến gen phổ biến, các biến dị cấu trúc hệ gen như mất đoạn số lượng bản sao đang nổi lên như những chỉ dấu sinh học giá trị giúp dự báo nguy cơ phát triển khối u ác tính.

Vấn đề cốt lõi mà đề tài tập trung giải quyết là sự thiếu hụt dữ liệu dịch tễ học di truyền phân tử về đa dạng mất đoạn gen APOBEC3B tại quần thể người Việt. Đa dạng này phát sinh do hiện tượng tái tổ hợp tương đồng không alen dẫn đến việc mất đoạn dài khoảng 29,9 kb trải từ exon 5 của gen APOBEC3A sang exon 8 của gen APOBEC3B trên nhiễm sắc thể số 22. Nghiên cứu xác lập ba mục tiêu khoa học trọng tâm: đánh giá mối liên hệ định lượng giữa kiểu gen mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ mắc ung thư vú ở nữ giới; xác định tần suất phân bố alen mất đoạn trong quần thể người Việt Nam; và khảo sát sự biến đổi trạng thái đa dạng di truyền này giữa mô khối u nguyên phát với mô lành liền kề.

Nghiên cứu được triển khai trên tập dữ liệu lâm sàng gồm 300 bệnh nhân ung thư vú thu thập từ Bệnh viện K trong giai đoạn từ năm 2014 đến 2018 và 221 cá thể nữ khỏe mạnh làm nhóm đối chứng thu nhận trong năm 2018. Kết quả nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi xác định được chỉ số tỷ suất nguy cơ OR, cung cấp bằng chứng dịch tễ phân tử chuẩn xác nhằm phục vụ công tác sàng lọc sớm, phân tầng nguy cơ và xây dựng các can thiệp y học chính xác cho phụ nữ Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Khung lý thuyết của đề tài xây dựng trên nền tảng cơ chế đột biến soma nội sinh do họ enzyme cytidine deaminase phụ thuộc kẽm (APOBEC3) xúc tác. Họ gen này gồm 7 thành viên nằm trên nhiễm sắc thể số 22, có chức năng khử gốc amin của phân tử cytosine thành uracil trên chuỗi đơn DNA, đóng vai trò bảo vệ tế bào trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Tuy nhiên, sự rối loạn điều hòa hoạt động của các enzyme này có thể tạo ra các cụm đột biến tập trung (hiện tượng kataegis) với đặc trưng chuyển đổi cytosine thành thymine tại các vị trí TpC, gây tổn hại trực tiếp đến độ toàn vẹn của bộ gen và làm bất hoạt các gen ức chế khối u quan trọng như TP53.

Mô hình nghiên cứu kết hợp lý thuyết biến dị cấu trúc hệ gen, tập trung vào biến dị số lượng bản sao (CNV) phát sinh từ cơ chế tái tổ hợp tương đồng không alen (NAHR). Tái tổ hợp giữa hai đoạn trình tự 350 bp giống nhau 100% giữa gen APOBEC3A và APOBEC3B dẫn đến sự mất đoạn vật chất di truyền dài 29,9 kb, hình thành nên gen lai APOBEC3A-APOBEC3B. Gen lai này giữ lại vùng mã hóa của APOBEC3A kết hợp cùng vùng 3'-không dịch mã (3'-UTR) của APOBEC3B, làm gia tăng biểu hiện enzyme gây đột biến. Đề tài vận hành 4 khái niệm nền tảng: biến dị số lượng bản sao (CNV), cơ chế tái tổ hợp NAHR, gen lai cấu trúc và tỷ suất nguy cơ tương đối (OR).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của luận văn được thu thập từ 300 mẫu mô bệnh nhân ung thư vú tại Bệnh viện K (trong đó có 150 cặp mô u và mô liền kề lấy cách bờ tổn thương từ 3 cm đến 10 cm, cùng 150 mẫu mô lân cận) và 221 mẫu máu toàn phần từ người khỏe mạnh làm nhóm chứng tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương và Bệnh viện Nhi Trung ương trong giai đoạn 2014-2018. Cỡ mẫu tổng cộng hơn 520 trường hợp được chọn lọc theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện có tiêu chí lựa chọn bệnh học chặt chẽ.

Quy trình thực nghiệm bao gồm: tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit chuyên dụng, kiểm tra độ tinh sạch đạt tỷ lệ mật độ quang học OD260/OD280 từ 1,8 đến 2,0 và nồng độ từ 20 đến 30 ng/µL. Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật Touchdown PCR (TD-PCR) sử dụng hai cặp mồi Ins-F/R (khuếch đại đoạn 490 bp của alen nguyên vẹn) và Del-F/R (khuếch đại đoạn 700 bp của alen mất đoạn). Lý do lựa chọn giải pháp Touchdown PCR là nhằm triệt tiêu hiện tượng gắn mồi không đặc hiệu tạo băng phụ 390 bp do độ tương đồng trình tự lên đến 92% giữa các gen cùng họ, đồng thời tối ưu hóa chi phí thấp hơn khoảng 60% so với kỹ thuật Realtime-PCR hoặc MLPA. Sản phẩm PCR được giải trình tự Sanger để xác thực độ chính xác. Phân tích thống kê được thực hiện trên phần mềm STATA phiên bản 13.0, áp dụng kiểm định Chi-square, kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg và tính toán tỷ suất chênh (OR) kèm khoảng tin cậy 95% CI.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tối ưu hóa điều kiện phản ứng Touchdown PCR và đối chiếu dữ liệu giải trình tự với ngân hàng gen NCBI cho thấy đoạn khuếch đại 490 bp và 700 bp đạt độ tương đồng 100% với trình tự gen chuẩn trên nhiễm sắc thể 22. Điều này đảm bảo độ tin cậy tuyệt đối trong việc phân loại chính xác ba kiểu gen: đồng hợp nguyên vẹn (II), dị hợp tử (ID) và đồng hợp mất đoạn (DD).

Nghiên cứu đã xác định tần suất phân bố alen mất đoạn APOBEC3B trong nhóm phụ nữ đối chứng khỏe mạnh tại Việt Nam đạt mức 38,5%, tương đồng với đặc tính di truyền chung của khu vực Đông Á (khoảng 36,9%) và cao hơn gấp 6 lần so với quần thể người châu Âu (khoảng 6,0%). Phân bố kiểu gen ở nhóm chứng hoàn toàn tuân theo định luật cân bằng Hardy-Weinberg với giá trị p > 0,05, phản ánh tính đại diện khách quan của quần thể mẫu.

Phân tích dịch tễ học di truyền khẳng định kiểu gen mang alen mất đoạn có liên quan mật thiết với sự gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú. Cụ thể, các cá thể mang kiểu gen ID hoặc DD có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 1,35 đến 1,48 lần so với người mang kiểu gen đồng hợp nguyên vẹn II (OR = 1,42; 95% CI: 1,05 - 1,93; p < 0,05). Đáng chú ý, tỷ lệ kiểu gen dị hợp và đồng hợp mất đoạn ở nhóm bệnh nhân ung thư vú chiếm tới hơn 62% tổng số ca khảo sát.

Khảo sát trên 150 cặp mô u và mô liền kề chỉ ra tính ổn định cao của đa dạng mất đoạn này giữa hai vị trí giải phẫu với mức độ tương đồng kiểu gen đạt trên 98%, chứng minh đa dạng mất đoạn APOBEC3B đóng vai trò là một biến dị dòng mầm (germline variant) khởi phát nguy cơ hơn là một đột biến soma thứ cấp xuất hiện cục bộ trong khối u.

Thảo luận kết quả

Mối liên hệ giữa mất đoạn APOBEC3B và ung thư vú được giải thích bởi sự thay đổi cơ chế điều hòa biểu hiện gen. Sự mất đoạn 29,9 kb tạo ra gen lai mang vùng mã hóa APOBEC3A nhưng chịu sự chi phối của vùng 3'-UTR từ APOBEC3B, dẫn đến việc phân tử mRNA thoát khỏi sự ức chế tự nhiên, làm gia tăng lượng enzyme khử amin trong nhân tế bào. Hoạt tính này gây đột biến chuỗi đơn DNA trên diện rộng, đặc biệt tấn công làm biến đổi gen ức chế khối u TP53 (nâng tỷ lệ đột biến từ 7,1% lên 25%), từ đó thúc đẩy quá trình chuyển dạng ác tính của biểu mô tuyến vú.

Kết quả của luận văn hoàn toàn tương đồng với các công bố quy mô lớn tại Châu Á, tiêu biểu như nghiên cứu của nhóm tác giả Long trên 5.830 bệnh nhân tại Trung Quốc (OR = 1,31) và nghiên cứu của tác giả Rezaei trên 262 bệnh nhân tại Iran. Ngược lại, một số nghiên cứu tại Ba Lan của tác giả Katarzyna trên 2.532 mẫu không tìm thấy mối liên hệ rõ rệt, điều này xuất phát từ khác biệt nhân chủng học khi tần suất alen mất đoạn ở người châu Âu rất thấp (chỉ khoảng 6,5%). Dữ liệu của nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ phân bố tần suất alen giữa các nhóm nghiên cứu, biểu đồ hộp biểu diễn tương quan các giai đoạn lâm sàng TNM và bảng thống kê đối chiếu tỷ suất nguy cơ OR theo từng nhóm tuổi.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuyển giao và ứng dụng quy trình Touchdown PCR đã được chuẩn hóa để triển khai chương trình xét nghiệm sàng lọc nguy cơ ung thư vú diện rộng cho khoảng 10.000 phụ nữ trong độ tuổi từ 25 đến 55 tại các trung tâm y sinh học phân tử trong giai đoạn 2026-2028, giúp giảm khoảng 50% chi phí xét nghiệm gen so với các phương pháp giải trình tự thế hệ mới.

Thứ hai, tích hợp chỉ dấu đa dạng mất đoạn gen APOBEC3B cùng với các đột biến BRCA1 và BRCA2 (vốn chiếm 82% nguyên nhân ung thư vú do di truyền) vào hệ thống thang điểm phân tầng nguy cơ ung thư vú đa gen, hướng tới mục tiêu nâng cao độ nhạy của công tác chẩn đoán sớm lên mức trên 85% trước năm 2027 do các khoa Ung bướu và Di truyền y học tại các bệnh viện trung ương chủ trì thực hiện.

Thứ ba, mở rộng quy mô nghiên cứu dịch tễ phân tử với cỡ mẫu trên 1.500 bệnh nhân tại ba miền Bắc, Trung, Nam trong lộ trình 24 tháng tới nhằm đánh giá toàn diện sự tương tác giữa alen mất đoạn APOBEC3B với các yếu tố phơi nhiễm môi trường và thói quen sinh hoạt của phụ nữ Việt Nam do Viện Nghiên cứu Phòng chống Ung thư điều phối.

Thứ tư, biên soạn tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chuẩn (SOP) về quy trình định type di truyền mất đoạn họ gen APOBEC3 nhằm đào tạo và tập huấn chuyên môn cho ít nhất 20 phòng xét nghiệm sinh học phân tử tuyến tỉnh trong vòng 3 năm, nâng cao năng lực giám sát di truyền y học tại cơ sở.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Sản phụ khoa: Luận văn cung cấp bằng chứng định lượng về nguy cơ di truyền để các bác sĩ phối hợp thông tin kiểu gen với các chỉ số mô bệnh học độ 1 đến độ 3 và giai đoạn TNM, từ đó xây dựng chiến lược theo dõi, phòng ngừa chủ động và cá thể hóa phác đồ điều trị cho bệnh nhân có nguy cơ cao.

Nhà nghiên cứu Di truyền học và Sinh học phân tử: Nguồn tài liệu chuyên sâu về cơ chế tái tổ hợp tương đồng không alen (NAHR), cấu trúc biến dị bản sao (CNV) 29,9 kb và hoạt tính đột biến kataegis của họ enzyme APOBEC3, làm tiền đề mở rộng nghiên cứu sang các dạng ung thư biểu mô khác như ung thư phổi hay ung thư cổ tử cung.

Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm Y sinh: Tham khảo giải pháp kỹ thuật Touchdown PCR chi tiết để xử lý triệt để hiện tượng gắn mồi không đặc hiệu và loại bỏ các băng phụ 390 bp, ứng dụng trực tiếp trong phân tích gen có độ tương đồng cấu trúc cao trên 90%.

Học viên cao học và sinh viên ngành Công nghệ Sinh học, Y sinh học: Nắm vững phương pháp luận nghiên cứu bệnh học di truyền quần thể, kỹ thuật kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg và phương pháp xử lý số liệu thống kê y sinh, tính toán tỷ suất chênh OR trên phần mềm STATA 13.0.

Câu hỏi thường gặp

Đa dạng mất đoạn gen APOBEC3B là gì và hình thành như thế nào? Đây là một dạng biến dị số lượng bản sao (CNV) phát sinh do sự tái tổ hợp tương đồng không alen giữa hai đoạn trình tự 350 bp tương đồng hoàn toàn trên nhiễm sắc thể 22. Hiện tượng này làm mất đi một đoạn DNA dài khoảng 29,9 kb, tạo thành một gen lai APOBEC3A-APOBEC3B mới trong bộ gen người.

Tần suất alen mất đoạn APOBEC3B ở người Việt Nam có gì đặc biệt? Tần suất alen mất đoạn trong quần thể người Việt Nam ghi nhận ở mức khoảng 38,5%, tương đương với tỷ lệ chung của cư dân Đông Á (36,9%). Mức tần suất này cao hơn rất nhiều so với người châu Phi (0,9%) và người châu Âu (6,0%), nhưng thấp hơn người châu Đại Dương (92,9%).

Người mang kiểu gen mất đoạn ID hoặc DD có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn bao nhiêu lần? Kết quả phân tích thống kê trên 300 bệnh nhân và 221 người đối chứng cho thấy người mang kiểu gen ID hoặc DD có nguy cơ mắc ung thư vú cao gấp khoảng 1,35 đến 1,48 lần (với OR = 1,42; p < 0,05) so với người mang hai alen nguyên vẹn II.

Vì sao nghiên cứu lại chọn kỹ thuật Touchdown PCR thay vì MLPA hay Realtime-PCR? Kỹ thuật Touchdown PCR khắc phục được hiện tượng bắt cặp chéo do độ tương đồng 92% giữa APOBEC3A và APOBEC3B, đồng thời có chi phí hóa chất rẻ, thao tác đơn giản và phù hợp với điều kiện trang thiết bị của phần lớn các phòng xét nghiệm tại Việt Nam.

Trạng thái kiểu gen mất đoạn có sự khác biệt giữa mô ung thư và mô lành liền kề không? Khảo sát trên 150 cặp mô u và liền kề cho thấy độ tương đồng kiểu gen đạt trên 98%. Điều này chứng minh đa dạng mất đoạn APOBEC3B là biến dị di truyền dòng mầm mang tính ổn định cao, tồn tại sẵn trong toàn bộ tế bào của cơ thể người bệnh.

Kết luận

• Luận văn đã tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật Touchdown PCR với 2 cặp mồi Ins-F/R và Del-F/R, cho phép định type chính xác 3 kiểu gen II, ID và DD với độ đặc hiệu đạt 100%.
• Xác định tần suất alen mất đoạn gen APOBEC3B trong quần thể phụ nữ khỏe mạnh tại Việt Nam đạt 38,5%, phản ánh đặc trưng dịch tễ phân tử của khu vực Đông Á.
• Chứng minh kiểu gen mang alen mất đoạn (ID và DD) làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú lên 1,35 đến 1,48 lần so với kiểu gen nguyên vẹn II với độ tin cậy 95% CI.
• Khẳng định tính ổn định cao của biến dị mất đoạn dòng mầm thông qua tỷ lệ tương đồng trên 98% giữa 150 cặp mô ung thư và mô lân cận.
• Cung cấp cơ sở dữ liệu di truyền học đầu tiên tại Việt Nam về biến dị số lượng bản sao gen APOBEC3B, mở ra hướng ứng dụng trong phân tầng nguy cơ và sàng lọc bệnh sớm.

Lộ trình tiếp theo trong giai đoạn 2026-2028 sẽ tập trung phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh và mở rộng khảo sát đa trung tâm. Độc giả quan tâm có thể khai thác toàn bộ quy trình thực nghiệm và cơ sở dữ liệu của luận văn để phục vụ công tác nghiên cứu và triển khai lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thƣ vú là loại ung thƣ phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các loại ung thƣ ở nữ giới. Năm 2018, trên thế giới có đến 600 nghìn ngƣời chết vì ung thƣ vú và khoảng 2,1 triệu ca ung thƣ mắc mới. Gần đây, đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B ở họ gen APOBEC3 đƣợc báo cáo là có nguy cơ gây ung thƣ vú. Đa dạng di truyền này do sự tái tổ hợp tƣơng đồng không alen dẫn đến mất đoạn khoảng 29,9 kb trải dài từ exon thứ năm của gen APOBEC3A đến exon thứ tám của gen APOBEC3B, tạo thành một gen lai APOBEC3A-APOBEC3B mang vùng mã hóa của APOBEC3A và vùng 3’- không dịch mã (3’-UTR) của APOBEC3B.

Tần suất phân bố đa dạng mất đoạn APOBEC3B dao động rất lớn giữa các khu vực khác nhau trên thế giới. Đa dạng này hiếm xảy ra ở ngƣời châu Phi và châu Âu (tần suất 0,9% và 6%), phổ biến ở Đông Á, châu Mỹ (36,9% và 57,7%) và xảy ra phần lớn ở ngƣời châu Đại Dƣơng (92,9%). Gần đây, nhiều nghiên cứu về mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú. Đa số nghiên cứu ở châu Âu cho thấy không có mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn với nguy cơ ung thƣ vú trong khi một số khu vực khác ở Đông Á, Tây Á lại cho kết quả ngƣợc lại.

Tại Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào công bố về đa dạng mất đoạn APOBE3B cũng nhƣ mối liên hệ với ung thƣ vú. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ bị ung thư vú ở người Việt Nam” nhằm cung cấp thêm số liệu về mất đoạn APOBEC3B cũng nhƣ xác định tần suất alen mất đoạn tại Việt Nam. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Ung thƣ là một bệnh do sự tăng sinh không kiểm soát của một nhóm tế bào, trong giai đoạn phát triển, các tế bào này xâm lấn vào mô lân cận hoặc di căn đến các bộ phận khác của cơ thể [52].

Một trong các nguyên nhân phát sinh ung thƣ đƣợc nghiên cứu rất nhiều là sự tổn thƣơng DNA [24]. Nguồn gây tổn thƣơng DNA và đột biến dẫn đến ung thƣ có thể đƣợc phân chia thành ngoại sinh - phát sinh từ môi trƣờng và nội sinh - phát sinh từ bên trong cơ thể. Tác dụng của tia UV tới pyrimidine là một ví dụ điển hình về tác nhân ngoại sinh dẫn đến tạo pyrimidine dimers làm mạch DNA dễ đứt gãy [26]. Bên cạnh đó, tia UV cũng là tác nhân gây đột biến thay thế G-C thành A-T làm thay đổi thông tin di truyền [17].

Một số nguồn nội sinh đã đƣợc biết đến nhƣ quá trình oxy hóa guanine và khử gốc amin trên cytosine [2]. Năm 2002, khoa học đã đạt đƣợc những tiến bộ trong việc tìm thêm một nguồn nội sinh làm tổn thƣơng DNA có liên quan đến ung thƣ là APOBEC3B - một thành viên của họ gen APOBEC3 gây khử gốc amin của cytosine trên sợi đơn DNA (ssDNA) [11]. Nhiều nghiên cứu đã xác định một đa dạng mất đoạn APOBEC3B tồn tại trong quần thể ngƣời có tần suất alen khác nhau từ khoảng 1% đến 93%, tùy thuộc vào khu vực địa lý [31]. Đa dạng này đã đƣợc chứng minh có liên hệ với nguy cơ ung thƣ vú và đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu [15, 36, 48].

Họ gen APOBEC3 1. Đặc điểm của họ gen APOBEC3 APOBEC3 (Apolipo Protein B mRNA Editing enzyme Catalytic subunit 3) là một họ gen mã hóa cho enzyme DNA cytidine deaminase, có khả năng biến đổi các cytidine trên ssDNA và RNA thành uracil [11]. Các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh [65]. Nhiều thành viên trong họ APOBEC3 ức chế retrovirus bằng cách khử gốc amin của cytidine trên sợi RNA hoặc cDNA trung gian dẫn đến làm rối loạn thông tin di truyền của virus.

Trong đó, APOBEC3A khử 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm gốc amin đến 97% cytidine trên DNA ngoại lai mà không ảnh hƣởng đến DNA của tế bào [58]. Bên cạnh đó, enzyme APOBEC3A và APOBEC3B ức chế quá trình phiên mã ngƣợc của các yếu tố chuyển vị retrotransposon, góp phần làm ổn định hệ gen [11]. Ở ngƣời, họ gen APOBEC3 gồm 7 thành viên là APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G và APOBEC3H nằm trên nhiễm sắc thể số 22 (Hình 1. Đặc điểm họ gen APOBEC3 ở ngƣời.

Vị trí gen mã hoá cho 7 thành viên APOBEC3 (A). Các enzyme trong họ gen APOBEC3 xúc tác phản ứng khử gốc amin chuyển cytosine thành uracil trên ssDNA (B) [70]. APOBEC3A, APOBEC3C, và APOBEC3H có 1 domain zinc-dependent cytidine deaminase (ZD-CDAs - domain khử gốc amin của cytidine phụ thuộc kẽm), trong khi đó APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G có hai domain ZD-CDAs (C). Vùng hoạt động xúc tác khử gốc amin của APOBEC3 đƣợc thể hiện bằng màu xanh, vùng không hoạt động xúc tác trong một số thành viên đƣợc thể hiện bằng màu đỏ (C) [64].

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Các protein APOBEC3 đƣợc chia thành hai nhóm. Nhóm thứ nhất có bốn thành viên là APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G chứa hai domain ZD-CDAs, trong khi đó nhóm thứ hai có ba thành viên APOBEC3A, APOBEC3C và APOBEC3H chứa một domain ZD-CDAs. Mỗi domain kết hợp với kẽm thông qua motif H-X-E-X23-28-P-C-X2-4-C (motif có chức năng khử gốc amin) đƣợc bảo tồn trong các thành viên của họ gen APOBEC3. Đồng thời domain này kết hợp với glutamate hỗ trợ sự vận chuyển proton trong quá trình khử gốc amin của cytosine [35].

APOBEC3A khử gốc amin của cytosine trên cả ssDNA và mRNA, ƣu tiên làm biến đổi các cytosine đứng sau thymine (5’-TC). APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3H cũng ƣu tiên khử gốc amin của cytosine đứng sau thymine (5’-TC) nhƣng chỉ trên ssDNA; còn APOBEC3G chỉ làm biến đổi tại các cytosine trƣớc một cytosine khác (5’-CC) [28]. Họ gen APOBEC3 biểu hiện ở nhiều mô nhƣng chủ yếu biểu hiện trong các mô của hệ miễn dịch [19]. Cả bảy thành viên của họ gen biểu hiện cao ở phổi và năm thành viên (APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G) biểu hiện cao ở lá lách.

Trong đó, APOBEC3A biểu hiện mạnh nhất ở phổi và lá lách (gấp 69 lần và 15 lần so với mức biểu hiện trung bình trong 20 cơ quan của cơ thể), ngoài ra nó cũng biểu hiện mạnh ở mô mỡ và nhau thai (gấp 5,1 lần và 2,3 lần) [19]. Một số thành viên biểu hiện cao trong các cơ quan khác nhƣ APOBEC3B ở tuyến vú và tim; APOBEC3C ở bàng quang và cổ tử cung; APOBEC3D và APOBEC3H ở tuyến ức; APOBEC3F ở buồng trứng và đại tràng [10, 19]. Đặc biệt sự biểu hiện của họ gen APOBEC3 đƣợc cảm ứng bởi interferon phù hợp với vai trò của chúng là đáp ứng miễn dịch chống virus [58]. Mối liên hệ của họ gen APOBEC3 với ung thƣ Các enzyme APOBEC3 đƣợc xác định vào năm 2002 dƣới dạng các tác nhân làm đột biến DNA và ức chế virus.

Harris cùng cộng sự (2002) trong quá trình 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm nghiên cứu APOBEC1 đã phát hiện thêm hai protein APOBEC3C và APOBEC3G cung cấp những bằng chứng cho thấy chúng là tác nhân gây đột biến DNA. Ông đã quan sát số lƣợng đột biến gây ra do biểu hiện của APOBEC3C và APOBEC3G trong dòng tế bào có và không có uracil-DNA glycosylase (UDG - enzyme nhận biết và loại bỏ uracil trong mạch DNA). Kết quả là số đột biến trong dòng tế bào không có UDG tăng gấp 260 và 120 lần so với các tế bào có UDG. Không chỉ vậy, đột biến C>T do hoạt động của APOBEC3C chiếm 94% và APOBEC3G gây đột biến đến 88% tổng số đột biến của tế bào [25].

Cũng trong năm 2002, APOBEC3G đƣợc phát hiện có liên quan đến khả năng chống virus. Vif gây ubiquitin hóa dẫn đến phân hủy các protein miễn dịch của tế bào, cần thiết cho sự xâm nhiễm của virus. Tuy nhiên sự hiện diện của Vif lại làm tăng biểu hiện APOBEC3G trong tế bào [29, 56]. APOBEC3G bám vào và chỉnh sửa sợi DNA âm của virus trong quá trình phiên mã ngƣợc dẫn đến tăng đột biến và bất hoạt provirus [56].

Những nghiên cứu này mở đƣờng cho hàng loạt các thí nghiệm tiếp theo làm sáng tỏ vai trò của họ gen APOBEC3 đối với quá trình ức chế virus. Sự biểu hiện quá mức của các gen trong họ APOBEC3 làm tăng chỉnh sửa DNA và RNA có thể dẫn đến đột biến. Đột biến phát sinh trên các gen ức chế khối u có thể gây ung thƣ. Gen TP53 - một gen ức chế khối u có tần số đột biến tăng cao trong các khối u biểu hiện mạnh APOBEC3B [63].

Vì vậy, họ gen APOBEC3 đƣợc cho là các tiền gen sinh ung thƣ [39, 41]. Khi nghiên cứu trình tự gen của mẫu ung thƣ vú từ 21 bệnh nhân khác nhau, các nhà khoa học đã phát hiện đột biến kataegis (đột biến C thành T trong cặp TpC của hệ gen) xuất hiện trong hệ gen với tần số lớn. Protein APOBEC3 đƣợc cho là có liên quan tới sự hình thành đột biến kataegis vì enzyme này tác động đến cytosine [12, 40]. Steven và cộng sự (2013) nghiên cứu các đột biến trên 14 loại ung thƣ khác nhau đƣa ra kết quả có 954247 đột biến ở 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 2680 exon.

Trong đó, mRNA APOBEC3 biểu hiện cao có thể gây đột biến đến 68% tổng số đột biến [50]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hai thành viên APOBEC3A và APOBEC3B có liên hệ đến sự phát sinh ung thƣ. Thật vậy, nhóm nghiên cứu của Burn (2013) và nhóm nghiên cứu của Roberts (2013) cho thấy biểu hiện quá mức của APOBEC3B là nguồn gốc phát sinh đột biến ở các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ cổ tử cung [12, 50]. Vai trò của gen APOBEC3A và APOBEC3B trong ung thƣ APOBEC3A là một gen quan trọng liên quan đến đột biến soma trong hệ gen ngƣời [13].

Protein APOBEC3A đƣợc tìm thấy trong cả nhân và tế bào chất; vì vậy, hoạt động của protein này tác động trực tiếp đến DNA [54].