MỞ ĐẦU Ung thƣ vú là loại ung thƣ phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong các loại ung thƣ ở nữ giới. Năm 2018, trên thế giới có đến 600 nghìn ngƣời chết vì ung thƣ vú và khoảng 2,1 triệu ca ung thƣ mắc mới. Gần đây, đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B ở họ gen APOBEC3 đƣợc báo cáo là có nguy cơ gây ung thƣ vú. Đa dạng di truyền này do sự tái tổ hợp tƣơng đồng không alen dẫn đến mất đoạn khoảng 29,9 kb trải dài từ exon thứ năm của gen APOBEC3A đến exon thứ tám của gen APOBEC3B, tạo thành một gen lai APOBEC3A-APOBEC3B mang vùng mã hóa của APOBEC3A và vùng 3’- không dịch mã (3’-UTR) của APOBEC3B.
Tần suất phân bố đa dạng mất đoạn APOBEC3B dao động rất lớn giữa các khu vực khác nhau trên thế giới. Đa dạng này hiếm xảy ra ở ngƣời châu Phi và châu Âu (tần suất 0,9% và 6%), phổ biến ở Đông Á, châu Mỹ (36,9% và 57,7%) và xảy ra phần lớn ở ngƣời châu Đại Dƣơng (92,9%). Gần đây, nhiều nghiên cứu về mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn APOBEC3B với nguy cơ ung thƣ vú. Đa số nghiên cứu ở châu Âu cho thấy không có mối liên hệ giữa đa dạng mất đoạn với nguy cơ ung thƣ vú trong khi một số khu vực khác ở Đông Á, Tây Á lại cho kết quả ngƣợc lại.
Tại Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào công bố về đa dạng mất đoạn APOBE3B cũng nhƣ mối liên hệ với ung thƣ vú. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền mất đoạn APOBEC3B và nguy cơ bị ung thư vú ở người Việt Nam” nhằm cung cấp thêm số liệu về mất đoạn APOBEC3B cũng nhƣ xác định tần suất alen mất đoạn tại Việt Nam. Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Ung thƣ là một bệnh do sự tăng sinh không kiểm soát của một nhóm tế bào, trong giai đoạn phát triển, các tế bào này xâm lấn vào mô lân cận hoặc di căn đến các bộ phận khác của cơ thể [52].
Một trong các nguyên nhân phát sinh ung thƣ đƣợc nghiên cứu rất nhiều là sự tổn thƣơng DNA [24]. Nguồn gây tổn thƣơng DNA và đột biến dẫn đến ung thƣ có thể đƣợc phân chia thành ngoại sinh - phát sinh từ môi trƣờng và nội sinh - phát sinh từ bên trong cơ thể. Tác dụng của tia UV tới pyrimidine là một ví dụ điển hình về tác nhân ngoại sinh dẫn đến tạo pyrimidine dimers làm mạch DNA dễ đứt gãy [26]. Bên cạnh đó, tia UV cũng là tác nhân gây đột biến thay thế G-C thành A-T làm thay đổi thông tin di truyền [17].
Một số nguồn nội sinh đã đƣợc biết đến nhƣ quá trình oxy hóa guanine và khử gốc amin trên cytosine [2]. Năm 2002, khoa học đã đạt đƣợc những tiến bộ trong việc tìm thêm một nguồn nội sinh làm tổn thƣơng DNA có liên quan đến ung thƣ là APOBEC3B - một thành viên của họ gen APOBEC3 gây khử gốc amin của cytosine trên sợi đơn DNA (ssDNA) [11]. Nhiều nghiên cứu đã xác định một đa dạng mất đoạn APOBEC3B tồn tại trong quần thể ngƣời có tần suất alen khác nhau từ khoảng 1% đến 93%, tùy thuộc vào khu vực địa lý [31]. Đa dạng này đã đƣợc chứng minh có liên hệ với nguy cơ ung thƣ vú và đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu [15, 36, 48].
Họ gen APOBEC3 1. Đặc điểm của họ gen APOBEC3 APOBEC3 (Apolipo Protein B mRNA Editing enzyme Catalytic subunit 3) là một họ gen mã hóa cho enzyme DNA cytidine deaminase, có khả năng biến đổi các cytidine trên ssDNA và RNA thành uracil [11]. Các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch bẩm sinh [65]. Nhiều thành viên trong họ APOBEC3 ức chế retrovirus bằng cách khử gốc amin của cytidine trên sợi RNA hoặc cDNA trung gian dẫn đến làm rối loạn thông tin di truyền của virus.
Trong đó, APOBEC3A khử 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm gốc amin đến 97% cytidine trên DNA ngoại lai mà không ảnh hƣởng đến DNA của tế bào [58]. Bên cạnh đó, enzyme APOBEC3A và APOBEC3B ức chế quá trình phiên mã ngƣợc của các yếu tố chuyển vị retrotransposon, góp phần làm ổn định hệ gen [11]. Ở ngƣời, họ gen APOBEC3 gồm 7 thành viên là APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G và APOBEC3H nằm trên nhiễm sắc thể số 22 (Hình 1. Đặc điểm họ gen APOBEC3 ở ngƣời.
Vị trí gen mã hoá cho 7 thành viên APOBEC3 (A). Các enzyme trong họ gen APOBEC3 xúc tác phản ứng khử gốc amin chuyển cytosine thành uracil trên ssDNA (B) [70]. APOBEC3A, APOBEC3C, và APOBEC3H có 1 domain zinc-dependent cytidine deaminase (ZD-CDAs - domain khử gốc amin của cytidine phụ thuộc kẽm), trong khi đó APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G có hai domain ZD-CDAs (C). Vùng hoạt động xúc tác khử gốc amin của APOBEC3 đƣợc thể hiện bằng màu xanh, vùng không hoạt động xúc tác trong một số thành viên đƣợc thể hiện bằng màu đỏ (C) [64].
3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm Các protein APOBEC3 đƣợc chia thành hai nhóm. Nhóm thứ nhất có bốn thành viên là APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G chứa hai domain ZD-CDAs, trong khi đó nhóm thứ hai có ba thành viên APOBEC3A, APOBEC3C và APOBEC3H chứa một domain ZD-CDAs. Mỗi domain kết hợp với kẽm thông qua motif H-X-E-X23-28-P-C-X2-4-C (motif có chức năng khử gốc amin) đƣợc bảo tồn trong các thành viên của họ gen APOBEC3. Đồng thời domain này kết hợp với glutamate hỗ trợ sự vận chuyển proton trong quá trình khử gốc amin của cytosine [35].
APOBEC3A khử gốc amin của cytosine trên cả ssDNA và mRNA, ƣu tiên làm biến đổi các cytosine đứng sau thymine (5’-TC). APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3H cũng ƣu tiên khử gốc amin của cytosine đứng sau thymine (5’-TC) nhƣng chỉ trên ssDNA; còn APOBEC3G chỉ làm biến đổi tại các cytosine trƣớc một cytosine khác (5’-CC) [28]. Họ gen APOBEC3 biểu hiện ở nhiều mô nhƣng chủ yếu biểu hiện trong các mô của hệ miễn dịch [19]. Cả bảy thành viên của họ gen biểu hiện cao ở phổi và năm thành viên (APOBEC3A, APOBEC3B, APOBEC3D, APOBEC3F và APOBEC3G) biểu hiện cao ở lá lách.
Trong đó, APOBEC3A biểu hiện mạnh nhất ở phổi và lá lách (gấp 69 lần và 15 lần so với mức biểu hiện trung bình trong 20 cơ quan của cơ thể), ngoài ra nó cũng biểu hiện mạnh ở mô mỡ và nhau thai (gấp 5,1 lần và 2,3 lần) [19]. Một số thành viên biểu hiện cao trong các cơ quan khác nhƣ APOBEC3B ở tuyến vú và tim; APOBEC3C ở bàng quang và cổ tử cung; APOBEC3D và APOBEC3H ở tuyến ức; APOBEC3F ở buồng trứng và đại tràng [10, 19]. Đặc biệt sự biểu hiện của họ gen APOBEC3 đƣợc cảm ứng bởi interferon phù hợp với vai trò của chúng là đáp ứng miễn dịch chống virus [58]. Mối liên hệ của họ gen APOBEC3 với ung thƣ Các enzyme APOBEC3 đƣợc xác định vào năm 2002 dƣới dạng các tác nhân làm đột biến DNA và ức chế virus.
Harris cùng cộng sự (2002) trong quá trình 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm nghiên cứu APOBEC1 đã phát hiện thêm hai protein APOBEC3C và APOBEC3G cung cấp những bằng chứng cho thấy chúng là tác nhân gây đột biến DNA. Ông đã quan sát số lƣợng đột biến gây ra do biểu hiện của APOBEC3C và APOBEC3G trong dòng tế bào có và không có uracil-DNA glycosylase (UDG - enzyme nhận biết và loại bỏ uracil trong mạch DNA). Kết quả là số đột biến trong dòng tế bào không có UDG tăng gấp 260 và 120 lần so với các tế bào có UDG. Không chỉ vậy, đột biến C>T do hoạt động của APOBEC3C chiếm 94% và APOBEC3G gây đột biến đến 88% tổng số đột biến của tế bào [25].
Cũng trong năm 2002, APOBEC3G đƣợc phát hiện có liên quan đến khả năng chống virus. Vif gây ubiquitin hóa dẫn đến phân hủy các protein miễn dịch của tế bào, cần thiết cho sự xâm nhiễm của virus. Tuy nhiên sự hiện diện của Vif lại làm tăng biểu hiện APOBEC3G trong tế bào [29, 56]. APOBEC3G bám vào và chỉnh sửa sợi DNA âm của virus trong quá trình phiên mã ngƣợc dẫn đến tăng đột biến và bất hoạt provirus [56].
Những nghiên cứu này mở đƣờng cho hàng loạt các thí nghiệm tiếp theo làm sáng tỏ vai trò của họ gen APOBEC3 đối với quá trình ức chế virus. Sự biểu hiện quá mức của các gen trong họ APOBEC3 làm tăng chỉnh sửa DNA và RNA có thể dẫn đến đột biến. Đột biến phát sinh trên các gen ức chế khối u có thể gây ung thƣ. Gen TP53 - một gen ức chế khối u có tần số đột biến tăng cao trong các khối u biểu hiện mạnh APOBEC3B [63].
Vì vậy, họ gen APOBEC3 đƣợc cho là các tiền gen sinh ung thƣ [39, 41]. Khi nghiên cứu trình tự gen của mẫu ung thƣ vú từ 21 bệnh nhân khác nhau, các nhà khoa học đã phát hiện đột biến kataegis (đột biến C thành T trong cặp TpC của hệ gen) xuất hiện trong hệ gen với tần số lớn. Protein APOBEC3 đƣợc cho là có liên quan tới sự hình thành đột biến kataegis vì enzyme này tác động đến cytosine [12, 40]. Steven và cộng sự (2013) nghiên cứu các đột biến trên 14 loại ung thƣ khác nhau đƣa ra kết quả có 954247 đột biến ở 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khoa học Bùi Thị Thu Anh K25-Sinh học thực nghiệm 2680 exon.
Trong đó, mRNA APOBEC3 biểu hiện cao có thể gây đột biến đến 68% tổng số đột biến [50]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hai thành viên APOBEC3A và APOBEC3B có liên hệ đến sự phát sinh ung thƣ. Thật vậy, nhóm nghiên cứu của Burn (2013) và nhóm nghiên cứu của Roberts (2013) cho thấy biểu hiện quá mức của APOBEC3B là nguồn gốc phát sinh đột biến ở các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ phổi, ung thƣ cổ tử cung [12, 50]. Vai trò của gen APOBEC3A và APOBEC3B trong ung thƣ APOBEC3A là một gen quan trọng liên quan đến đột biến soma trong hệ gen ngƣời [13].
Protein APOBEC3A đƣợc tìm thấy trong cả nhân và tế bào chất; vì vậy, hoạt động của protein này tác động trực tiếp đến DNA [54].