Phân Tích Biến Đổi Gen CXCL12 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng

Luận văn thạc sĩ phân tích biến đổi gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế bệnh lý và tiềm năng điều trị.

• Tác giả: Phạm Thị Bích
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Hồng Thái
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân Tích Biến Đổi Của Gen CXCL12 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.1.1. Khái quát về ung thư
• 1.1.2. Ung thư đại trực tràng là gì
• 1.1.3. Các tác nhân gây ung thư đại trực tràng
• 1.1.4. Các hệ thống phân giai đoạn ung thư đại trực tràng
• 1.2. CHỈ THỊ SINH HỌC TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.2.1. Chỉ thị sinh học là gì
• 1.2.2. Một số biến đổi về gen liên quan đến ung thư đại trực tràng
• 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH UNG THƯ
• 1.4. CHEMOKINE CXCL12 VÀ VAI TRÒ TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.4.1. Chemokine CXCL12 và thụ thể của nó CXCR4
• 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH VÀ METHYL HÓA GEN CXCL12 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô
• 2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ máu
• 2.1.3. Khuếch đại gen CXCL12 bằng phương pháp PCR
• 2.1.4. Phân tích RFLP
• 2.1.5. Khuếch đại vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
• 2.1.6. Điện di kiểm tra sản phẩm
• 2.1.7. Kỹ thuật nhuộm bạc
• 2.1.8. Dự đoán vùng promoter và xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12
• 2.1.9. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH PCR - RFLP
• 3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
• 3.1.2. Kết quả khuếch đại đoạn gen CXCL12 bằng PCR
• 3.1.3. Kết quả phân tích RFLP
• 3.1.4. Phân tích số liệu bằng phương pháp thống kê
• 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÌNH TRẠNG METHYL HÓA GEN CXCL12
• 3.2.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô
• 3.2.2. Kết quả xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã của gen CXCL12
• 3.2.3. Khuếch đại đoạn trình tự nằm trong đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12 bằng kỹ thuật MSP
• 3.2.4. Phân tích tình trạng methyl hóa vùng promoter của gen CXCL12 ở bệnh ung thư đại trực tràng
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 3
• PHỤ LỤC 4
• PHỤ LỤC 5

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Biến Đổi Gen CXCL12 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Đại Trực Tràng

Biến đổi gen CXCL12 đã trở thành một chủ đề quan trọng trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng. Gen CXCL12, còn được gọi là CXC ligand 12, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự di chuyển của tế bào miễn dịch và có liên quan đến sự phát triển của khối u. Nghiên cứu về biến đổi gen này có thể giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý và tìm ra các chỉ thị sinh học mới cho việc chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng.

1.1. CXCL12 và Vai Trò Trong Ung Thư Đại Trực Tràng

CXCL12 là một chemokine có vai trò quan trọng trong việc thu hút tế bào miễn dịch đến vị trí khối u. Sự thay đổi trong biểu hiện của CXCL12 có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và di căn của ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu cho thấy rằng mức độ biểu hiện của CXCL12 có thể liên quan đến giai đoạn bệnh và tiên lượng sống sót của bệnh nhân.

1.2. Tình Trạng Biến Đổi Gen CXCL12 Ở Bệnh Nhân

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có sự biến đổi gen CXCL12 ở nhiều bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Các biến đổi này có thể bao gồm đột biến điểm, thay đổi trong cấu trúc gen và tình trạng methyl hóa. Những biến đổi này có thể ảnh hưởng đến chức năng của CXCL12 và góp phần vào sự phát triển của khối u.

II. Vấn Đề và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Biến Đổi Gen CXCL12

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về biến đổi gen CXCL12, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định mối liên hệ giữa các biến đổi này và sự phát triển của ung thư đại trực tràng. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng di truyền giữa các bệnh nhân, điều này có thể làm khó khăn trong việc tìm ra các chỉ thị sinh học chính xác.

2.1. Đa Dạng Di Truyền Ở Bệnh Nhân Ung Thư

Mỗi bệnh nhân có thể có các biến đổi gen khác nhau, điều này tạo ra sự khó khăn trong việc xác định các chỉ thị sinh học chung cho ung thư đại trực tràng. Sự đa dạng này có thể ảnh hưởng đến cách mà bệnh nhân phản ứng với điều trị và tiên lượng bệnh.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Phát Triển Chỉ Thị Sinh Học

Việc phát triển các chỉ thị sinh học dựa trên biến đổi gen CXCL12 gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp trong cơ chế bệnh lý của ung thư đại trực tràng. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ ràng mối liên hệ giữa biến đổi gen và sự phát triển của bệnh.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Biến Đổi Gen CXCL12

Để phân tích biến đổi gen CXCL12, nhiều phương pháp nghiên cứu đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm tách chiết ADN, khuếch đại gen bằng PCR, và phân tích tình trạng methyl hóa. Những phương pháp này giúp xác định các biến đổi gen và đánh giá mối liên hệ với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân.

3.1. Kỹ Thuật Tách Chiết ADN Từ Mô

Kỹ thuật tách chiết ADN từ mô là bước đầu tiên trong nghiên cứu biến đổi gen CXCL12. Việc tách chiết ADN chất lượng cao là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác trong các phân tích tiếp theo.

3.2. Phân Tích Tình Trạng Methyl Hóa Gen CXCL12

Phân tích tình trạng methyl hóa của gen CXCL12 giúp xác định các biến đổi trong vùng promoter của gen này. Tình trạng methyl hóa có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen và do đó có thể liên quan đến sự phát triển của ung thư.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Biến Đổi Gen CXCL12

Nghiên cứu về biến đổi gen CXCL12 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý mà còn có thể ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới cho ung thư đại trực tràng. Các chỉ thị sinh học mới có thể giúp phát hiện bệnh sớm hơn và cải thiện hiệu quả điều trị.

4.1. Chẩn Đoán Sớm Ung Thư Đại Trực Tràng

Các chỉ thị sinh học dựa trên biến đổi gen CXCL12 có thể giúp phát hiện ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm, từ đó nâng cao tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Việc phát hiện sớm có thể giúp điều trị kịp thời và hiệu quả hơn.

4.2. Phát Triển Phương Pháp Điều Trị Mới

Nghiên cứu về CXCL12 có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp điều trị mới, nhắm vào các cơ chế sinh học cụ thể liên quan đến ung thư đại trực tràng. Điều này có thể mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Biến Đổi Gen CXCL12

Nghiên cứu về biến đổi gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng đang mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế và ứng dụng thực tiễn của các biến đổi này.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về CXCL12 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về ung thư đại trực tràng mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại ung thư khác. Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nghiên cứu gen trong y học.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Hướng nghiên cứu tương lai cần tập trung vào việc phát triển các chỉ thị sinh học mới và cải thiện các phương pháp điều trị dựa trên biến đổi gen CXCL12. Điều này có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thƣ trực tràng là bệnh lý hay gặp trong ung thƣ đƣờng tiêu hóa, đứng hàng thứ hai sau ung thƣ dạ dày và chiếm 1,4 % trong tổng số ung thƣ. Bệnh tiến triển tƣơng đối chậm, di căn muộn, nếu phát hiện sớm, điều trị kịp thời và triệt để thì tỷ lệ sống trên 5 năm đạt 60-80% [26]. Tuy nhiên bệnh thƣờng đƣợc phát hiện ở giai đoạn muộn khi đã di căn hay biến chứng, do đó hiệu quả điều trị rất hạn chế. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 650.000 ngƣời đƣợc chẩn đoán mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng và có khoảng 150.000 ngƣời chết vì căn bệnh này, đây là loại ung thƣ nguy hiểm đứng hàng thứ ba gây tử vong trên thế giới và đứng hàng thứ hai gây ra tử vong tại Mỹ.

Tại Việt Nam, bệnh này chiếm khoảng 15% trong số các loại ung thƣ và đang gia tăng một cách rõ rệt. Gần đây, do sự thay đổi trong thói quen ăn uống giàu chất đạm, ít chất xơ, lạm dụng thức ăn nhanh khiến ung thƣ đại trực tràng ngày càng phổ biến. Tuổi mắc căn bệnh chết ngƣời này ngày càng trẻ hóa, nhiều trƣờng hợp mới 18 - 20 tuổi, thậm chí có trẻ mới 12 đã mắc ung thƣ đại trực tràng [30]. Trên thế giới ung thƣ đại trực tràng luôn đƣợc các nhà sinh y học quan tâm, có nhiều nghiên cứu genomics, transcriptomics, proteomics đã đƣợc tiến hành.

Mục tiêu của những nghiên cứu này nhằm tìm ra những chỉ thị sinh học cho việc chẩn đoán bệnh sớm hơn để điều trị kịp thời. Tuy nhiên, đến nay, mới chỉ có carcinoembryonic antigen (CEA) là chỉ thị sinh học thƣờng dùng cho chẩn đoán bệnh cho các bệnh nhân trong giai đoạn III, IV, nhƣng chi phí cho xét nghiệm còn rất tốn kém[38].Vì vậy, việc tìm ra những chỉ thị mới dễ nhận biết và có thể phát hiện chính xác giai đoạn ung thƣ là cần thiết. Genomics và proteomics là những lĩnh vực nghiên cứu cho phép xác định các chỉ thị đặc trƣng cho bệnh, phục vụ cho công tác chẩn đoán, điều trị và tìm nguyên nhân bệnh. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích biến đổi của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng”, nhằm mục tiêu: 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 1.

Nghiên cứu đa hình gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng: - Xác định đƣợc tính đa hình của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng, so sánh với các mẫu đối chứng. - Đánh giá mức độ liên quan giữa tính đa hình của gen CXCL12 với các đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thƣ đại trực tràng ở Việt Nam. Phân tích tình trạng methyl hóa promoter của gen CXCL12 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng: - Xác định đƣợc sự phân bố của đảo CpG và mật độ nucleotide CpG trong các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12. - Xác định đƣợc tình trạng methyl hóa của 1 đảo CpG thuộc vùng promoter của gen CXCL12.

- Đánh giá mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa gen CXCL12 với các đặc điểm bệnh học lâm sàng của ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời Việt Nam. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TÌM HIỂU VỀ UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.

Khái quát về ung thƣ Ung thƣ (u ác tính) là một loại bệnh của các tế bào, biểu hiện là sự phát triển không bình thƣờng của các tế bào, tăng sinh nhanh chóng về số lƣợng một cách không kiểm soát đƣợc và tế bào không tuân theo các cơ chế kiểm soát và phát triển của cơ thể [33]. Trong một số trƣờng hợp, chúng di căn (lan tràn tới các cơ quan ở xa) (bảng 1). Phân biệt hai khái niệm u lành tính và ung thƣ theo đặc điểm sinh bệnh học U lành tính U ác tính (ung thƣ) - Tế bào ít biệt hóa - Tế bào biệt hóa cao - Phân bào nhanh, không tuân theo sự kiểm - Phân bào ít và chậm soát của chu trình tế bào - Không xâm lấn xung quanh - Xâm lấn xung quanh - Có vỏ bọc - Không có vỏ bọc - Không hoại tử - Thƣờng hoại tử - Rất ít tái phát và ít ảnh hƣởng tới cơ thể - Ảnh hƣởng lớn tới cơ thể Ung thƣ không phải là một bệnh. Bệnh này là một nhóm của hơn 100 bệnh khác nhau.

Ung thƣ có thể có nguồn gốc từ bất cứ tế bào nào của cơ thể và có rất nhiều loại khác nhau trong mỗi vùng của cơ thể. Hầu hết các bệnh ung thƣ đƣợc đặt tên theo loại tế bào hoặc cơ quan nơi chúng phát sinh. Nếu một khối ung thƣ lan rộng ra (di căn), thì khối u mới mang tên giống với tên của khối u nguồn gốc đầu tiên [33]. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học 1.

Ung thƣ đại trực tràng là gì Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) là căn bệnh phổ biến, đứng hàng đầu trong ung thƣ đƣờng tiêu hóa tại các nƣớc Âu Mỹ. Tại Việt Nam và các nƣớc châu Á, UTĐTT đứng thứ hai trong ung thƣ đƣờng tiêu hóa sau ung thƣ dạ dày. Ở nƣớc ta, mỗi năm có khoảng hơn 7.300 ngƣời mới mắc và hơn 4.100 ngƣời tử vong do ung thƣ đại trực tràng [34]. Ung thƣ đại trực tràng là ung thƣ biểu mô phổ biến hiện nay, bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng.

Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N gồm đoạn lên, đoạn ngang và đoạn xuống. Trực tràng là phần ruột thẳng nối giữa đại tràng và hậu môn. Ung thƣ thƣờng xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng (hình 1). Ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng thƣờng có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thƣ nào xảy ra trƣớc, ung thƣ nào xảy ra sau, vì thế chúng đƣợc gọi chung là ung thƣ đại trực tràng [35].

Hình ảnh đại trực tràng và polyp đại tràng nội soi [35] 1. Các tác nhân gây ung thƣ đại trực tràng Các loại ung thƣ khác nhau có tác nhân gây bệnh khác nhau. Trong ung thƣ đại trực tràng thì có rất nhiều tác nhân và các nghiên cứu cho thấy các tác nhân sau đây có thể gây nguy cơ bị bệnh ung thƣ đại trực tràng: 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học  Polyp đại trực tràng là bệnh khá thƣờng gặp, đây là những khối u lồi vào trong lòng đại trực tràng, chúng đƣợc hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm mạc đại trực tràng. Triệu chứng của bệnh thƣờng nghèo nàn và không đặc hiệu.

Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời, đặc biệt nếu xác định rõ và loại bỏ những polyp bằng thủ thuật cắt polyp qua nội soi sẽ làm giảm thiểu đáng kể nguy cơ polyp trở thành ung thƣ.  Tác nhân lối sống: Những ngƣời có thói quen hút thuốc, hoặc có chế độ ăn uống giàu chất mỡ và ít trái cây, rau quả sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng cao hơn vì nó có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng, gây viêm loét đại tràng và từ đó có thể dẫn tới ung thƣ đại trực tràng.  Bệnh Crohn hoặc chứng lở ruột già: Ngƣời bị chứng bệnh gây viêm đại tràng (nhƣ chứng lở ruột già hoặc bệnh Crohn) trong nhiều năm sẽ có nguy cơ mắc bệnh cao.  Bệnh sử ung thư cá nhân: Ngƣời từng bị ung thƣ đại trực tràng có thể sẽ lại bị ung thƣ đại trực tràng lần thứ hai.

Đồng thời, phụ nữ có tiền sử ung thƣ buồng trứng, dạ con, hoặc ung thƣ vú, sẽ có nguy cơ mắc bệnh ung thƣ đại trực tràng cao hơn.  Bệnh sử ung thư trong gia đình: Trong khi phần lớn các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng là các khối u rời rạc thì có rất ít các trƣờng hợp xảy ra do đột biến gen di truyền. Phổ biến nhất là hội chứng polyp u tuyến theo dòng họ (familial adenomatous polyposis - FAP) và hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (hereditary nonpolyposis colon cancer - HNPCC). Dạng ung thƣ này thƣờng biểu hiện từ rất sớm (trung bình dƣới 45 tuổi) [20].

Khối u FAP chủ yếu nằm ở vùng ngoại biên (bên trái) trong khi HNPCC chủ yếu nằm ở vùng đầu gần (bên phải) của đại tràng. Khi có thành viên trong gia đình đƣợc chẩn đoán là mắc ung thƣ đại trực tràng thì nguy cơ các thành viên khác mắc căn bệnh này cao gấp nhiều lần so với bình thƣờng, phụ thuộc nhiều vào số thành 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn cao học Phạm Thị Bích – K18 Sinh học viên mắc bệnh và độ tuổi mắc bệnh. Thực tế, các nghiên cứu cho thấy phải có tới 20 đến 25% các bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng có tiền sử gia đình mắc căn bệnh này. Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thƣ đại trực tràng [39] Phân loại Duke cho ung thƣ trực tràng Năm 1932, Cuthbert E.

Dukes, một bác sĩ giải phẫu bệnh ở bệnh viện St.Mark, đã đƣa ra một hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thƣ trực tràng. Phân loại đƣợc chia làm 3 giai đoạn: - Dukes A: khối u giới hạn ở thành trực tràng. - Dukes B: những khối u đã vƣợt thành trực tràng đến những cơ quan cạnh trực tràng. - Dukes C: những khối u đã di căn đến hạch lympho vùng.

Phân loại TNM (Tumor, Node, Metastasis) Phân loại này đƣợc đƣa ra vào năm 1954 bởi AJCC (American Joint Committee on Cancer) và IUAC (International Union Against Cancer) dựa trên những dữ kiện lâm sàng và bệnh học. Phân loại TNM thƣờng dùng để dự báo tỉ lệ sống sót 5 năm của bệnh nhân ung thƣ trực tràng. Phân loại TNM cho ung thƣ đại trực tràng U nguyên phát (T): Tx – không xác định đƣợc u. T0 – không có bằng chứng của khối u.

Tis – u tại chỗ (niêm mạc). T1 – u xâm lấn lớp dƣới niêm mạc. T2 – u xâm lấn thanh mạc. T3 – u xuyên qua thanh mạc vào lớp dƣới thanh mạc hoặc vào các mô xung quanh đại tràng hay trực tràng.

T4 – U xâm lấn trực tiếp các cơ quan khác hoặc xuyên vào lớp phúc mạc tạng. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.