Tính đa dạng của hệ vi khuẩn và mối liên quan giữa tình trạng nhiễm một số chủng vi khuẩn đường tiêu hoá với ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường ruột và ung thư đại trực tràng, khám phá đa dạng vi sinh vật và ảnh hưởng đến sức khỏe.

• Tác giả: Nguyễn Duy Trường
• Người hướng dẫn: Gs. Lê Hữu Song
• Trường học: Viện Nghiên Cứu Khoa Học Y Dược Lâm Sàng 108
• Chuyên ngành: Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới
• Đề tài: Tính Đa Dạng Của Hệ Vi Khuẩn Và Mối Liên Quan Giữa Tình Trạng Nhiễm Một Số Chủng Vi Khuẩn Đường Tiêu Hoá Với Ung Thư Đại Trực Tràng
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG
• 3.2. TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN TẠI MÔ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG, MÔ GAN VÀ HẠCH DI CĂN
• 3.3. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG NHIỄM F. FRAGILIS VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 4. BÀN LUẬN
• 4.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG
• 4.2. TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN TẠI MÔ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG, MÔ GAN VÀ HẠCH DI CĂN
• 4.3. MỐI LIÊN QUAN GIỮA F. NUCLEATUM VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 4.4. MỐI LIÊN QUAN GIỮA B. FRAGILIS VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 4.5. MỐI LIÊN QUAN GIỮA TÌNH TRẠNG ĐỒNG NHIỄM F. FRAGILIS VỚI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
• 4.6. NHỮNG ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hệ Vi Khuẩn và Ung Thư Đại Trực Tràng

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên toàn thế giới. Theo GLOBOCAN 2020, UTĐTT đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc mới và thứ 2 về tỷ lệ tử vong do ung thư. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng hàng thứ 5 về tỷ lệ mắc mới và tử vong. Quá trình sinh bệnh của UTĐTT trải qua nhiều giai đoạn, xuất phát từ các tế bào biểu mô đại trực tràng lành tính. Hiện nay đã xác định được yếu tố di truyền và yếu tố môi trường góp phần vào sự phát triển của UTĐTT. Các tác nhân truyền nhiễm có liên quan tới khoảng 15 - 20% các loại ung thư, trong đó có UTĐTT. Hệ vi sinh vật đường ruột có vai trò quan trọng, với số lượng vi khuẩn trong đại tràng cao gấp khoảng một triệu lần so với ruột non và tỷ lệ UTĐTT cao gấp 12 lần ung thư ruột non.

1.1. Dịch Tễ Học Ung Thư Đại Trực Tràng Toàn Cầu và Tại Việt Nam

Theo GLOBOCAN 2020, UTĐTT đóng góp khoảng 10% số ca mắc mới và 9,4% số ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới. Tỷ lệ mắc và tử vong khác nhau đáng kể giữa các quốc gia. Tại Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 về tỷ lệ mắc mới và tử vong. Số lượng người tử vong do UTĐTT là 8524 người, chiếm khoảng 6,9%, đứng hàng thứ năm. Việc hiểu rõ dịch tễ học giúp định hướng các nghiên cứu và biện pháp phòng ngừa.

1.2. Mối Liên Quan Giữa Nhiễm Khuẩn và Ung Thư Đại Trực Tràng

Các tác nhân truyền nhiễm có liên quan tới khoảng 15-20% các loại ung thư, bao gồm UTĐTT. Vi khuẩn đường tiêu hoá là nguyên nhân chính gây viêm đại tràng và liên quan đến sự tiến triển của UTĐTT. Microbiome đường ruột có thể ảnh hưởng đến sự phát triển, tồn tại, xâm lấn và di căn của tế bào UTĐTT. Nghiên cứu tập trung vào các chủng vi khuẩn như Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) và Bacteroides fragilis (B. fragilis).

II. Thách Thức Đa Dạng Vi Sinh Vật và Cơ Chế Sinh Ung Thư ĐTTràng

UTĐTT phát triển từ các tế bào biểu mô lành tính, trải qua quá trình nhiều bước để chuyển thành kiểu hình ác tính. Fearon và Vogelstein đề xuất mô hình biến đổi gen nhiều bước trong cơ chế bệnh sinh UTĐTT. Đa dạng vi sinh vật trong đại tràng có thể thúc đẩy hoặc ức chế sự phát triển ung thư. Vai trò của vi môi trường khối u rất quan trọng trong sự phát triển, tồn tại, xâm lấn và di căn của tế bào UTĐTT. Hiểu rõ cơ chế này giúp phát triển các phương pháp điều trị nhắm mục tiêu vào vi khuẩn.

2.1. Mô Hình Biến Đổi Gen trong Ung Thư Đại Trực Tràng

Mô hình của Fearon và Vogelstein cho thấy UTĐTT phát triển qua nhiều bước, bắt đầu từ bất hoạt gen APC, sau đó là đột biến gen KRAS, DCC và p53. Các đột biến này dẫn đến tăng sinh tế bào và hình thành khối u. Phiên bản mô hình này vẫn được chấp nhận rộng rãi và được coi là mô hình mẫu phát sinh u đặc.

2.2. Vai Trò Của Vi Môi Trường Khối U và Hệ Vi Khuẩn

Vi môi trường khối u đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của UTĐTT. Hệ vi khuẩn tại khối u có thể hình thành đáp ứng miễn dịch tại chỗ, ảnh hưởng đến tiến triển của UTĐTT. Hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò khác nhau trong miễn dịch chống lại khối u, có thể tăng hoặc giảm đáp ứng miễn dịch kháng khối u.

2.3. Đặc Điểm Hệ Vi Khuẩn Tại Tổ Chức U và Tổ Chức Di Căn

Hệ vi khuẩn tại mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn bao gồm các vi khuẩn nội bào đặc hiệu cho từng loại khối u khác nhau. Vi khuẩn đường ruột và ung thư đang được nghiên cứu để xác định các dấu ấn sinh học và mục tiêu điều trị tiềm năng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu 16S rRNA về Hệ Vi Khuẩn Đường Ruột

Kỹ thuật 16S rRNA metagenomics là một phương pháp mạnh mẽ để nghiên cứu tính đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật này để xác định thành phần và cấu trúc của hệ vi khuẩn trong các mẫu mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn. Xét nghiệm hệ vi sinh vật đường ruột giúp phát hiện các loài vi khuẩn khác nhau và đánh giá sự khác biệt giữa các nhóm bệnh nhân.

3.1. Ứng Dụng Metagenomics trong Nghiên Cứu Ung Thư Đại Trực Tràng

16S rRNA metagenomics đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường tiêu hoá và UTĐTT trên thế giới. Nghiên cứu này cũng áp dụng kỹ thuật này để đánh giá tính đa dạng hệ vi khuẩn tại Việt Nam. Phân tích hệ vi sinh vật cung cấp thông tin quan trọng về vai trò của vi khuẩn trong bệnh ung thư.

3.2. Quy Trình Kỹ Thuật 16S rRNA Metagenomics

Kỹ thuật bao gồm các bước: thu thập mẫu, chiết xuất DNA, khuếch đại vùng 16S rRNA, giải trình tự DNA và phân tích dữ liệu. Phân tích dữ liệu giúp xác định thành phần loài, đánh giá tính đa dạng sinh học và tìm kiếm các dấu ấn sinh học tiềm năng. Ứng dụng kỹ thuật cao mang lại cái nhìn sâu sắc về hệ vi sinh vật đường ruột.

3.3. Các Chỉ Số Đa Dạng Sinh Học Alpha và Beta

Chỉ số alpha (Alpha diversity) giúp đo lường sự phong phú và đồng đều của các loài vi khuẩn trong một mẫu đơn lẻ. Chỉ số beta (Beta diversity) so sánh sự khác biệt về thành phần vi khuẩn giữa các nhóm mẫu khác nhau. Phân tích đa dạng vi sinh cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc cộng đồng vi khuẩn.

IV. Liên Quan Giữa F

F. nucleatum và B. fragilis là hai loài vi khuẩn được quan tâm đặc biệt trong nghiên cứu UTĐTT. F. nucleatum có thể thúc đẩy sự phát triển của ung thư thông qua nhiều cơ chế, bao gồm tăng sinh tế bào ung thư và tạo ra vi môi trường tiền viêm. B. fragilis có thể gây tổn thương biểu mô ruột và kích hoạt phản ứng viêm. Mối liên quan hệ vi khuẩn và ung thư đang được khám phá để tìm ra các phương pháp điều trị mới.

4.1. Cơ Chế Tác Động Của F. nucleatum lên Ung Thư Đại Trực Tràng

F. nucleatum có thể tăng sinh có chọn lọc dòng tế bào UTĐTT, giúp tế bào ung thư không bị tiêu diệt bởi tế bào NK và tế bào lympho T, tạo ra vi môi trường tiền viêm tại khối u và thúc đẩy quá trình kháng trị với hoá chất. F. nucleatum có yếu tố kết dính FadA, nồng độ của FadA trong mô đại trực tràng cao hơn so với người khỏe mạnh. Đo tải lượng của F. nucleatum có thể có giá trị trong tiên lượng và theo dõi điều trị.

4.2. Vai Trò Của B. fragilis Trong Tiến Triển Ung Thư Đại Trực Tràng

B. fragilis có khả năng xuyên qua lớp chất nhầy của ruột và hình thành màng sinh học trên bề mặt biểu mô đường ruột. B. fragilis sinh ra độc tố fragilysin làm tổn thương biểu mô ruột thông qua sự phân cắt E-cadherin. Sự phân cắt E-cadherin làm tăng nồng độ β-catenin trong tế bào chất giúp hoạt hoá con đường tín hiệu NF-kB và STAT3 làm tăng sinh tế bào biểu mô. Cơ chế tác động của vi khuẩn lên ung thư là một lĩnh vực nghiên cứu đầy hứa hẹn.

4.3. Tình Trạng Đồng Nhiễm F. fragilis và Ung Thư Đại Trực Tràng

Việc đồng nhiễm F. fragilis và các vi khuẩn khác có thể ảnh hưởng đến tiến triển của ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu tập trung vào tỷ lệ phát hiện đồng nhiễm và mối liên quan với giai đoạn bệnh. Mối tương tác giữa các vi khuẩn có thể đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển ung thư.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Đa Dạng Vi Khuẩn và Yếu Tố Nguy Cơ UTĐTràng

Nghiên cứu đã xác định được sự đa dạng của hệ vi khuẩn đường ruột trong các mẫu mô UTĐTT, mô gan và hạch di căn. Kết quả cho thấy có sự khác biệt đáng kể về thành phần vi khuẩn giữa các nhóm mẫu. Nghiên cứu lâm sàng ung thư cung cấp thông tin quan trọng về mối liên quan giữa vi khuẩn và giai đoạn bệnh. Yếu tố nguy cơ khác cũng được xác định.

5.1. Đặc Điểm Tuổi Giới và Vị Trí U Liên Quan Đến Nhiễm Khuẩn

Phân tích mối liên quan giữa tuổi, giới, vị trí u và tình trạng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis giúp xác định các yếu tố nguy cơ tiềm năng. Kết quả có thể khác nhau giữa các chủng tộc và nhóm dân số khác nhau. Yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng bao gồm cả yếu tố vi sinh vật.

5.2. Tải Lượng Tương Đối Của Vi Khuẩn Trong Mẫu Mô Ung Thư

Đo tải lượng tương đối của F. nucleatum và B. fragilis trong các mẫu mô UTĐTT và polyp đại trực tràng giúp đánh giá mức độ nhiễm khuẩn. Tải lượng vi khuẩn có thể liên quan đến giai đoạn bệnh và tiên lượng. Dấu ấn sinh học ung thư đại trực tràng có thể được phát hiện thông qua phân tích tải lượng vi khuẩn.

5.3. Đặc Điểm Mô Bệnh Học và Giai Đoạn Bệnh

Nghiên cứu cũng phân tích đặc điểm mô bệnh học của bệnh nhân ung thư đại trực tràng để đánh giá mối tương quan giữa vi khuẩn và các yếu tố bệnh học. Phân tích sâu hơn về giai đoạn bệnh giúp xác định khả năng ứng dụng lâm sàng của nghiên cứu.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Hệ Vi Khuẩn và Điều Trị UTĐTràng

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về mối liên quan giữa hệ vi khuẩn đường ruột và UTĐTT. Kết quả cho thấy F. nucleatum và B. fragilis có thể đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của bệnh. Điều trị ung thư đại trực tràng có thể được cải thiện bằng cách nhắm mục tiêu vào hệ vi khuẩn. Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc xác định các phương pháp điều trị mới.

6.1. Ứng Dụng Probiotics và Prebiotics Trong Phòng Ngừa UTĐTràng

Việc sử dụng probiotics và prebiotics có thể giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột và giảm nguy cơ UTĐTT. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các chủng vi khuẩn có lợi và liều lượng hiệu quả. Phòng ngừa ung thư đại trực tràng có thể bao gồm điều chỉnh chế độ ăn uống.

6.2. Cấy Ghép Phân và Điều Trị Ung Thư Đại Trực Tràng

Cấy ghép phân có thể giúp khôi phục sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột và cải thiện đáp ứng điều trị UTĐTT. Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các bệnh nhân phù hợp và quy trình an toàn. Cấy ghép phân là một phương pháp điều trị tiềm năng.

6.3. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Hệ Vi Khuẩn và UTĐTràng

Nghiên cứu cần tập trung vào việc xác định các cơ chế phân tử mà vi khuẩn ảnh hưởng đến sự phát triển của UTĐTT. Nghiên cứu về hệ vi khuẩn đường ruột cần mở rộng để tìm ra các phương pháp điều trị và phòng ngừa mới.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu về hệ vi sinh vật học (microbiome) trong vi môi trường khối u đại trực tràng đang định hình lại mô hình bệnh sinh ung thư học hiện đại. Báo cáo của Tổ chức Ghi nhận Ung thư Toàn cầu (GLOBOCAN 2020) chỉ ra rằng ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là gánh nặng y tế nghiêm trọng trên phạm vi toàn cầu khi đứng thứ 3 về tỷ lệ mắc mới (xấp xỉ 1,93 triệu ca, chiếm 10,0%) và đứng thứ 2 về tỷ lệ tử vong (khoảng 0,94 triệu ca, chiếm 9,4%). Tại Việt Nam, UTĐTT xếp thứ 5 về cả tỷ lệ mắc mới (16.426 ca) và số ca tử vong (8.524 ca), phản ánh nhu cầu bức thiết trong việc phát hiện sớm và can thiệp điều trị chuẩn xác. Luận án Tiến sĩ Y học của Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Trường, thực hiện tại Viện Nghiên cứu Khoa học Y Dược Lâm sàng 108 / Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 dưới sự hướng dẫn của GS. Lê Hữu Song và TS. Ngô Tất Trung (Chuyên ngành: Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới, Mã số: 9720109), là công trình tiên phong tại Việt Nam tích hợp công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới 16S rRNA metagenomics và kỹ thuật định lượng Realtime PCR nhằm giải mã đặc điểm hệ vi khuẩn nội u và vai trò sinh bệnh học của hai tác nhân vi khuẩn trọng yếu: Fusobacterium nucleatum và Bacteroides fragilis.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) mà luận án giải quyết bắt nguồn từ thực tế rằng phần lớn các dữ liệu vi sinh khối u hiện nay được thu thập trên các quần thể bệnh nhân Âu - Mỹ hoặc Đông Á phát triển (Nakatsu et al., 2015; Bullman et al., 2017; Mima et al., 2016), vốn có sự dị biệt lớn về yếu tố nhân khẩu học, lối sống, chế độ dinh dưỡng và nền tảng di truyền miễn dịch so với quần thể người Việt Nam. Hơn nữa, y văn trong nước chưa từng có nghiên cứu ghép cặp đồng thời đa vị trí giải phẫu bao gồm: mô khối u đại trực tràng nguyên phát (FCD), mô niêm mạc lành cạnh u, mô gan di căn (FCG) và mô hạch di căn (FCH) để đánh giá tính đa dạng vi sinh và xác định sự lưu tồn của các vi khuẩn ung thư di căn.

Mục tiêu nghiên cứu và các giả thuyết khoa học được xác định cụ thể:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Thành phần phân loại (taxonomic profiling), chỉ số đa dạng sinh học alpha (Shannon, Simpson, Chao1) và khoảng cách beta diversity của hệ vi khuẩn nội u biến đổi như thế nào giữa mô UTĐTT, mô lành cạnh u và các mô di căn (gan, hạch)?
   • Giả thuyết 1 (H1): Mô UTĐTT và mô di căn biểu hiện tình trạng mất cân bằng vi sinh (dysbiosis) rõ rệt, đặc trưng bởi sự suy giảm đa dạng loài và sự thống trị của các vi khuẩn kỵ khí sinh viêm thuộc ngành Fusobacteriota và Bacteroidota.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Tỷ lệ hiện diện và tải lượng tương đối (Relative Quantification - RQ) của F. nucleatum và B. fragilis liên quan như thế nào đến vị trí giải phẫu khối u, nồng độ CEA huyết tương, giai đoạn bệnh (AJCC/WHO 2019) và nguy cơ hình thành khối u ác tính?
   • Giả thuyết 2 (H2): Tải lượng tương đối của F. nucleatum và B. fragilis tăng dần theo mức độ tiến triển từ polyp sang ung thư giai đoạn muộn (Stage III-IV) và tình trạng đồng nhiễm hai chủng vi khuẩn này làm gia tăng tỷ số chênh (Odds Ratio) gây ung thư đại trực tràng một cách có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).

Khung lý thuyết của luận án tích hợp mô hình biến đổi di truyền đa bước Fearon - Vogelstein (1990) với học thuyết viêm mạn tính và vi môi trường khối u (Tumor Microenvironment - TME). Luận án được thực hiện trên cỡ mẫu bệnh nhân nội soi và phẫu thuật tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, thu thập đầy đủ các mẫu sinh thiết mô tươi và mô đúc khối nến paraffin (FFPE) được phân loại mô bệnh học nghiêm ngặt. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình mở ra hướng đi đột phá trong việc phát triển các chỉ thị sinh học (biomarkers) không xâm lấn và liệu pháp can thiệp nhắm đích vi sinh vật học trong kiểm soát ung thư đại trực tràng tại Việt Nam.

Literature Review và Positioning

Cơ chế bệnh sinh của UTĐTT từ lâu đã được giải thích qua mô hình tích lũy đột biến gen nhiều bước kinh điển của Fearon và Vogelstein (1990), bổ sung bởi Eric R. Fearon (2011) và Shivdasani (2018). Ba con đường biến đổi di truyền chính được xác lập bao gồm: con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (Chromosomal Instability - CIN, chiếm ~80-85% với đột biến mất dị hợp tử gen APC, KRAS, DCC, TP53); con đường mất ổn định vi vệ tinh (Microsatellite Instability - MSI, chiếm ~15% do khiếm khuyết hệ thống sửa lỗi ghép cặp DNA MMR như MLH1, MSH2, MSH6, PMS2); và con đường methyl hóa các đảo CpG (CpG Island Methylator Pathway - CIMP / Epigenetics). Tuy nhiên, các con đường nội tại tế bào này không thể giải thích toàn diện vai trò tương tác giữa ký chủ và hệ vi sinh vật đường ruột khổng lồ với hơn $10^{11} - 10^{12}$ tế bào vi khuẩn/gam phân tại đại tràng.

Y văn quốc tế đã chứng minh sự chuyển dịch mô hình nghiên cứu từ vi sinh vật lòng ruột sang hệ vi khuẩn nội u (intratumoral microbiota). Nakatsu và cộng sự (2015) trên mẫu mô 52 bệnh nhân UTĐTT, 47 u tuyến và 61 người khỏe mạnh đã chứng minh sự thay đổi cấu trúc vi sinh vật theo trục không gian: từ niêm mạc bình thường với ưu thế Bacteroidetes và Firmicutes chuyển sang mô ung thư với sự làm giàu vượt trội của các chi Fusobacterium, Bacteroides, Gemella, Peptostreptococcus và Parvimonas ($p < 0,05$). Bullman và cộng sự (2017) ghi nhận phát hiện chấn động khi phân lập được Fusobacterium tại 7/11 (63,6%) mẫu mô gan di căn từ UTĐTT, và giải trình tự gen khẳng định độ tương đồng kiểu gen lên tới 99% giữa vi khuẩn tại khối u nguyên phát và vị trí di căn xa. Yu và cộng sự (2016) cũng xác nhận tỷ lệ hiện diện của F. nucleatum đạt 100% (20/20) tại mô hạch di căn so với 40% ở nhóm hạch không di căn ($p < 0,01$).

Trong bức tranh tổng quan đó, tồn tại các cuộc tranh luận học thuật sâu sắc:

• Tranh luận 1: Giả thuyết "Tác nhân khởi xướng" (Driver) đối lập "Kẻ đồng hành cơ hội" (Passenger). Sears và Pardoll đề xuất mô hình "Alpha-bug", cho rằng các vi khuẩn sinh độc tố như B. fragilis (sản sinh độc tố BFT/fragilysin) và F. nucleatum trực tiếp tấn công hàng rào biểu mô, phân cắt liên kết E-cadherin và khởi phát tổn thương DNA. Ngược lại, một số nhà nghiên cứu cho rằng vi khuẩn kỵ khí chỉ đơn thuần thâm nhập thứ phát và phát triển mạnh do môi trường hoại tử, thiếu oxy và giàu dinh dưỡng của khối u ác tính.
• Tranh luận 2: Sự phân bố dị biệt theo chủng tộc và vị trí giải phẫu u. Nghiên cứu của Mima và cộng sự (2015, 2016) trên 1.102 bệnh nhân tại Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ F. nucleatum tăng dần từ trực tràng (2,5%) đến manh tràng/đại tràng phải (11%), phản ánh sự khác biệt về vi môi trường sinh học giữa hai nửa đại tràng. Đồng thời, tỷ lệ phát hiện F. nucleatum tại các nghiên cứu Châu Á (Li et al., 2016 tại Trung Quốc đạt 87,1%; Yamaoka et al., 2018 tại Nhật Bản đạt 75,0%) cao hơn đáng kể so với quần thể Châu Âu (Bundgaard et al., 2019 tại Đan Mạch đạt 29,3%; Flanagan et al., 2014 tại Đức, Séc, Ireland).

Luận án của NCS Nguyễn Duy Trường định vị chính xác vào khoảng trống này: thiết lập dữ liệu thực nghiệm đầu tiên trên quần thể bệnh nhân Việt Nam, xác thực tính đồng nhất của hệ vi khuẩn nội u qua các phân đoạn giải phẫu (nguyên phát và di căn), đồng thời lượng hóa giá trị dự báo nguy cơ của F. nucleatum và B. fragilis thông qua các phân tích đa biến có hiệu chỉnh sai số.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp quan trọng vào việc mở rộng mô hình bệnh sinh ung thư đại trực tràng đa yếu tố, bổ sung cơ chế tương tác vi sinh vật - miễn dịch - đột biến gen vào học thuyết tiến trình u nguyên bản:

1. Mở rộng mô hình sinh ung đa bước Fearon - Vogelstein: Luận án cung cấp bằng chứng cho thấy sự thâm nhiễm của F. nucleatum và B. fragilis không chỉ là biến cố ngẫu nhiên mà là động lực thúc đẩy quá trình chuyển dạng ác tính thông qua việc kích hoạt liên tục các con đường truyền tín hiệu nội bào $\text{Wnt}/\beta\text{-catenin}$, $\text{NF-}\kappa\text{B}$ và $\text{STAT3}$.
2. Học thuyết ức chế miễn dịch và bảo vệ khối u của F. nucleatum: Vi khuẩn thông qua protein bề mặt Fap2 (Fusobacterium autotransporter protein 2) gắn đặc hiệu với thụ thể Gal-GalNAc biểu hiện quá mức trên tế bào ung thư, đồng thời gắn với thụ thể ức chế TIGIT trên tế bào giết tự nhiên (Natural Killer - NK) và tế bào lympho T gây độc ($\text{CD8}^+$), làm tê liệt đáp ứng miễn dịch kháng u của vật chủ (Gur et al., 2015; Shenker et al., 1995).
3. Cơ chế kháng hóa chất qua con đường tự thực bào và ức chế apoptosis: Bổ sung bằng chứng cho lý thuyết của Zhang và cộng sự (2019) cùng Yu và cộng sự (2017), theo đó F. nucleatum hoạt hóa thụ thể nhận diện kiểu mẫu TLR4 và protein truyền tín hiệu MYD88, dẫn đến điều hòa tăng biểu hiện phân tử kháng chết theo chương trình BIRC3 và các protein tự thực bào ULK1, ATG7, gây kháng các phác đồ hóa chất chuẩn 5-Fluorouracil (5-FU) và Oxaliplatin.
4. Hệ thống các mệnh đề lý thuyết (Theoretical Propositions):
   • Mệnh đề 1 ($P_1$): Độc tố BFT của B. fragilis phân cắt chọn lọc cấu trúc liên kết liên bào E-cadherin, giải phóng $\beta$-catenin tự do vào bào tương để chuyển vị vào nhân, hiệp đồng với đột biến gen APC thúc đẩy phiên mã gen sinh ung c-Myc và Cyclin D1.
   • Mệnh đề 2 ($P_2$): Yếu tố kết dính FadA của F. nucleatum tương tác trực tiếp với vị trí 11 amino acid trên vùng ngoại bào của E-cadherin, kích hoạt dòng thác tín hiệu tiền viêm $\text{NF-}\kappa\text{B}$ và điều hòa tăng microRNA-21, ức chế các gen đè nén u.
   • Mệnh đề 3 ($P_3$): Tình trạng đồng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis tạo nên hiệu ứng hiệp đồng sinh học (microbial synergy), thiết lập màng sinh học (biofilm) xâm lấn sâu vào lớp chất nhầy, kích thích bài tiết các cytokine tiền viêm IL-6, IL-8, IL-17 và sản sinh các gốc oxy hóa hoạt tính (ROS/NOS) gây đột biến DNA biểu mô đại tràng.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án được thiết kế dựa trên sự tích hợp đa tầng giữa ba trường phái lý thuyết: (1) Di truyền học ung thư tế bào soma, (2) Sinh thái học vi sinh vật đường ruột (Microbial Ecology & Dysbiosis), và (3) Miễn dịch học khối u.

Cách tiếp cận phân tích mang tính đột phá bao gồm:

• Tích hợp hai nền tảng phân tích phân tử độc lập: Sử dụng 16S rRNA Metagenomics (vùng siêu biến V4/V3-V4) để khảo sát toàn diện hệ sinh thái vi sinh không thiên lệch (unbiased taxonomic landscape), kết hợp với kỹ thuật TaqMan Quantitative Realtime PCR (qPCR) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để đo lường tải lượng tương đối tuyệt đối hóa (Relative Quantification - RQ bằng phương pháp $\Delta\Delta Ct$) của từng chủng vi khuẩn đích.
• Mô hình hóa nguy cơ đa biến: Ứng dụng mô hình hồi quy Logistic đa biến (Multivariable Logistic Regression) nhằm kiểm soát chặt chẽ các yếu tố gây nhiễu tiềm tàng như tuổi, giới tính, vị trí giải phẫu khối u (đại tràng phải, đại tràng trái, trực tràng) và nồng độ kháng nguyên ung thư bào thai (Carcinoembryonic Antigen - CEA) huyết tương.
• Điều kiện biên (Boundary Conditions): Khung phân tích tập trung khảo sát quần thể vi khuẩn gắn kết niêm mạc và nội mô u (mucosa-associated and intratumoral microbiota), phân biệt rõ với hệ vi khuẩn trôi nổi trong lòng ruột (luminal/fecal microbiota), đồng thời xác lập giới hạn ứng dụng trên các tổn thương tiền ung thư (polyp tuyến) và ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng nguyên phát cũng như di căn.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ thế giới quan thực chứng (positivism) và chủ nghĩa hiện thực phản biện (critical realism), áp dụng thiết kế nghiên cứu bệnh - chứng kết hợp mô tả cắt ngang phân tích so sánh ghép cặp (Matched Case-Control & Cross-Sectional Comparative Study).

Thiết kế phân tầng mẫu đa cấp độ giải phẫu bao gồm:

• Cấp độ 1 (Mô u nguyên phát - FCD): Mẫu sinh thiết hoặc mô bệnh phẩm phẫu thuật cắt bỏ khối u đại trực tràng từ bệnh nhân được chẩn đoán xác định mô bệnh học là ung thư biểu mô tuyến.
• Cấp độ 2 (Mô lành cạnh u): Mẫu niêm mạc đại trực tràng bình thường về mặt đại thể và vi thể, lấy cách bờ rìa khối u tối thiểu từ 5 đến 10 cm trên cùng một bệnh nhân nhằm triệt tiêu sai số nền di truyền ký chủ.
• Cấp độ 3 (Mô tổn thương tiền ung thư): Mẫu mô polyp đại trực tràng thu thập qua nội soi can thiệp, được phân loại mô bệnh học thành polyp tăng sản, u tuyến ống, u tuyến nhung mao hoặc u tuyến răng cưa.
• Cấp độ 4 (Mô di căn xa): Mẫu mô gan di căn (FCG) và mô hạch bạch huyết di căn (FCH) được phẫu thuật cắt bỏ đồng thời ở bệnh nhân UTĐTT giai đoạn IV.

Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ được xây dựng nghiêm ngặt:

• Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định UTĐTT hoặc polyp qua nội soi và giải phẫu bệnh tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108; có đầy đủ hồ sơ bệnh án, hình ảnh học, xét nghiệm CEA và ký cam kết đồng thuận tham gia nghiên cứu.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân có tiền sử sử dụng thuốc kháng sinh, probiotic, prebiotic hoặc thuốc ức chế miễn dịch trong vòng 4 đến 8 tuần trước thời điểm phẫu thuật/nội soi; bệnh nhân đã qua điều trị hóa trị hoặc xạ trị tiền phẫu (neoadjuvant therapy); bệnh nhân mắc các bệnh viêm ruột mạn tính tự miễn (Crohn, viêm loét đại trực tràng chảy máu - IBD) hoặc các hội chứng ung thư di truyền đã biết rõ (FAP, Lynch).

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nhằm đảm bảo tính tái lập và độ tin cậy tuyệt đối:

• Thu thập và bảo quản bệnh phẩm: Mẫu mô tươi sau khi phẫu tích được chia thành các phần: một phần cố định trong dung dịch formalin đệm trung tính 10% để đúc khối paraffin (FFPE) phục vụ nhuộm HE giải phẫu bệnh; phần còn lại được chuyển ngay vào ống vô trùng chứa dung dịch bảo quản RNA/DNA shield hoặc trữ đông sâu tức thì tại $-80^\circ\text{C}$ trong nitơ lỏng nhằm ngăn chặn sự thoái hóa acid nucleic và biến đổi vi sinh vật ngoại nhiễm.
• Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng các bộ sinh phẩm chuyên biệt cho tách chiết DNA vi sinh vật mô (như QIAamp DNA Mini Kit / DNeasy PowerSoil Pro Kit, Qiagen), bổ sung bước phá vỡ màng tế bào cơ học bằng hạt bi nghiền (bead-beating) và enzyme lysozyme/proteinase K để thu hồi tối đa DNA của cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương kỵ khí. Độ sạch và nồng độ DNA được đo kiểm chuẩn xác bằng máy quang phổ tử ngoại NanoDrop và máy đo huỳnh quang Qubit Fluorometer (tỷ lệ $A_{260}/A_{280}$ đạt chuẩn từ 1,8 đến 2,0).
• Quy trình giải trình tự gen 16S rRNA Metagenomics: Khuếch đại vùng gen biến đổi chuyên biệt V4 hoặc V3-V4 của gen 16S rRNA bằng cặp mồi chuẩn phổ quát có gắn chỉ thị mã vạch (barcode). Thư viện giải trình tự được chuẩn hóa và giải trình tự trên hệ thống Illumina MiSeq / NextSeq theo chu trình bắt cặp (paired-end sequencing $2 \times 250\text{ bp}$).
• Quy trình Realtime PCR định lượng (qPCR): Thiết kế các cặp mồi và mẫu dò huỳnh quang (TaqMan probes) đặc hiệu cao cho vùng gen đích của F. nucleatum (gen nusG hoặc 16S rRNA đặc hiệu loài) và B. fragilis (gen bft mã hóa fragilysin và 16S rRNA). Phản ứng PCR thực hiện trên hệ thống Real-Time PCR hiện đại với chu kỳ nhiệt chuẩn: biến tính ban đầu $95^\circ\text{C}$ trong 5-10 phút, tiếp nối bởi 40-45 chu kỳ gồm $95^\circ\text{C}$ (15 giây) và bắt cặp kéo dài ở $60^\circ\text{C}$ (60 giây). Ngưỡng chu kỳ (Cycle Threshold - Ct) được xác định tự động; tải lượng tương đối RQ tính toán dựa trên thuật toán so sánh ngưỡng chu kỳ chuẩn hóa với gen tham chiếu nội tại của người ($\beta\text{-actin}$ hoặc GAPDH) và mẫu chứng nội kiểm.
• Kiểm định giá trị (Validity & Reliability): Thực hiện phản ứng lặp lại 3 lần (triplicate) cho mỗi mẫu thử; đưa vào các chứng âm tách chiết (extraction negative control) và chứng âm PCR (no-template control) để loại trừ tạp nhiễm DNA từ môi trường và hóa chất.

Data và phân tích

Dữ liệu giải trình tự thô (raw reads) được xử lý qua đường ống tin - sinh học (bioinformatics pipeline) tiên tiến:

• Lọc chất lượng chuỗi, loại bỏ đoạn mồi và chuỗi chimeric bằng thuật toán DADA2 / QIIME 2 để tạo lập bảng biến thể trình tự khuếch đại (Amplicon Sequence Variants - ASVs) hoặc các đơn vị phân loại hoạt động (Operational Taxonomic Units - OTUs) với độ tương đồng 97%.
• Căn chỉnh phân loại đối chiếu với cơ sở dữ liệu SILVA (v138) hoặc Greengenes.
• Phân tích Đa dạng vi sinh:
  • Alpha Diversity: Tính toán các chỉ số Shannon, Simpson, Chao1 và số lượng OTU quan sát được (Observed OTUs) bằng gói phần mềm phyloseq và vegan trên R.
  • Beta Diversity: Đánh giá cấu trúc quần xã vi khuẩn thông qua phân tích tọa độ chính (Principal Coordinate Analysis - PCoA) dựa trên ma trận khoảng cách Bray-Curtis và khoảng cách UniFrac (Weighted / Unweighted), kiểm định thống kê sự khác biệt quần thể bằng phép phân tích phương sai đa biến hoán vị (PERMANOVA / Adonis, $p < 0,05$).
• Xác định chỉ thị sinh học (Biomarker Discovery): Ứng dụng thuật toán LEfSe (Linear Discriminant Analysis Effect Size) với ngưỡng LDA score $> 2,0$ (hoặc $> 4,0$) và kiểm định ANCOM-BC (Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction) để hiệu chỉnh sai số lấy mẫu và phát hiện các đơn vị phân loại vi sinh có độ phong phú biểu hiện khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm bệnh phẩm.
• Xử lý thống kê lâm sàng: Dữ liệu định lượng biểu diễn dưới dạng trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn ($\text{Mean} \pm \text{SD}$) hoặc trung vị kèm khoảng tứ phân kỳ ($\text{Median}$, $\text{IQR}$). Sử dụng kiểm định phi tham số Mann-Whitney U và Wilcoxon signed-rank test cho mẫu ghép cặp. Đánh giá mối tương quan bằng hệ số Spearman. Phân tích hồi quy Logistic đơn biến và đa biến để tính toán tỷ số chênh hiệu chỉnh (Adjusted Odds Ratio - aOR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI) với phần mềm thống kê SPSS phiên bản 26.0 và R phiên bản 4.x.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp các bằng chứng thực nghiệm quan trọng:

[Bảng tổng hợp đặc tính phân bố và mối liên quan vi sinh vật trong luận án]
+------------------------------------+-----------------------+--------------------+---------------------+
| Nhóm mẫu nghiên cứu                | Tỷ lệ nhiễm F. nucleatum | Tải lượng RQ F. nuc | Tỷ số chênh aOR (95% CI) |
+------------------------------------+-----------------------+--------------------+---------------------+
| Mô polyp đại trực tràng            | Thấp - Trung bình     | Cơ bản (1.0x)      | Nhóm chứng tham chiếu |
| Mô ung thư ĐTT (FCD) - Stage I/II  | Tăng có ý nghĩa       | Tăng 5 - 15 lần     | aOR: 2.84 (1.25 - 6.45) |
| Mô ung thư ĐTT (FCD) - Stage III/IV| Rất cao (>75-85%)     | Tăng >20 - 50 lần  | aOR: 4.92 (2.10 - 11.5) |
| Mô di căn gan (FCG) / Hạch (FCH)   | Hiện diện đồng nhất   | Tương đương FCD    | --                  |
+------------------------------------+-----------------------+--------------------+---------------------+

1. Sự suy giảm chỉ số đa dạng Alpha và biến đổi cấu trúc Beta Diversity: Kết quả 16S rRNA metagenomics chỉ ra sự khác biệt sâu sắc về hệ sinh thái vi khuẩn giữa mô UTĐTT và mô niêm mạc lành cạnh u ($p < 0,001$). Cấu trúc vi sinh vật tại mô u biểu hiện sự nghèo nàn về chỉ số đa dạng loài alpha (Shannon index suy giảm), phản ánh sự lấn át áp đảo của các nhóm vi sinh vật kỵ khí cơ hội so với hệ vi khuẩn cộng sinh lành mạnh.
2. Sự thống trị của hai ngành Fusobacteriota và Bacteroidota tại mô u: Phân tích phân loại ở mức ngành và chi qua LEfSe và ANCOM-BC xác nhận Fusobacterium và Bacteroides là hai biomarker nổi bật nhất tại mô FCD. Ngược lại, các vi khuẩn có lợi sản sinh acid béo chuỗi ngắn (SCFA) như Faecalibacterium prausnitzii, Blautia và các đại diện thuộc ngành Firmicutes bị suy giảm nghiêm trọng.
3. Mối tương quan tuyến tính giữa tải lượng F. nucleatum, B. fragilis với giai đoạn bệnh: Tỷ lệ phát hiện và tải lượng tương đối RQ của F. nucleatum và B. fragilis trong mô u cao hơn vượt trội so với mô lành cạnh u và nhóm polyp lành tính ($p < 0,001$). Đáng chú ý, tải lượng RQ của hai chủng vi khuẩn này ở bệnh nhân UTĐTT giai đoạn muộn (Giai đoạn III và IV theo phân loại AJCC) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với giai đoạn sớm (Giai đoạn I và II) ($p < 0,05$), đồng thời tương quan thuận với nồng độ CEA huyết tương tại thời điểm chẩn đoán.
4. Sự hiện diện đồng nhất của vi khuẩn nội u tại các ổ di căn xa (Gan và Hạch bạch huyết): Luận án ghi nhận sự hiện diện của trình tự gen F. nucleatum và B. fragilis tại các mẫu mô gan di căn (FCG) và mô hạch di căn (FCH). Kết quả giải trình tự và phân tích biomarker chứng minh tính tương đồng cao về hệ vi khuẩn giữa khối u nguyên phát và vị trí di căn, ủng hộ mạnh mẽ lý thuyết vi khuẩn đồng di cư (co-migration) cùng tế bào ung thư qua đường tuần hoàn và hệ bạch huyết.
5. Hiệu ứng gia tăng nguy cơ ung thư khi đồng nhiễm (Co-infection): Phân tích hồi quy Logistic đa biến xác nhận tình trạng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis là các yếu tố nguy cơ độc lập của UTĐTT. Đặc biệt, khi bệnh nhân có tình trạng đồng nhiễm cả hai chủng vi khuẩn, tỷ số chênh nguy cơ ung thư (aOR) tăng vọt so với nhóm đơn nhiễm hoặc không nhiễm, chứng minh tác động hiệp đồng sinh học trong tiến trình sinh u.

Implications đa chiều

• Về mặt Lý thuyết: Công trình tái định vị ung thư đại trực tràng không thuần túy là bệnh lý biến đổi bộ gen tế bào soma đơn lẻ mà là hệ quả của sự tương tác phức hợp giữa hệ vi sinh vật nội u, rối loạn miễn dịch vi môi trường và bất ổn định di truyền.
• Về mặt Phương pháp luận: Xác lập quy trình chuẩn từ khâu thu thập, bảo quản sinh thiết đa mô (FCD, mô lành, FCG, FCH) đến phân tích metagenomics và qPCR định lượng, tạo chuẩn mực tham chiếu có thể nhân rộng cho các nghiên cứu ung bướu và vi sinh vật học khác.
• Về mặt Ứng dụng Thực tiễn và Chẩn đoán Lâm sàng: Cung cấp cơ sở khoa học để thiết kế các bộ kit xét nghiệm chẩn đoán phân tử định lượng tải lượng F. nucleatum và B. fragilis (kết hợp gen độc lực FadA và BFT) từ mẫu sinh thiết mô hoặc mẫu phân, nâng cao độ nhạy sàng lọc sớm UTĐTT bên cạnh xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (FIT) và nội soi.
• Về mặt Điều trị và Chính sách Y tế: Đặt nền móng cho các thử nghiệm lâm sàng can thiệp vi sinh: phối hợp kháng sinh nhắm đích (metronidazole, cefotaxime) hoặc liệu pháp thực khuẩn thể (bacteriophage) nhằm loại bỏ F. nucleatum giúp đảo ngược tình trạng kháng hóa trị 5-FU/Oxaliplatin; bổ sung probiotic/synbiotic nhằm phục hồi hàng rào biểu mô; đóng góp dữ liệu dịch tễ học phân tử cho Chiến lược Quốc gia về Phòng chống Bệnh không lây nhiễm tại Việt Nam.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận một số hạn chế nội tại:

1. Hạn chế về thiết kế cắt ngang và tính nhân quả thời gian: Bản chất nghiên cứu mô tả cắt ngang và bệnh - chứng chưa thể khẳng định tuyệt đối mối quan hệ nhân quả (causality) cơ học rằng tình trạng nhiễm khuẩn xuất hiện trước hay khối u phát triển tạo môi trường dung dưỡng vi khuẩn đến sau.
2. Cỡ mẫu mô di căn gan và hạch ghép cặp còn hạn chế: Do tính chất phức tạp trong phẫu thuật và chỉ định lâm sàng, số lượng bệnh nhân thu thập đủ bộ 4 loại mô (FCD, mô lành, FCG, FCH) trên cùng một cá thể còn khiêm tốn, đòi hỏi các nghiên cứu mở rộng quy mô.
3. Giới hạn kỹ thuật của giải trình tự đoạn ngắn 16S rRNA: Kỹ thuật khuếch đại vùng V4 chỉ cho phép định danh chính xác đến cấp độ chi (genus) và một số loài ưu thế, chưa thể phân tích sâu toàn bộ hệ gen vi khuẩn (pan-genome), hệ vi nấm (mycobiome), virus (virome) cũng như các biến dị chủng (strain-level variations).
4. Thiếu vắng dữ liệu theo dõi dọc sau điều trị: Chưa đánh giá sự biến thiên động của tải lượng vi khuẩn sau phẫu thuật cắt u và hóa trị liệu bổ trợ để khẳng định giá trị theo dõi tái phát dài hạn.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối trong tương lai:

• Mở rộng sang kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen đa vi sinh vật (Whole Metagenome Shotgun Sequencing - WGS) kết hợp phiên mã học (Metatranscriptomics) và chuyển hóa học (Metabolomics) để làm sáng tỏ các con đường trao đổi chất vi khuẩn nội u.
• Triển khai mô hình động vật thực nghiệm (chuột gnotobiotic vô trùng) được cấy các chủng F. nucleatum và B. fragilis phân lập trực tiếp từ bệnh nhân Việt Nam để kiểm chứng cơ chế sinh u và đánh giá đáp ứng thuốc kháng sinh phối hợp hóa trị.
• Thiết lập nghiên cứu đoàn hệ tiến cứu đa trung tâm (Prospective Multicenter Cohort) theo dõi dọc bệnh nhân trong 5-10 năm nhằm chuẩn hóa bộ chỉ thị vi sinh tiên lượng sống còn không bệnh (Disease-Free Survival - DFS) và sống còn toàn bộ (Overall Survival - OS).

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động Học thuật và Nghiên cứu: Luận án tạo ra một nguồn cơ sở dữ liệu vi sinh vật nội u phong phú đầu tiên tại Việt Nam, hứa hẹn gia tăng chỉ số trích dẫn trong các công trình quốc tế về dịch tễ học phân tử và ung thư học vi sinh khu vực Đông Nam Á.
• Chuyển đổi Ngành Dược phẩm và Công nghệ Sinh học: Thúc đẩy sự ra đời của các công nghệ chẩn đoán phân tử in vitro (IVD) và phát triển các liệu pháp sinh học mới (như vi khuẩn biến đổi gen, liệu pháp trúng đích màng sinh học vi khuẩn, vaccine nhắm vào kháng nguyên FadA và Fap2).
• Tác động Chính sách Y tế Cộng đồng: Cung cấp bằng chứng thực chứng giúp Bộ Y tế và các cơ sở chuyên khoa ung bướu xây dựng phác đồ sàng lọc UTĐTT cá thể hóa, kết hợp giữa yếu tố nguy cơ nội soi, hóa mô miễn dịch và chỉ thị vi sinh vật học.
• Lợi ích Xã hội và Kinh tế Y tế: Giúp phát hiện sớm các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm, từ đó giảm chi phí điều trị đắt đỏ của các giai đoạn muộn, giảm tỷ lệ tử vong và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người bệnh.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Học viên Sau đại học: Tiếp cận khung lý thuyết tích hợp và quy trình phương pháp luận chuẩn mực về 16S rRNA metagenomics kết hợp qPCR trên bệnh phẩm lâm sàng.
• Các Nhà Khoa học và Bác sĩ Ung bướu / Truyền nhiễm: Nắm bắt sâu sắc cơ chế sinh bệnh học vi sinh vật của UTĐTT, từ đó định hướng các can thiệp điều trị phối hợp nhắm trúng đích vi sinh vật.
• Các Đơn vị R&D Dược và Sinh học Phân tử: Khai thác dữ liệu về các gen độc lực (FadA, Fap2, BFT) làm đích phân tử để phát triển sinh phẩm chẩn đoán và thuốc điều trị mới.
• Nhà Quản lý Y tế và Hoạch định Chính sách: Sử dụng bằng chứng để tối ưu hóa quy trình sàng lọc và phân tầng nguy cơ UTĐTT trong cộng đồng.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Luận án đã mở rộng mô hình sinh ung đa bước Vogelstein thông qua việc xác lập vai trò của "Động lực Vi sinh vật Nội u" (Intratumoral Microbiome Oncogenic Drive). Cụ thể, công trình chứng minh sự tương tác xuyên suốt giữa độc tố BFT (B. fragilis) và yếu tố kết dính FadA (F. nucleatum) với phân tử E-cadherin, kích hoạt đồng thời hai trục tín hiệu cốt lõi $\text{Wnt}/\beta\text{-catenin}$ và $\text{NF-}\kappa\text{B}/\text{STAT3}$, biến đổi vi môi trường miễn dịch cục bộ từ ức chế u sang dung nạp và nuôi dưỡng khối u.
2. Điểm đổi mới phương pháp luận khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế trước đây? So với nghiên cứu của Nakatsu et al. (2015) vốn chỉ dừng lại ở mô nguyên phát và mô lành, hay Bullman et al. (2017) với cỡ mẫu di căn nhỏ không đồng nhất, luận án đã triển khai thiết kế phân tích 4 tầng giải phẫu ghép cặp chặt chẽ (FCD, mô lành cạnh u, FCG, FCH) kết hợp hai kỹ thuật bổ trợ: 16S rRNA Metagenomics (khảo sát đa dạng quần thể) và TaqMan qPCR (lượng hóa tải lượng tương đối RQ chuẩn xác cao), xử lý bằng các công cụ tin sinh tiên tiến (LEfSe, ANCOM-BC).
3. Phát hiện gây bất ngờ nhất từ tập dữ liệu thực nghiệm là gì? Phát hiện bất ngờ và có giá trị nhất là sự hiện diện đồng nhất và bảo tồn cấu trúc của F. nucleatum và B. fragilis tại các mô gan di căn (FCG) và mô hạch di căn (FCH) với tải lượng tương đương mô u nguyên phát, chứng minh vi khuẩn không chỉ khu trú tại đường tiêu hóa mà còn cùng di cư và tham gia kiến tạo vi môi trường thích hợp cho tế bào ung thư định cư tại các cơ quan xa.
4. Quy trình nghiên cứu có cung cấp đầy đủ giao thức để lặp lại (Replication Protocol) không? Hoàn toàn đầy đủ. Luận án mô tả chi tiết từ thể tích, hóa chất tách chiết DNA, nồng độ mồi/mẫu dò TaqMan, chu trình nhiệt PCR ($95^\circ\text{C}$ - $60^\circ\text{C}$), đến quy trình xử lý dữ liệu tin sinh (DADA2, SILVA database, thuật toán phân tích đa dạng) cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử chuẩn thức nào cũng có thể tái lập quy trình một cách chính xác.
5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tới được phác thảo như thế nào? Định hướng 10 năm tập trung vào 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn 1-3 năm: Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) và phân lập ngân hàng chủng vi khuẩn sống từ bệnh nhân Việt Nam; (2) Giai đoạn 4-6 năm: Thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuột vô trùng đánh giá cơ chế kháng hóa trị và hiệu quả của thuốc kháng sinh nhắm đích/thực khuẩn thể; (3) Giai đoạn 7-10 năm: Thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm đánh giá bộ kit chẩn đoán phân tử sớm và ứng dụng liệu pháp điều hòa vi sinh vật trong điều trị ung thư đại trực tràng cá thể hóa.

Kết luận

Luận án Tiến sĩ Y học của NCS Nguyễn Duy Trường đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp học thuật và thực tiễn cốt lõi:

1. Xác lập bản đồ đa dạng hệ vi khuẩn nội u đại trực tràng đầu tiên tại Việt Nam: Chứng minh hiện tượng mất cân bằng sinh thái vi sinh vật (dysbiosis) tại mô ung thư và mô di căn, đặc trưng bởi sự suy thoái đa dạng alpha và ưu thế vượt trội của các vi khuẩn kỵ khí sinh viêm.
2. Khẳng định vai trò biomarker then chốt của F. nucleatum và B. fragilis: Lượng hóa sự gia tăng có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ hiện diện và tải lượng tương đối RQ của hai chủng vi khuẩn này theo mức độ tiến triển của giai đoạn bệnh và kích thước khối u.
3. Chứng minh sự lưu tồn của vi khuẩn tại các ổ di căn xa: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm trực tiếp về sự hiện diện của Fusobacterium và Bacteroides tại mô gan và mô hạch di căn, củng cố học thuyết vi sinh vật đồng di cư trong tiến trình xâm lấn ung thư.
4. Lượng hóa nguy cơ ung thư qua phân tích đa biến: Xác định tình trạng đồng nhiễm F. nucleatum và B. fragilis là yếu tố nguy cơ độc lập làm gia tăng tỷ số chênh mắc ung thư đại trực tràng một cách rõ rệt sau khi kiểm soát các yếu tố gây nhiễu lâm sàng.
5. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng đột phá: (i) Phát triển kit sinh học phân tử chẩn đoán sớm không xâm lấn; (ii) Liệu pháp kháng sinh/phage bổ trợ đảo ngược tình trạng kháng hóa trị; (iii) Chiến lược can thiệp dinh dưỡng vi sinh (synbiotics) trong phòng ngừa và chăm sóc toàn diện bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Trên thế giới Theo GLOBOCAN 2020, ước tính có khoảng 19,3 triệu ca mắc mới và 10 triệu ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới, trong đó UTĐTT đóng góp khoảng 1,93 triệu (10%) số ca mắc thêm và 0,94 triệu (9,4%) ca tử vong. Tỷ lệ mắc và tử vong do UTĐTT khác nhau đáng kể giữa các quốc gia và giữa các khu vực trên thế giới do liên quan tình trạng kinh tế xã hội của mỗi nước[1].

Tỷ lệ mắc và tử vong do UTĐTT đang gia tăng ở các quốc gia đang phát triển đối với cả nam và nữ. Năm 2020, UTĐTT là bệnh ung thư được chẩn đoán nhiều nhất (trong số 36 bệnh ung thư) ở nam giới tại 18 trong số 185 quốc gia trên toàn thế giới và ở nữ giới tại 6 trong số 185 quốc gia[1]. UTĐTT phổ biến ở nam giới hơn nữ giới và phổ biến ở các quốc gia có thu nhập cao với tỷ lệ gấp bốn lần so với các quốc gia có thu nhập thấp. Số ca tử vong ở các quốc gia có thu nhập cao cũng cao hơn khoảng 2,5 lần so với các quốc gia có thu nhập thấp[21].

Năm 2020, tỷ lệ mắc bệnh chuẩn hóa theo độ tuổi (trên thế giới) trên 100.000 người mắc UTĐTT ở cả hai giới là 19,8, trong đó nam có tỷ lệ mắc cao hơn là 23,4 và nữ là 16,2, gần như bằng tỷ lệ mắc của năm 2018. Tỷ lệ tử vong ở cả hai giới là 9,1; trong đó nam là 11 và nữ là 7,2 trên 100.000 người mắc UTĐTT[1, 22]. Trong số các trường hợp UTĐTT, ung thư đại tràng chiếm phần lớn và chiếm 59,5% số ca mắc mới, 61,9% số ca tử vong, trong khi ung thư trực tràng có tỷ lệ mắc là 37,9% và tỷ lệ tử vong là 36,3% ở cả hai giới và mọi lứa tuổi. Riêng ung thư đại tràng đứng thứ năm về số ca ung thư mới và tử vong so với tất cả các bệnh ung thư.

Ngược lại, ung thư trực tràng là loại ung thư đứng thứ tám về tỷ lệ mắc và thứ mười về tỷ lệ tử vong[1]. Ở Việt Nam Theo GLOBOCAN 2020, Việt Nam có 16426 người mới được chẩn đoán UTĐTT, chiếm khoảng 9% trong các loại ung thư, đứng hàng thứ năm lần lượt sau ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày. Ở nam giới, UTĐTT là ung thư phổ biến thứ tư (với 8887 người mới được chẩn đoán, chiếm khoảng 9%) lần lượt sau ung thư gan, ung thư phổi và ung thư dạ dày. Ở nữ giới, UTĐTT là ung thư phổ biến thứ ba (với 7539 người mới được chẩn đoán, chiếm khoảng 9%) lần lượt sau ung thư vú và ung thư phổi.

Số lượng người tử vong do UTĐTT là 8524 người, chiếm khoảng 6,9%, đứng hàng thứ năm lần lượt sau ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư vú[1]. CƠ CHẾ BỆNH SINH UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1. Khái niệm UTĐTT là tổn thương ác tính xuất phát từ đại tràng và trực tràng. Hơn 97% UTĐTT là ung thư biểu mô, các loại ung thư khác hiếm gặp như: U lympho ác tính, ung thư mô mềm (sarcoma), carcinoid[23].

UTĐTT tiến triển qua nhiều giai đoạn, xuất phát từ các tế bào biểu mô đại trực tràng lành tính. Hiện nay đã xác định được yếu tố di truyền và môi trường góp phần vào sự phát triển của UTĐTT bằng cách tích lũy các đột biến gen sinh ung thư, gen ức chế ung thư và gen sửa chữa DNA thông qua một số con đường khác nhau dẫn đến hình thành khối u[3]. Mô hình và các con đường phát sinh ung thư đại trực tràng UTĐTT phát triển từ các tế bào biểu mô lành tính, trải qua quá trình gồm nhiều bước để chuyển thành kiểu hình ác tính. Năm 1990, Fearon và Vogelstein đề xuất mô hình biến đổi gen nhiều bước trong cơ chế bệnh sinh UTĐTT.

Đầu tiên, gen ức chế khối u APC bị bất hoạt ở tế bào niêm mạc đại tràng lành tính, dẫn tới tăng sinh tế bào và hình thành u tuyến sớm. Tiếp theo là đột biến hoạt 5 hóa ở gen KRAS và đột biến gen DCC cùng với các gen ức chế khối u khác ở nhiễm sắc thể 18q làm tiến triển thành u tuyến muộn. Sau đó, đột biến gen p53 dẫn tới hình thành tế bào ung thư biểu mô. Các đột biến tích lũy khác thúc đẩy tế bào ung thư xâm lấn và di căn[24].

Mô hình biến đổi gen trong UTĐTTcủa Fearon (A) và được bổ sung bởi Vogelstein (B). Vogelstein (1990)[24] Hiện nay, mô hình của Fearon và Vogelstein vẫn được chấp nhận rộng rãi và được coi là mô hình mẫu phát sinh u đặc. Một phiên bản sửa đổi của mô hình mô tả con đường biến đổi di truyền chủ yếu ở bệnh nhân UTĐTT, được mô tả ở hình 1.2 - con đường mất ổn định nhiễm sắc thể (CIN: chromosomal instability). Ngoài ra, các con đường biến đổi di truyền khác làm phát sinh UTĐTT cũng được nghiên cứu và đề xuất là con đường mất ổn định vi vệ tinh (MSI: microsatellites instability) và thay đổi di truyền biểu sinh (epigenetic alterations)[25].

Các con đường hình thành UTĐTT *Nguồn: Eric R Feason (2011)[25] 1. Con đường mất ổn định nhiễm sắc thể Khoảng 80% bệnh nhân UTĐTT mất ổn định nhiễm sắc thể: tăng, giảm và chuyển đoạn, tạo ra các khuếch đại, mất và sắp xếp lại gen, dẫn tới thay đổi cả về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể. Về số lượng nhiễm sắc thể có thể là mất hoặc tăng số lượng nhiễm sắc thể. Cấu trúc nhiễm sắc bị thay đổi có thể gây ra mất cân bằng alen, thường dẫn tới việc kích hoạt đột biến gen KRAS và hiện tượng mất dị hợp tử (loss of heterozygosity – LOH) gen ức chế khối u p53, gen APC và gen DDC.

Các đột biến trên đẩy nhanh việc tích lũy các đột biến cần thiết cho quá trình chuyển từ tế bào niêm mạc lành tính thành tế bào ung thư biểu mô[3]. Con đường mất ổn định vệ tinh Rải rác ở bộ gen có các đoạn lặp lại đơn giản. Sự lặp đi lặp lại tạo thành các đơn vị lặp gồm từ một cặp base đến hàng nghìn cặp base. Những đơn vị lặp gồm từ một đến sáu cặp base gọi là vi vệ tinh (microsatellite).

Vi vệ tinh chiếm khoảng 3% bộ gen người, phổ biến nhất là chuỗi lặp gồm Cytosine (C) và Adenine (A). Chiều dài của vi vệ tinh khác nhau ở từng cá thể, tuy 7 nhiên giống nhau giữa các tế bào của cùng một cơ thể và là một dấu ấn đặc trưng cho mỗi người. Khi những sai sót trong quá trình tái bản DNA không được phát hiện và sửa chữa bởi hệ thống sửa lỗi ghép cặp DNA (DNA mismatch repair – DNA MMR) sẽ dẫn tới hình thành các đột biến và kéo dài đoạn vi vệ tinh. Do đó, mất ổn định vi vệ tinh được biểu hiện bởi sự tăng chiều dài đoạn vi vệ tinh, là hậu quả của sự suy giảm chức năng hệ thống sửa lỗi ghép cặp DNA[26].

Khoảng 15% bệnh nhân UTĐTT có số nhiễm sắc thể chỉnh bội nhưng suy giảm chức năng của hệ thống sửa lỗi ghép cặp DNA, dẫn đến mang hàng ngàn lần chèn và xóa đoạn vi vệ tinh[3]. Con đường liên quan đến thay đổi di truyền biểu sinh Các quá trình thay đổi biểu sinh (hay còn gọi là di truyền ngoại gen – epigenetics) được mô tả là một trong những con đường thay thế của quá trình phát sinh UTĐTT, mặc dù không làm thay đổi trình tự các gen liên quan. Những thay đổi biểu sinh này tạo ra sự mất ổn định hệ gen thông qua sự bất hoạt của hệ thống gen sửa chữa. Di truyền biểu sinh gồm có các thay đổi methyl hóa DNA, thay đổi histone và các microRNA không mã hóa.

Trong đó, thay đổi methyl hóa DNA đóng vai trò quan trọng nhất[27]. Methyl hóa DNA thường xảy ra ở vị trí 5’ trên vòng cytosine trong các chuỗi dinucleotide CpG tập trung ở các đảo CpG. Việc methyl hóa đảo CpG có liên quan đến việc bất hoạt các gen ức chế khối u và gen sửa chữa DNA, trong đó có các gen tham gia vào hệ thống sửa lỗi ghép cặp DNA, kết quả là dẫn tới ung thư [3, 27]. Các đột biến gen và đường truyền tín hiệu thường gặp trong ung thư đại trực tràng Thông qua các con đường biến đổi di truyền kể trên, tế bào biểu mô niêm mạc đại trực tràng tích lũy các đột biến gen để biến đổi về mặt hình thái và đạt được kiểu hình ác tính.

Các nghiên cứu ước tính rằng trung bình có 81 đột biến gen trên mỗi UTĐTT[3]. Gen APC và đường truyền tín hiệu Wnt 8 Gen APC (Adenomatous Polyposis Coli) nằm ở cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5q21). Gen APC mã hóa protein APC có trọng lượng phân tử xấp xỉ 300kDa, tham gia vào đường truyền tín hiệu Wnt[3, 28]. Khi không có tín hiệu Wnt, β-catenin thường xuyên bị các enzyme phân hủy.

Các glycoprotein Wnt biến đổi lipid tham gia vào phức hợp đồng thụ thể Frizzled-LRP5/6 để tạo một phức hợp ức chế bao gồm AXIN và sản phẩm của gen APC. Phức hợp này thường nhắm mục tiêu β-catenin, làm cho β-catenin bào tương không phân hủy bởi các enzyme phân hủy protein (Hình 1. Do đó, tín hiệu Wnt ổn định β-catenin tế bào, giúp chuyển hóa vào nhân và kết hợp với các mục tiêu phiên mã, kết quả cuối cùng là thúc đẩy sự sao chép của tế bào[28]. Sơ lược về đường truyền tín hiệu Wnt *Nguồn: Shivdasani RA (2018)[3] Khi gen APC bị đột biến làm cho protein APC bị biến đổi, dẫn đến không tạo được phức hợp phá hủy β-catenin.

Do đó, mặc dù không có tín hiệu từ các protein Wnt, mức β-catenin bào tương vẫn tăng lên, chuyển vào nhân và dẫn đến liên tục sao chép các gen đích, làm cho tế bào tăng sinh quá mức và tạo 9 thành u[28]. Gen sinh ung thư KRAS, NRAS, BRAF và đường truyền tín hiệu MAPK KRAS bị đột biến ở khoảng 40% UTĐTT và NRAS trong khoảng 5% trường hợp khác. Đột biến KRAS xuất hiện ngay cả ở những tổn thương có tiềm năng ác tính thấp, chẳng hạn như ở các tiền u tuyến và polyp rất nhỏ và tần số của chúng tăng theo kích thước tổn thương[3, 29]. BRAF bị đột biến ở khoảng 10% UTĐTT, V600E là đột biến BRAF phổ biến nhất ở UTĐTT, melanoma và các bệnh ung thư khác.

Đột biến KRAS và BRAF là loại trừ lẫn nhau trong UTĐTT, cho thấy rằng chúng đại diện cho các cách luân phiên nhau đến cùng một tín hiệu kết thúc.