Tổng quan nghiên cứu

Ngộ độc thực phẩm là vấn đề ngày càng nghiêm trọng tại Việt Nam, với khoảng 200-600 vụ mỗi năm và hơn 5.000 nạn nhân, trong đó khoảng 50% nguyên nhân do vi sinh vật. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) là tác nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh tiêu chảy nghiêm trọng. Đặc biệt, các chủng Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) như O157 và O111 sản sinh độc tố Shiga (Stx) có thể gây viêm đại tràng xuất huyết, tiêu chảy ra máu và hội chứng tán huyết – ure huyết (HUS), dẫn đến suy thận và tử vong. Tại Hà Nội, thịt lợn, thịt gà và thịt bò là những nguồn thực phẩm phổ biến có nguy cơ nhiễm E. coli độc lực cao.

Mục tiêu nghiên cứu là khảo sát các thông số phản ứng multiplex PCR (m-PCR) để phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli và xác định tỷ lệ nhiễm các gen này trong các mẫu thịt thu mua tại một số chợ, siêu thị ở Hà Nội trong khoảng thời gian từ tháng 4/2022 đến tháng 3/2023. Nghiên cứu nhằm cung cấp dữ liệu khoa học phục vụ cảnh báo sớm và kiểm soát nguy cơ ngộ độc thực phẩm do E. coli, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết về đặc điểm sinh học và cơ chế độc lực của vi khuẩn Escherichia coli, tập trung vào các gen mã hóa yếu tố độc lực như stx1, stx2 (độc tố Shiga), eaeA (yếu tố bám dính intimin), và hlyA (yếu tố gây tan máu alpha-hemolysin). Các chủng EHEC O157 và O111 được phân loại theo nhóm phả hệ di truyền A, B1, B2, D dựa trên gen chuA, yjaA và TspE4.C2. Hệ thống tiết loại 1, 3 và 5 của vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc bài tiết độc tố và bám dính tế bào vật chủ, góp phần vào cơ chế gây bệnh.

Phương pháp multiplex PCR được lựa chọn để phát hiện đồng thời nhiều gen đích trong một phản ứng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời đảm bảo độ nhạy và đặc hiệu cao. Các cặp mồi được lựa chọn và kiểm tra kỹ lưỡng bằng phần mềm tin sinh học để đảm bảo nhiệt độ bắt cặp phù hợp và tránh tạo sản phẩm phụ.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu gồm 316 mẫu thịt lợn (155 mẫu), thịt bò (80 mẫu) và thịt gà (81 mẫu) thu mua ngẫu nhiên tại các chợ và siêu thị ở Hà Nội từ tháng 4/2022 đến tháng 3/2023. Mẫu được bảo quản ở 10°C và xử lý trong phòng thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu là mô tả cắt ngang, sử dụng công thức tính cỡ mẫu dựa trên tỷ lệ lưu hành kỳ vọng từ các nghiên cứu trước. Mẫu được nuôi cấy chọn lọc trên môi trường Tryptone và Peptone ở 44,5-45°C trong 20 giờ để tăng sinh vi khuẩn E. coli phân lập. ADN được tách chiết từ dung dịch tăng sinh vi khuẩn bằng kit AmpliSens® RIBO-prep.

Phản ứng multiplex PCR được tiến hành với 3 set mồi: phân nhóm phả hệ (chuA, yjaA, TspE4.C2), gen độc lực (stx1, stx2, eaeA, hlyA), và gen chủng O157, O111. Nhiệt độ gắn mồi được khảo sát từ 53-57°C, lựa chọn 55°C là tối ưu. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và quan sát bằng máy GelDocXR Plus. Dữ liệu được xử lý bằng Microsoft Excel, kiểm định thống kê bằng T-test mẫu độc lập với mức ý nghĩa p < 0,05.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Khảo sát nhiệt độ gắn mồi PCR đơn và đa mồi:

    • Nhiệt độ 55°C cho kết quả băng sản phẩm rõ nét, đặc hiệu, không có sản phẩm phụ cho tất cả các gen đích.
    • Phản ứng PCR đa mồi với 3 set mồi cho kết quả ổn định, băng sản phẩm sáng rõ, không nhiễu.

  2. Phân nhóm phả hệ E. coli trong mẫu thịt:

    • Nhóm A chiếm tỷ lệ cao nhất: 43,04% (Tryptone), 50,63% (Peptone).
    • Nhóm B2 chiếm 41,77% (Tryptone), 32,91% (Peptone).
    • Nhóm D chiếm khoảng 12%.
    • Nhóm B1 chiếm tỷ lệ thấp nhất, dưới 5%.
    • Tỷ lệ phân nhóm B2 và D có sự khác biệt ý nghĩa giữa các loại thịt (p < 0,05).

  3. Tỷ lệ nhiễm các gen độc lực:

    • Tổng tỷ lệ gen stx1 là 9,49%, stx2 là 7,28%, eaeA là 5,06%.
    • Gen hlyA ít gặp, chỉ 0,63%.
    • Gen O157 xuất hiện ở 14,24% mẫu, O111 ở 1,90%.
    • Tỷ lệ gen độc lực cao nhất ở thịt lợn và thịt gà, thấp hơn ở thịt bò.
    • Sự khác biệt tỷ lệ gen eaeA và O111 giữa các loại thịt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

  4. Môi trường nuôi cấy:

    • Môi trường Tryptone và Peptone đều phù hợp cho tăng sinh E. coli, tuy nhiên tỷ lệ phát hiện gen độc lực có sự khác biệt nhẹ giữa hai môi trường.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật multiplex PCR với nhiệt độ gắn mồi 55°C là phương pháp hiệu quả, cho phép phát hiện đồng thời nhiều gen độc lực của E. coli trong mẫu thịt. Tỷ lệ phân nhóm phả hệ B2 và D cao ở thịt lợn và thịt gà phản ánh nguy cơ cao của các chủng gây bệnh đường ruột và nhiễm khuẩn huyết.

Tỷ lệ gen độc lực stx1, stx2 và eaeA tương đối cao, đặc biệt gen O157 chiếm hơn 14%, cho thấy nguy cơ ngộ độc thực phẩm do EHEC tại Hà Nội là đáng báo động. So sánh với các nghiên cứu trong nước và quốc tế, tỷ lệ này tương đồng hoặc cao hơn, phản ánh sự cần thiết của các biện pháp kiểm soát chặt chẽ hơn trong chuỗi cung ứng thịt.

Việc sử dụng hai môi trường nuôi cấy giúp tăng độ nhạy phát hiện các chủng E. coli khác nhau, đặc biệt các chủng không lên men lactose như O157. Dữ liệu này có thể được trình bày qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ phân nhóm phả hệ và gen độc lực theo loại thịt và môi trường nuôi cấy, giúp minh họa rõ ràng sự khác biệt và mức độ nguy cơ.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tăng cường kiểm soát chất lượng thịt tại các chợ, siêu thị:

    • Thực hiện kiểm tra định kỳ bằng kỹ thuật multiplex PCR để phát hiện sớm các gen độc lực của E. coli.
    • Mục tiêu giảm tỷ lệ mẫu thịt nhiễm gen độc lực xuống dưới 5% trong vòng 2 năm.
    • Chủ thể thực hiện: Ban quản lý an toàn thực phẩm, các cơ sở kinh doanh thịt.

  2. Đào tạo và nâng cao nhận thức cho người chế biến thực phẩm:

    • Tổ chức các khóa tập huấn về vệ sinh an toàn thực phẩm, phòng tránh lây nhiễm chéo.
    • Mục tiêu giảm tỷ lệ nhiễm khuẩn trên tay người chế biến xuống dưới 10% trong 1 năm.
    • Chủ thể thực hiện: Trung tâm y tế dự phòng, các tổ chức xã hội.

  3. Xây dựng quy trình chuẩn trong nuôi cấy và phát hiện vi khuẩn gây bệnh:

    • Áp dụng quy trình chuẩn mực sử dụng môi trường Tryptone và Peptone kết hợp multiplex PCR trong các phòng xét nghiệm.
    • Mục tiêu nâng cao độ chính xác và nhanh chóng trong phát hiện vi khuẩn độc lực.
    • Chủ thể thực hiện: Các phòng xét nghiệm y tế, viện nghiên cứu.

  4. Tăng cường giám sát dịch tễ và nghiên cứu mở rộng:

    • Mở rộng khảo sát các loại thực phẩm khác và khu vực địa lý khác để đánh giá nguy cơ toàn diện.
    • Mục tiêu xây dựng cơ sở dữ liệu quốc gia về vi khuẩn E. coli độc lực trong thực phẩm trong 3 năm tới.
    • Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, các trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà quản lý an toàn thực phẩm:

    • Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm, đặc biệt thịt tươi sống.
    • Use case: Thiết lập quy trình kiểm tra định kỳ và cảnh báo sớm nguy cơ ngộ độc thực phẩm.

  2. Nhà nghiên cứu vi sinh và y học phân tử:

    • Áp dụng phương pháp multiplex PCR đã được tối ưu để phát hiện gen độc lực trong các nghiên cứu tiếp theo.
    • Use case: Nghiên cứu đa dạng chủng E. coli và cơ chế độc lực.

  3. Cơ sở sản xuất và kinh doanh thực phẩm:

    • Nâng cao chất lượng sản phẩm, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm dựa trên dữ liệu tỷ lệ nhiễm khuẩn.
    • Use case: Đào tạo nhân viên, áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng.

  4. Cơ quan y tế dự phòng và phòng chống dịch bệnh:

    • Sử dụng dữ liệu để giám sát và phòng ngừa các đợt bùng phát ngộ độc thực phẩm do E. coli.
    • Use case: Lập kế hoạch can thiệp kịp thời khi phát hiện nguy cơ cao.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phản ứng multiplex PCR có ưu điểm gì so với PCR đơn mồi?
    Phản ứng multiplex PCR cho phép khuếch đại đồng thời nhiều gen trong một phản ứng, tiết kiệm thời gian, chi phí và mẫu thử. Ví dụ, trong nghiên cứu này, 3 set mồi được sử dụng để phát hiện đồng thời gen độc lực và phân nhóm phả hệ của E. coli.

  2. Tại sao chọn nhiệt độ gắn mồi 55°C cho phản ứng PCR?
    Nhiệt độ 55°C cho kết quả băng sản phẩm rõ nét, đặc hiệu, không có sản phẩm phụ gây nhiễu, đảm bảo độ chính xác cao trong phát hiện gen. Các nhiệt độ khác cho kết quả kém hơn hoặc có sản phẩm phụ.

  3. Tỷ lệ nhiễm gen độc lực của E. coli trong thịt tại Hà Nội như thế nào?
    Tỷ lệ gen stx1 là khoảng 9,49%, stx2 là 7,28%, eaeA là 5,06%, gen O157 chiếm 14,24%. Tỷ lệ này cho thấy nguy cơ ngộ độc thực phẩm do EHEC là đáng lưu ý.

  4. Môi trường nuôi cấy nào phù hợp để tăng sinh E. coli gây bệnh?
    Môi trường Tryptone và Peptone đều phù hợp, trong đó Tryptone giúp vi khuẩn chống stress oxy hóa, còn Peptone tăng tính chọn lọc cho các chủng không lên men lactose như O157.

  5. Làm thế nào để giảm nguy cơ ngộ độc thực phẩm do E. coli?
    Cần tăng cường kiểm soát chất lượng thịt, đào tạo người chế biến, áp dụng kỹ thuật phát hiện nhanh gen độc lực, và giám sát dịch tễ thường xuyên. Ví dụ, kiểm tra định kỳ bằng multiplex PCR giúp phát hiện sớm và ngăn ngừa nguy cơ.

Kết luận

  • Đã xây dựng và tối ưu thành công quy trình multiplex PCR phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli với nhiệt độ gắn mồi 55°C.
  • Tỷ lệ phân nhóm phả hệ B2 và D, cùng các gen độc lực stx1, stx2, eaeA và hlyA được phát hiện với tỷ lệ đáng kể trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò tại Hà Nội.
  • Gen chủng O157 chiếm tỷ lệ cao nhất trong các mẫu thịt, cảnh báo nguy cơ ngộ độc thực phẩm do EHEC.
  • Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc giám sát, cảnh báo và kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam.
  • Đề xuất triển khai kiểm tra định kỳ, đào tạo người chế biến và mở rộng nghiên cứu để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Next steps: Triển khai áp dụng quy trình multiplex PCR trong các phòng xét nghiệm, mở rộng khảo sát trên các loại thực phẩm khác và khu vực địa lý rộng hơn.

Call-to-action: Các cơ quan quản lý và phòng thí nghiệm cần phối hợp để áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn nhằm giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Escherichia coli.