ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết, tuy đã có nhiều cảnh báo nhưng số ca ngộ độc thực phẩm vẫn đang gia tăng với tính chất ngày càng nghiêm trọng. Theo số liệu thống kê năm 2010 của Cục vệ sinh An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 200-600 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.000 nạn nhân, trong đó có vài chục ca tử vong [1]. Khoảng 20 – 30% là ngộ độc do hoá chất, khoảng 50% là do vi sinh vật, 14% - 20% do thức ăn có độc…[1] Escherichia coli là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy, trong đó, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hay E. coli sinh độc tố Shiga (STEC) là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra bệnh viêm đại tràng xuất huyết, tiêu chảy ra máu,.
và cũng là một trong những nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh do thực phẩm ở người [2]. Yếu tố độc lực của EHEC đã được xác định là do độc tố Shiga (Stxs), ngoài ra, hầu hết các dòng EHEC O157 có tập hợp đầy đủ các gen độc lực eae mã hóa yếu tố bám dính và hlyA mã hóa yếu tố gây tan máu [3], các độc tố này gây tiêu chảy nghiêm trọng, nguy cơ cao dẫn đến hội chứng tán huyết – ure huyết (HUS – Hemolytic Uremic Syndrome) và suy thận ở người bệnh [4, 5]. Chúng cũng chính là tác nhân gây ra các đợt bùng phát lớn với những ghi nhận tử vong gây ra bởi E. coli tại các quốc gia phát triển như Mỹ [6], Đức [7], … Ngoài ra, chủng EHEC O111 cũng đã được báo cáo gây ra các đợt bùng phát ở Tây Âu và Nhật Bản, với ghi nhận có ca tử vong và nhiều ca mắc hội chứng HUS [8].
Escherichia coli cũng chính là một trong ba vi khuẩn được xác định là nguyên nhân gây ra ngộ độc tập thể tại một trường học tại Việt Nam vào tháng 11 năm 2022, khiến một học sinh tử vong, việc này càng làm rõ hơn mức độ nguy hiểm mà vi khuẩn này gây ra với sức khoẻ cộng đồng. Đứng trước sự gia tăng các ca ngộ độc thực phẩm hàng năm, việc đưa ra lời cảnh báo sớm và ngăn chặn là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan trọng của việc bảo vệ sức khỏe con người, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại Hà Nội” với mục tiêu: 1 1. Khảo sát một số thông số của phản ứng multiplex PCR để phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli 2.
Phát hiện được các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại Hà Nội. 2 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1. Đặc điểm sinh học 1. Đặc điểm hình thể Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy tiện, hình que ngắn, kích thước khoảng 1-3m x 0,4 – 0,7m.
Hầu hết vi khuẩn có lông ở xung quanh thân nên di động được, một số chủng có vỏ, không sinh bào tử. Bình thường E. coli sống trong đường ruột của người, động vật máu nóng và chim. Đặc tính nuôi cấy Escherichia coli (E.
coli) phát triển tốt trong nhiệt độ dao động từ 21 – 49C, tối ưu ở khoảng 37C và mức tối thiểu để đăng trưởng có thể đo được là 7,5C; Tế bào sống sót tốt trong thực phẩm ở -20C, và bị giết chết ở 64,3C. Giới hạn ô nhiễm vi khuẩn E. coli trong thịt Năm 2012, Bộ Y Tế đã ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm: QCVN số 8-3:2012/BYT, trong đó quy định giới hạn ô nhiễm vi sinh vật: E. coli trong thịt và sản phẩm chế biến từ thịt phải qua xử lý nhiệt trước khi sử dụng, với: giới hạn dưới (m): 5x102 và giới hạn trên (M): 5x103 m: giới hạn dưới, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm tất cả các kết quả không vượt quá giá trị m là đạt.
M: giới hạn trên, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm chỉ 01 mẫu cho kết quả vượt quá giá trị M là không đạt 3 Trong đó, số mẫu cần lấy từ lô hàng để kiểm nghiệm là 5; mẫu kiểm nghiệm được phép có tối đa 2 mẫu cho kết quả kiểm nghiệm nằm giữa m và M. Phân loại Escherichia coli Thông thường, E. coli và vật chủ người của nó cùng tồn tại trong tình trạng sức khoẻ tốt cùng có lợi, và là thành phần cấu thành nên hệ vi sinh vật đường ruột ở người. Chúng hiếm khi gây bệnh, thậm chí, một số chủng E.
coli còn có lợi cho vật chủ như việc tạo ra khu hệ cộng sinh vi sinh vật nhằm ngăn chặn các tác nhân gây bệnh khác hay tạo ra vitamin K2 [9, 10]. Tuy nhiên, một số chủng E. coli đã tiến hoá, phát triển, tăng khả năng thích nghi trong vật chủ và cho phép chúng gây ra nhiều loại bệnh cho những người khoẻ mạnh. Ba hội chứng lâm sàng phổ biến gây bởi E.
coli: Bệnh đường ruột/tiêu chảy, nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm trùng huyết/viêm màng não [11]. Trong số các chủng gây bệnh đường ruột, có sáu chủng được mô tả rõ ràng: EPEC (Entero pathogenic E. coli gây bệnh đường ruột: EPEC gây bệnh tiêu chảy nặng ở trẻ sơ sinh. Nguồn lây nhiễm EPEC thường do nguồn nước bị ô nhiễm cũng như các sản phẩm thịt không đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm.
Có chế bệnh sinh của EPEC liên quan tới protein intimin mã hoá bởi gen eae là yếu tố bám dính bề mặt tế bào ruột [12]. Do đó, EPEC có thể phát hiện bằng các kĩ thuật sinh học phân tử cũng như nuôi cấy tế bào Hep-2 [13]. coli gây độc đường ruột: ETEC thường gây ra ra bệnh tiêu chảy nhưng rất ít khi sốt hay sốt nhẹ. Tính chất bệnh sinh của ETEC là do vi khuẩn có khả sinh một số độc tố ruột như độc tố ruột không bền với nhiệt (heat- labile enterotoxin, độc tố này có tính chất giống với độc tố ở vi khuẩn gây bệnh tả Cholera spp.
Bên cạnh đó, ETEC cũng có thể tổng hợp một số độc tố bền với nhiệt (Heat-Stable toxin - ST, chúng chịu được 30 phút ở 100C). Có một số phương pháp phát hiện chủng ETEC như ngưng kết miễn dịch dùng hạt latex, ELISA, PCR, phương pháp lai phân tử và giải trình tự gen. coli xâm nhập đường ruột. EIEC có nhiều đặc điểm giống với Shigella khi chúng gây nhiễm đường ruột với triệu chứng giống bệnh lị [14].
Giống như Shigella, chúng ta không biết rõ đâu là ổ bệnh thiên nhiên hay vật chủ 4 mang EIEC. Không giống các chủng E. coli khác, EIEC không di động, không lên men đường lactose, không sử dụng decarboxylate lysin và không có khả năng sống trong điều kiện kị khí. Tính chất bệnh sinh của EIEC chủ yếu là do khả năng xâm nhập và phá huỷ các mô ở ruột non.
Kiểu hình của EIEC được mã hoá bởi plasmid khá lớn, chúng ta có thể phát hiện EIEC bằng các kĩ thuật xét nghiệm sinh học phân tử và thí nghiệm xâm nhập tế bào HeLA hay Hep-2 [15] EAEC (Enteroaggregative E. EAEC được đặc trưng bởi khả năng kết dính trong các hệ thống nuôi cấy mô dưới dạng tập hợp. Ở trẻ nhỏ, những nhóm này gây nhiễm trùng tiêu chảy không ra máu. EAEC gây tiêu chảy phân nước, nhầy, thường không có máu và không sốt liên quan đến nhiễm trùng [16].
Đã có ghi nhận bùng phát dịch tiêu chảy gây ra bởi EAEC tại miền nam Ấn Độ, nguyên nhân do nguồn nước từ giếng cạn có chứa chủng vi khuẩn này [17]. DAEC (Diffusely adherent E. coli bám dính khuếch tán. DAEC gây ra hiệu ứng dẫn truyền tín hiệu đặc trưng trong các tế bào ruột non, biểu hiện là sự phát triển của các tế bào dài giống như ngón tay, bọc xung quanh vi khuẩn [11].
Theo nghiên cứu, chúng có mối liên quan đến việc gây tiêu chảy ở trẻ em phụ thuộc vào tuổi; cụ thể, ở trẻ em <12 tháng tuổi, sự hiện diện của DAEC không liên quan đáng kể đến tiêu chảy. Ngược lại, DAEC có liên quan đáng kể đến tiêu chảy ở trẻ >12 tháng tuổi [18]. coli gây xuất huyết đường ruột. EHEC gây tiêu chảy ra máu do khả năng biểu hiện độc tố Shiga 1 (mã hóa bởi gen stx1) và/hoặc độc tố Shiga 2 (mã hóa bởi gen stx2).
Ở chủng EHEC có biểu hiện Stx2, chúng dẫn đến tiêu chảy ra máu và cũng có thể biểu hiện Stx1, trong khi chủng vi khuẩn không biểu hiện Stx2 không gây tiêu chảy ra máu. Stxs là một nhóm các độc tố protein AB của vi khuẩn, bao gồm một tiểu đơn vị A và năm tiểu đơn vị B giống hệt nhau có khả năng ức chế tổng hợp protein thông qua khả năng nhắm mục tiêu vào các ribosome của sinh vật nhân thực (eukaryote). Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm ức chế tổng hợp protein, trong khi năm tiểu đơn vị B liên kết với glycosphingolipid Gb3 – một thụ thể trên các tế bào nội mô. Sự ức chế tổng hợp protein gây chết tế bào ruột và dẫn đến viêm đại tràng [19].
Bộ gen của EHEC cũng có chứa gen eae mã hóa intimin, 5 là chất kết dính chính của nó, sau khi EHEC gắn vào và tạo ra tổn thương cục bộ ở ruột, độc tố Stx xâm nhập vào vật chủ và di chuyển đến các tế bào biểu mô của cơ quan đích. Tế bào biểu mô cầu thận bị tổn thương tương tự như tế bào ruột, gây chết tế bào theo chương trình và tách ra hỏi màng tế bào. Sự đẩy ra của tế bào làm lộ collagen, thường không có trong mạch máu kích hoạt tiểu cầu, hình thành huyết khối, kích hoạt quá trình đông máu gây giảm tiểu cầu. Các tế bào nội mô bị tổn thương như vậy cũng trở thành nơi bám dính của bạch cầu, hậu quả là thận bị tổn thương thêm.
Tình trạng này dẫn đến hội chứng tán huyết - urê huyết (HUS) được đặc trưng bởi: thiếu máu huyết tán vi mạch, giảm tiểu cầu và suy thận [19, 20]. Coli theo nhóm phả hệ di truyền: Các chủng E. coli chủ yếu thuộc vào 1 trong 4 nhóm phả hệ di truyền (phylogenetic group) là A, B1, B2, và D. Trong đó các chủng thuộc nhóm B2 và D thường chứa các yếu tố độc lực liên quan tới các chủng không lưu hành ở hệ đường ruột của động vật máu nóng (extraintestinal infections - ExPEC) [21].