Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, cung cấp thông tin quan trọng cho điều trị và chẩn đoán.

• Tác giả: Nguyễn Thị Như Quỳnh
• Người hướng dẫn: PGS. Trịnh Hồng Thái
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter thuộc gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Khái quát về ung thư đại trực tràng
• 1.2. Ung thư đại trực tràng
• 1.3. Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng
• 1.4. Chẩn đoán và điều trị bệnh
• 1.5. Các giai đoạn của UTĐTT
• 1.6. Khái quát chung về họ Matrix Metalloprotease (MMPs)
• 1.7. Vai trò của họ Matrix Metalloproteinase
• 1.8. Một số nghiên cứu về họ MMP ở ung thư đại trực tràng
• 1.9. Một số nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide trên các gen MMP
• 1.10. Một số nghiên cứu về đa hình vùng promoter gen MMP-9
• 2. CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp tiến hành nghiên cứu
• 2.3. Tách chiết ADN tổng số từ mô
• 2.4. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu
• 2.5. Khuếch đại đoạn gen trên vùng promoter của gen MMP-9 bằng phương pháp PCR
• 2.6. Phương pháp RFLP
• 2.7. Tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.8. Giải trình tự trực tiếp
• 2.9. Nhân dòng phân tử
• 2.10. Xử lý số liệu và tính toán thống kê
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô của bệnh nhân UTĐTT
• 3.2. Kết quả phân tích biến đổi của gen MMP-9 bằng kỹ thuật PCR-RFLP
• 3.3. Kết quả giải trình tự trực tiếp và nhân dòng
• 3.4. Kết quả phân tích biến đổi ADN của gen MMP-9 từ mẫu máu
• 3.5. Kết quả khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi của promoter gen MMP-9
• 3.6. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi trong vùng promoter gen MMP-9
• 3.7. Phân tích mối liên hệ giữa biến đổi C-1562T với một số đặc điểm bệnh học của bệnh nhân UTĐTT
• 3.8. Phân tích biến đổi C-1562T ở bệnh nhân UTĐTT và người bình thường
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP 9

Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. Gen MMP-9 đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và di căn của tế bào ung thư. Việc hiểu rõ về các biến đổi trong vùng promoter của gen này có thể giúp xác định các yếu tố nguy cơ và cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về cơ chế hoạt động của gen MMP-9 mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân.

1.1. Khái niệm về ADN vùng promoter và gen MMP 9

ADN vùng promoter là phần quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen. Gen MMP-9, một thành viên trong họ matrix metalloproteinase, có vai trò chính trong việc phân giải chất nền ngoại bào. Biến đổi trong vùng promoter của gen này có thể ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của MMP-9, từ đó tác động đến sự phát triển của ung thư.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu biến đổi ADN trong ung thư

Nghiên cứu biến đổi ADN trong vùng promoter gen MMP-9 có thể giúp xác định mối liên hệ giữa các biến đổi gen và sự phát triển của ung thư đại trực tràng. Điều này có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới, giúp cải thiện tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu biến đổi ADN

Mặc dù nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 mang lại nhiều tiềm năng, nhưng cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là sự đa dạng di truyền giữa các bệnh nhân, điều này có thể làm khó khăn trong việc xác định các biến đổi cụ thể có liên quan đến ung thư. Hơn nữa, việc thu thập mẫu và phân tích dữ liệu cũng đòi hỏi kỹ thuật cao và chi phí lớn.

2.1. Đa dạng di truyền và ảnh hưởng đến nghiên cứu

Sự đa dạng di truyền giữa các cá thể có thể dẫn đến những khác biệt trong biểu hiện của gen MMP-9. Điều này làm cho việc xác định các biến đổi ADN có liên quan đến ung thư trở nên phức tạp hơn.

2.2. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và phân tích

Việc thu thập mẫu từ bệnh nhân ung thư đại trực tràng cần phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt về đạo đức và y tế. Hơn nữa, các phương pháp phân tích gen yêu cầu thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có trình độ cao, điều này có thể làm tăng chi phí nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP 9

Để nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9, nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được áp dụng. Các phương pháp này bao gồm tách chiết ADN, khuếch đại gen bằng PCR, và phân tích RFLP. Những kỹ thuật này cho phép xác định các biến đổi cụ thể trong vùng promoter và đánh giá mối liên hệ với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân.

3.1. Tách chiết ADN từ mẫu mô và máu

Quá trình tách chiết ADN từ mẫu mô và máu là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Việc sử dụng các bộ kit tách chiết ADN hiện đại giúp đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của ADN thu được, từ đó nâng cao độ chính xác trong các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Khuếch đại gen MMP 9 bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại đoạn gen MMP-9 từ ADN đã tách chiết. Kỹ thuật này cho phép tạo ra số lượng lớn bản sao của gen cần nghiên cứu, giúp dễ dàng hơn trong việc phân tích các biến đổi gen.

3.3. Phân tích RFLP để xác định biến đổi gen

Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là một kỹ thuật quan trọng trong việc xác định các biến đổi trong vùng promoter gen MMP-9. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các biến đổi điểm trong ADN thông qua việc cắt ADN bằng enzyme giới hạn và phân tích chiều dài các đoạn cắt.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 đã chỉ ra rằng có sự khác biệt rõ rệt giữa các bệnh nhân ung thư đại trực tràng và nhóm đối chứng. Những biến đổi này có thể liên quan đến mức độ biểu hiện của MMP-9 và ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh. Các kết quả này không chỉ có giá trị trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh mà còn có thể được ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư.

4.1. Phân tích biến đổi ADN ở bệnh nhân ung thư

Kết quả phân tích cho thấy một số biến đổi ADN trong vùng promoter gen MMP-9 có liên quan đến sự gia tăng mức độ biểu hiện của MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng. Điều này cho thấy mối liên hệ giữa biến đổi gen và sự phát triển của bệnh.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Những phát hiện từ nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm và điều trị ung thư đại trực tràng. Việc xác định các biến đổi gen có thể giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị chính xác hơn cho bệnh nhân.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu biến đổi ADN vùng promoter gen MMP-9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng mở ra nhiều triển vọng trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các biến đổi gen cụ thể và mối liên hệ của chúng với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã xác định được một số biến đổi ADN trong vùng promoter gen MMP-9 có liên quan đến ung thư đại trực tràng. Những phát hiện này có thể giúp cải thiện hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của ung thư.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị dựa trên các biến đổi gen đã xác định. Điều này có thể mở ra hướng đi mới trong việc điều trị ung thư đại trực tràng, giúp nâng cao tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái quát về ung thư đại trực tràng Ung thư là một loại bệnh liên quan tới sự tăng sinh về mặt số lượng một cách nhanh chóng và không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể. Các tế bào bất thường này có thể xâm nhập vào các mô lân cận hoặc di chuyển đến các mô ở vị trí xa bằng cách xâm nhập vào mạch máu hoặc hệ bạch huyết. Chúng sẽ tập trung lại và tiêu diệt các tế bào bình thường dẫn đến suy thoái chức năng của các bộ phận mà chúng tiến đến [55].

Ung thư đại trực tràng Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) thường xảy ra tại các mô đại tràng (phần dài nhất của ruột già) hoặc trực tràng (vài inch cuối cùng của ruột già trước hậu môn). Đại tràng là phần ruột lớn hình chữ N bao gồm đại tràng lên (ascending colon), đại tràng ngang (transverse colon) và đại tràng xuống (descending colon). Ung thư thường xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng, thường hai loại ung thư này có liên hệ với nhau và khó có thể xác định ung thư nào xảy ra trước, ung thư nào xảy ra sau vì thế thường được gọi chung là ung thư đại trực tràng [53]. Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng [56] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến UTĐTT liên quan đến sự biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mô đại trực tràng bình thường. Thống kê các tài liệu tổng quan cho thấy có 2 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh này là: 1. Yếu tố di truyền - Sai hỏng trong gen: Các tế bào có thể tăng sinh không kiểm soát nếu có sai hỏng ADN. Đặc biệt nếu sự sai hỏng này làm tổn thương tới các gen liên quan đến quá trình phân chia tế bào.

Như bốn nhóm gen chính chịu trách nhiệm cho quá trình phân chia tế bào: Các gen gây ung thý oncogenes; các gen ức chế khối u nhý p21, p53; các gen kiểm soát quá trình apoptosis và nhóm các gen sửa chữa ADN. Ung thý xảy ra khi tế bào có ðột biến gen làm cho tế bào không thể tự sửa chữa ADN bị tổn thýõng vì vậy không thể ði vào quá trình chết theo chu trình. Bên cạnh các ðột biến ở gen phân chia tế bào, ung thý còn là kết quả của các ðột biến gen gây ung thý và quá trình ức chế gen ức chế khối u, dẫn ðến sự tãng sinh tế bào không ðýợc kiểm soát [54]. - Di truyền theo gia ðình: Khoảng 20% UTÐTT ðýợc cho là gây ra bởi ðột biến gen di truyền.

Hội chứng di truyền có liên quan ðến UTÐTT bao gồm: FAP (đa polyp tuyến gia đình), AFAP là một kiểu nhẹ hơn FAP và HNPCC (UTĐTT di truyền không do polyp). Những biến đổi này đa phần dẫn đến ung thư ở độ tuổi còn rất trẻ [53]. - Ngoài ra còn có yếu tố dân tộc: Người Do Thái, người Mỹ gốc Phi có nguy cơ mắc bệnh UTĐTT cao hơn các dân tộc khác [3]. Yếu tố không di truyền - Chế độ dinh dưỡng: Các loại thịt đỏ (thịt bò, thịt cừu) và các loại thịt chế biến (xúc xích, thịt hun khói, đồ hộp) có thể làm tăng nguy cơ ung thư đại trực tràng.

Nấu thịt ở nhiệt độ rất cao (chiên, nướng) có thể tạo ra các hóa chất độc hại làm tăng nguy cơ ung thư. Còn chế độ ăn rau, trái cây và ngũ cốc nguyên hạt có thể làm giảm nguy cơ ung thư đại trực tràng [32]. - Vận động: Thói quen lười vận động có thể làm tăng nguy cơ ung thư [15, 26, 36]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Thừa cân: Tình trạng rất thừa cân, béo phì làm tăng nguy cơ của việc mắc và tử vong vì ung thư đại trực tràng [15].

- Hút thuốc: Những người hút thuốc trong thời gian dài cũng có nguy cơ bị ung thư đại trực tràng cao hơn những người không hút thuốc. Hút thuốc cũng làm tăng nguy cơ của nhiều loại ung thư khác [33]. - Sử dụng rượu: Người sử dụng nhiều rượu có khả năng mắc UTĐTT cao hơn những người không hoặc rất ít khi sử dụng rượu. Khoảng 15% các trường hợp mắc UTĐTT là do sử dụng quá nhiều rượu [29].

- Bệnh tật: Những người có tiền sử mắc các bệnh đường ruột như viêm ruột, viêm loét đại tràng; bệnh Crohn và đái tháo đường loại 2 cũng có nguy cơ mắc bệnh UTĐTT cao hơn người bình thường. Trong các bệnh này, đại tràng thường bị viêm trong một thời gian dài [11, 50]. Chẩn đoán và điều trị bệnh Xét nghiệm sàng lọc hay chẩn đoán có thể tìm thấy các polyp hoặc ung thư trước khi chúng phát triển. Phát hiện sớm rất có ý nghĩa bởi các bác sỹ sẽ lựa chọn được những phương pháp phù hợp cho từng bệnh nhân, từng giai đoạn bệnh, giúp quá trình điều trị bệnh hiệu quả hơn [52].

Chẩn đoán Thăm khám trực tràng: Phương pháp này chỉ phát hiện được không quá 10% trường hợp UTĐTT. Chụp hình đại tràng với chất cản quang: Phương pháp này dùng thuốc xổ cùng với dung dịch có tính cản quang (barium) sẽ được tiêm vào trong ruột già thông qua đường hậu môn khi đó hình ảnh của ruột già được hiển thị trên phim khi chụp X-quang. Xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân (FOBT): Sử dụng xét nghiệm này để xem máu có ẩn trong phân không vì mắt thường không nhìn thấy được. Xét nghiệm ADN phân: Để tìm kiếm các tế bào UTĐTT hoặc polyp tiền ung thư.

Nội soi đại trực tràng: Sử dụng ống mỏng, dễ uốn nắn có kết nối với video camera được đưa vào hậu môn, qua trực tràng và cho phép bác sỹ quan sát 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] toàn bộ đại tràng. Ngoài ra, ống soi này còn có tác dụng để cắt bỏ các khối polyp và ung thư trong khi làm xét nghiệm. Chụp cắt lớp ruột già: Sử dụng kỹ thuật cắt lớp điện toán để chụp ảnh của ruột già. Các hình ảnh sẽ được kết hợp trên máy tính để giúp bác sỹ tìm kiếm polyp hoặc ung thư.

Soi đại tràng Sigma: Cho phép nhìn thấy những khối u khi chúng còn rất nhỏ, trước cả khi chúng bị phát hiện bằng xét nghiệm tìm máu ẩn trong phân. Tuy nhiên, soi đại tràng Sigma có thể bỏ sót các khối u ở phần trên của ruột già. Chẩn đoán bằng mô học và tế bào học: Phương pháp này cho phép phân biệt giữa các tế bào bình thường, loạn sản và ung thư biểu mô tại chỗ. Phương pháp này được coi là chuẩn vàng trong việc xác định UTĐTT, có ý nghĩa rất lớn trong tiên lượng và điều trị bệnh.

Chẩn đoán phân tử: Đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện sớm và giúp các bác sỹ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp. Hiện nay, chẩn đoán phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến: PCR, Realtime PCR, FISH… có thể phát hiện những bất thường ở các gen một cách chính xác. Điều trị Phẫu thuật UTĐTT: Phẫu thuật cắt đại tràng là phương pháp duy nhất điều trị ung thư đại tràng ở giai đoạn sớm. Phương pháp phẫu thuật đại tràng qua nội soi cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân một thời gian ngắn sau mổ (ít đau) nhưng kết quả lâu dài của cắt đại tràng qua nội soi so với mổ mở thì vẫn trong giai đoạn nghiên cứu.

Trong hầu hết các trường hợp, bác sỹ sẽ phải nối lại những phần còn lành của đại tràng. Khi không thể nối lại những phần còn lành, cần phải thực hiện phẫu thuật mở thông đại tràng tạm thời hoặc vĩnh viễn. Khoảng 15% bệnh nhân ung thư đại tràng cần phải mở thông đại tràng vĩnh viễn. Hóa trị UTĐTT: Hóa trị liệu là phương pháp sử dụng thuốc chống ung thư để tiêu diệt tế bào ung thư.

Hóa trị liệu có thể được sử dụng để tiêu diệt tất cả những tế bào ung thư còn sót lại trong cơ thể sau phẫu thuật, để kiểm soát sự phát triển của khối u hoặc để giảm bớt triệu chứng của bệnh. Nhược điểm của phương pháp này là không chỉ nhằm vào các tế bào bệnh mà còn làm tổn thương đến mô, tế bào lành như tế bào tủy xương. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Xạ trị UTĐTT: Xạ trị còn được gọi là phương pháp phóng xạ, sử dụng tia X có năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư. Hạn chế của phương pháp này là không áp dụng được khi ung thư đã lan ra toàn cơ thể.

Biến chứng của phương pháp này nhiều khi khá trầm trọng ảnh hưởng lâu dài đến sức khỏe người bệnh, gây tổn thương các mô lành, làm cho mô bị chai cứng. Các giai đoạn của UTĐTT Hiện nay có hai hệ thống phân chia giai đoạn ung thư [53]: Hệ thống phân loại Dukes: Được bác sĩ Dukes người Anh đưa ra vào năm 1932 và chỉ dành riêng cho UTĐTT. - Dukes A: Ung thư chỉ ở lớp trong cùng của đại tràng hoặc trực tràng. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 90%.

- Dukes B: Ung thư đã phát triển thông qua lớp cơ của đại tràng hoặc trực tràng. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 70%. - Dukes C: Ung thư đã lan rộng đến ít nhất một hạch bạch huyết ở khu vực gần đường ruột. Tỷ lệ điều trị khỏi là khoảng 30%.

- Dukes D: Ung thư đã lan đến một nơi khác trong cơ thể như gan, phổi. Hiệu quả điều trị không cao, ở giai đoạn này ít được can thiệp phẫu thuật mà đa số sử dụng các biện pháp mang tính tác động toàn thân như hóa trị, sử dụng tế bào miễn dịch. Hệ thống phân chia TNM: Được Ủy ban ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và Hiệp hội chống ung thư quốc tế (UICC) thông qua năm 1974. Sử dụng chung cho nhiều loại ung thư dựa vào 3 tiêu chí chính: Kích thước khối u, hạch lympho và sự di căn của khối u (bảng 1).

Áp dụng cụ thể cho UTĐTT như sau: T (Tumor): Cho biết kích cỡ mức độ lan sâu vào thành ruột - Tx: Không có mô tả do không đầy đủ thông tin. - Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ, khối u chỉ ảnh hưởng đến lớp niêm mạc. - T1: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp niêm mạc – cơ và xâm lấn đến lớp dưới niêm mạc. - T2: Ung thư đã phát triển xuyên qua lớp dưới niêm mạc, xâm lấn đến lớp cơ.

7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.