MỞ ĐẦU Trong những năm qua, proteaza là nhóm enzim thuỷ phân đƣợc nghiên cứu nhiều nhất trong ngành công nghiệp enzim. Hiện nay, proteaza chiếm khoảng 60 - 65% thị trƣờng enzim công nghiệp trên thế giới; trong đó bao gồm 28% proteaza kiềm, 10% renin và 21% là các loại proteaza khác (1). Proteaza kiềm đang đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm, chăn nuôi, may mặc, thuộc da, xử lý môi trƣờng, thu hồi bạc từ các bản phim,. Keratinaza thuộc nhóm proteaza kiềm, hoạt động trên cơ chất là keratin, trong những năm gần đây cũng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu bởi tiềm năng ứng dụng của chúng.
Keratin là nhóm các protein tự nhiên, là thành phần chính cấu tạo nên các loại lông, tóc, móng, sừng,… Lông gà trƣởng thành chiếm 5 - 7% trọng lƣợng sống. Trên thế giới, mỗi năm có tới 24 tỉ con gà và khoảng 8,4 triệu tấn lông vũ đƣợc thải ra từ ngành công nghiệp gia cầm (31), mức tăng hàng năm cũng lên tới khoảng 4. Hàm lƣợng protein trong lông vũ rất cao, chiếm tới trên 90%, nên có thể coi đây là một nguồn protein tiềm năng lớn có thể khai thác làm thức ăn cho chăn nuôi và nhiều ứng dụng khác. Tuy nhiên, keratin lại là loại protein rất bền nhờ có các liên kết disulfua trong phân tử.
Vì vậy, chúng có tính ổn định cơ học cao, có khả năng chống chịu tốt với tác động vật lý, hoá học và sinh học, không bị phân huỷ bởi nƣớc và các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin. Các nhà máy thuộc da, lông thú và các lò giết mổ gia súc, gia cầm vứt bỏ một lƣợng đáng kể các vật liệu chứa keratin: lông, len, sừng, móng,…. Ở Việt Nam, chỉ một phần rất nhỏ trong số chúng đƣợc sử dụng chủ yếu trong sản xuất một số sản phẩm thủ công, may mặc; phần lớn còn lại chỉ đƣợc loại bỏ và xử lý đơn giản nhƣ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đốt, chôn hoặc chỉ là chất thành các đống rác lớn chƣa có phƣơng pháp xử lý gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Trên thế giới, trƣớc đây ngƣời ta áp dụng phƣơng pháp xử lý lông vũ bằng cách thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao.
Tuy nhiên, phƣơng pháp này không chỉ phá huỷ một số axit amin ( nhƣ: metionin, lysin, histidin) mà còn tiêu thụ một lƣợng lớn năng lƣợng. Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phƣơng pháp thay thế đƣợc lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng pháp cũ. Ngoài ra, bên cạnh việc tạo ra nguồn protein bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, xử lý đƣợc nguồn rác khó phân giải góp phần chống ô nhiễm môi trƣờng thì keratinaza đƣợc phân lập từ vi sinh vật cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhƣ: loại bỏ lông trong ngành công nghiệp thuộc da , làm sạch các vật cản lông vũ trong các hệ thống nƣớc thải, phòng chống bệnh bò điên (21),… Tuy nhiên, một trong những hạn chế lớn ảnh hƣởng đến sự ổn định độ pH kiềm tính của các enzym này là có sự ổn định trong một phạm vi pH rộng nhƣng thƣờng không ổn nhiệt. Vì vậy, ngƣời ta mong muốn tìm kiếm các protease mới với những đặc tính mới lạ từ nhiều nguồn khác nhau (34).
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza, đặc điểm và ứng dụng của chúng, bƣớc đầu phục vụ cho phân huỷ lông vũ dùng làm thức ăn cho gia súc đã đem lại hiệu quả tốt (4, 10, 11, 14, 16, 23, 26, 27, 42). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực này chƣa có nhiều và việc ứng dụng chúng còn rất hạn chế, hầu hết lông vũ từ các lò giết mổ chỉ đƣợc coi là rác thải; cùng với đó, việc xử lý rác thải chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đề tài "Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim" đƣợc thực hiện nhằm: - Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ các mẫu đất khác nhau và xác định đƣợc chủng có hoạt tính tốt nhất. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Một số điều kiện tối ƣu về hàm lƣợng lông, nhiệt độ và pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu cho nuôi chủng sinh keratinaza.
- Một số đặc tính của enzim, nhƣ hoạt động tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ, pH và sự có mặt của những ion nào. Từ đó có thể ứng dụng vào thực tiễn góp phần xử lý rác thải lông vũ một cách hiệu quả, tận dụng một nguồn protein đang bị bỏ phí làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và có thể mở rộng sang nhiều ứng dụng khác nếu đƣợc tiếp tục nghiên cứu. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT CỦA KERATIN 1.
Cấu trúc của keratin Trong lịch sử, thuật ngữ keratin dùng cho tất cả các protein chiết xuất từ sự biến đổi của da, chẳng hạn nhƣ lông, sừng, móng vuốt và móng guốc. Sau đó, ngƣời ta đã nhận ra rằng keratin thực sự là một hỗn hợp của keratin, keratin liên quan đến các protein và các protein khác, chẳng hạn nhƣ enzim. Keratin sau đó đƣợc định nghĩa là một số protein hình thành sợi với các đặc tính hóa lý cụ thể và chiết xuất từ lớp hoá sừng của biểu bì, trong khi những protein hình thành lông, tóc đƣợc chiết xuất từ các lớp của biểu bì đã đƣợc nhóm lại là ''prekeratin'' hoặc ''cytokeratin''. Nhƣ vậy, keratin là nhóm các protein có cấu trúc dạng sợi với các đặc tính hoá lý cụ thể, là thành phần chính cấu tạo nên lông, tóc, móng, sừng, trong biểu mô của tế bào động vật có xƣơng sống… Trọng lƣợng phân tử keratin ở động vật có vú từ 40 đến 70 kDa.
Trong số các loại axit amin tạo nên các phân tử keratin thì cystein là phổ biến nhất (có thể chiếm tới 24%), ngoài ra, keratin từ lông gia cầm còn chứa hàm lƣợng cao các axit amin nhƣ: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin có hàm lƣợng lớn lƣu huỳnh có chứa trong cystein, tạo ra các cầu disunfua cho keratin. Keratin đƣợc tạo ra bởi các tế bào sừng - các tế bào sống tạo nên phần lớn của lông, tóc, móng, da,…Sau đó, các tế bào này chết và bao phủ bên ngoài có tác dụng bảo vệ. Các α-keratin -cuộn sợi protein duy nhất (thƣờng có các liên kết hiđro trong chuỗi ), sau đó tiếp tục xoắn vào các dây siêu xoắn để có thể tiếp tục cuộn.
β - LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com keratin có các tấm β xoắn lại với nhau, sau đó đƣợc ổn định và làm cứng bằng các cầu disunfua. Keratin đƣợc phân loại cụ thể theo cấu trúc phân tử của chúng, đặc điểm hóa lý , các tế bào biểu mô sản xuất và loại biểu mô có chứa các tế bào sản xuất keratin. Theo cấu tạo, keratin có 2 loại chính: -keratin: Trong tóc, lông cừu, sừng, móng tay, móng chân, móng và guốc của động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng các liên kết hiđro.
Xoắn alpha của keratin không phải là một chuỗi xoắn alpha đúng, vì nó chỉ có 3,5 dƣ lƣợng / lƣợt; trong khi xoắn alpha bình thƣờng có 3,6 dƣ lƣợng / lƣợt. Điều này quan trọng để tạo thành liên kết disunfua chặt chẽ. Ngoài ra, khoảng cuối mỗi dƣ lƣợng thứ bảy là một axit amin lơxin, để chúng có thể sắp xếp và giúp các sợi liên kết lại với nhau thông qua tƣơng tác kỵ nƣớc. -keratin: Trong móng tay, móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ testudines (ba ba, rùa), trong lông, mỏ, móng vuốt của các loài chim và lông của nhím, đƣợc hình thành chủ yếu trong các tấm beta, cứng chắc hơn các tấm anpha do các tấm beta đƣợc nối với nhau bằng các cầu disulfua.
LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc của keratin Các monome của keratin lắp ráp lại thành bó để tạo thành các sợi trung gian từ đó tạo thành các mô không khoáng hoá bền vững gặp ở các loài bò sát, chim, lƣỡng cƣ và động vật có vú. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các dạng cấu trúc của keratin a.
Cấu trúc miền phụ của chuỗi keratin biểu bì hiển thị cơ bản cuối vùng E1 và E2 ngắn, glycin / serin ở vùng giàu V1 và V2, và các khu vực tương đồng H1 và H2 (Steinert 1993). Cấu trúc miền phụ của các chuỗi a-keratin cứng cơ bản (NB) và axit (NA) khu vực của miền N-thiết bị đầu cuối. Miền thiết bị đầu cuối của các loại chuỗi được đặc trưng bởi một motif proline-cysteine-X lặp đi lặp lại.Miền C-thiết bị đầu cuối của loại dây chuyền II có chứa một phân bố định kỳ dư lượng kỵ nước (Parry và North,1998). Mô hình cấu trúc của keratin cuộn cuộn dây dimer, chiều dài 45 nm.Các axit amin kỵ nước của hai xoắn-khớp với nhau trong một mô hình lồng vào nhau thường xuyên (Cohlberg,1993).
Tổ chức microfibrils keratin, đầu hình cầu, đuôi (màu đen). Các thiết bị đầu cuối có thể tương tác với các phân đoạn trong sợi và với tên miền C khác trong một phân tử lân cận phản song song (Parry và North,1998). Tính chất của keratin LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Keratin là protein rất bền. Do có axit amin cystein chứa lƣu huỳnh có khả năng tạo liên kết với nhau bằng các cầu disunfua, tạo ra một dạng xoắn cực kì chặt chẽ, khiến keratin khá cứng chắc, bền nhiệt và rất khó hoà tan.
Keratin cũng khó bị phân giải bởi các proteaza thông thƣờng nhƣ: trypsin, papain và pepsin. Keratin không bị hòa tan trong dung dịch muối nhƣng những protein này có thể hoà tan trong các dung dịch có chứa các chất biến tính, chẳng hạn nhƣ urê. Keratin trong dung dịch có thể lắp ráp lại sợi trung gian. Do có chứa hàm lƣợng lƣu huỳnh cao nên khi đốt keratin trong lông, tóc, móng,… gây ra mùi khét đặc trƣng.
Tuỳ thuộc vào hàm lƣợng cystein và các cầu disunfua mà tạo ra các tế bào chứa keratin rất cứng nhƣ trong móng, guốc hoặc có thể linh hoạt hơn nhƣ trong da. Hầu hết các tế bào chứa nhiều keratin mà ta gặp là các tế bào đã chết và có thể đƣợc rụng ra hoặc bị các tế bào mới đẩy lên. Nếu các tế bào đã chết này đƣợc lƣu giữ trong tình trạng tốt, chúng sẽ có tác dụng nhƣ 1 lớp cách điện, cách nhiệt, không thấm nƣớc,… bảo vệ các tế bào phía dƣới.