Phát triển hợp tác vi sinh vật cho tiền xử lý sinh học nguyên liệu lignocellulosic

Nghiên cứu phát triển tập hợp vi sinh vật cho tiền xử lý sinh học nguyên liệu lignocellulosic, mở ra hướng đi mới trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Vu Ngoc Ha Vi
• Người hướng dẫn: Prof. Livia Simon-Sarkadi
• Trường học: Hungarian University of Agriculture and Life Sciences
• Chuyên ngành: Food Science
• Đề tài: Phát triển hợp tác vi sinh vật cho tiền xử lý sinh học nguyên liệu lignocellulosic
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Budapest

Mục lục chi tiết

• INTRODUCTION AND OUTLINE
• 1. CHƯƠNG 1: INTRODUCTION AND OUTLINE
• 1.1. Introduction
• 2. CHƯƠNG 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Hemicellulose
• 2.2. Pretreatment of lignocellulosic biomass
• 2.2.1. Physical pretreatment
• 2.2.2. Chemical pretreatment
• 2.2.3. Physicochemical pretreatment
• 2.2.4. Biological pretreatment
• 2.3. Ethanol production
• 2.4. Saccharification
• 2.5. Materials and methods
• 3. CHƯƠNG 3: MICROBIAL CONSORTIUM AND PRETREATMENT
• 3.1. Lignocellulose substrate
• 3.2. Microbial consortium
• 3.3. Effect of bacteria, yeast and their consortia on the pretreatment of lignocellulose
• 3.4. Optimization of microbial pretreatment
• 3.5. Effect of culture medium and pH
• 3.6. Effect of cultivation method
• 3.7. Effect of quality of lignocellulosic biomasses
• 3.8. Analytical methods
• 3.9. Determination of degradation rate
• 3.10. Statistical analysis
• 4. CHƯƠNG 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Bacterial pretreatment of wheat bran
• 4.1.1. Ligninolytic bacteria
• 4.1.2. Construction of mixed cultures of cellulolytic and ligninolytic strains
• 4.2. Fungal pretreatment of lignocellulosic biomass
• 4.2.1. Utilization of yeast as supplement
• 4.2.2. Optimization of operating parameters
• 4.2.3. Effect of culture medium and pH
• 4.2.4. Effect of liquid:solid ratio
• 4.2.5. Effect of cultivation method
• 4.3. Development of effective microbial consortia
• 4.3.1. Performance of newly developed microbial consortia
• 4.3.2. Application of newly developed microbial consortia
• 4.3.3. Optimization of saccharification process
• 4.4. Saccharification of pretreated wheat bran using mono- and co-cultures
• 4.5. Ethanol fermentation of biologically pretreated wheat bran
• Abbreviations
• List of figures
• List of tables

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tiền Xử Lý Sinh Học Lignocellulosic 50 60 Ký tự

Nhu cầu năng lượng toàn cầu dự kiến sẽ tăng đáng kể trong những thập kỷ tới. Nguồn nhiên liệu hóa thạch không thể đáp ứng nhu cầu này một cách bền vững. Do đó, việc tìm kiếm các nguồn năng lượng tái tạo là vô cùng quan trọng. Nguyên liệu lignocellulosic, bao gồm bã mía, rơm rạ, vỏ trấu, và các loại sinh khối nông nghiệp khác, nổi lên như một giải pháp tiềm năng. Tuy nhiên, cấu trúc phức tạp của lignocellulose gây khó khăn cho quá trình chuyển đổi sinh học. Tiền xử lý sinh học bằng hợp tác vi sinh vật là một phương pháp hứa hẹn để phá vỡ cấu trúc này, tạo điều kiện cho quá trình sản xuất ethanol sinh học và biogas hiệu quả hơn. Phương pháp này được đánh giá cao vì tính thân thiện với môi trường và tiềm năng giảm chi phí năng lượng.

1.1. Thành phần và cấu trúc phức tạp của Lignocellulosic

Cấu trúc phức tạp của nguyên liệu lignocellulosic bao gồm ba thành phần chính: cellulose, hemicellulose và lignin. Lignin tạo thành một lớp vỏ bảo vệ xung quanh cellulose và hemicellulose, cản trở sự tiếp cận của enzyme. Các liên kết hóa học chặt chẽ giữa các thành phần này cũng góp phần làm cho quá trình phân hủy sinh học trở nên khó khăn. Để tăng khả năng tiếp cận cellulose, cần có các phương pháp tiền xử lý hiệu quả.

1.2. Tại sao Tiền xử lý sinh học quan trọng cho Lignocellulosic

Tiền xử lý sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu quả chuyển đổi lignocellulose. Quá trình này giúp phá vỡ cấu trúc phức tạp, loại bỏ lignin, và giảm độ kết tinh của cellulose, từ đó tăng khả năng tiêu hóa sinh học của nguyên liệu. Hợp tác vi sinh vật trong tiền xử lý sinh học mang lại lợi thế về tính đặc hiệu, chi phí thấp và giảm thiểu tác động đến môi trường.

II. Thách Thức và Vấn Đề Tiền Xử Lý Sinh Học Lignocellulosic

Mặc dù có nhiều ưu điểm, tiền xử lý sinh học nguyên liệu lignocellulosic vẫn đối mặt với một số thách thức. Tốc độ phân hủy tương đối chậm so với các phương pháp khác như tiền xử lý hóa học hoặc vật lý. Điều này đòi hỏi thời gian ủ dài hơn và có thể làm tăng chi phí sản xuất. Ngoài ra, việc lựa chọn và tối ưu hóa hợp tác vi sinh vật phù hợp cho từng loại nguyên liệu cụ thể là một vấn đề phức tạp. Cần có nghiên cứu sâu rộng về phân tích vi sinh vật và tương tác giữa các loài để đạt được hiệu quả tối ưu.Theo tài liệu gốc, việc tìm kiếm các enzyme đặc hiệu có hoạt tính cao là vô cùng quan trọng

2.1. Hạn chế về Tốc độ phân hủy trong Tiền xử lý sinh học

Tốc độ phân hủy chậm là một trong những hạn chế chính của tiền xử lý sinh học. Các vi sinh vật phân giải lignin và vi sinh vật phân giải cellulose thường hoạt động chậm hơn so với các tác nhân hóa học hoặc vật lý. Điều này có thể kéo dài thời gian xử lý và làm tăng chi phí vận hành. Nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện tốc độ phân hủy bằng cách tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và sử dụng hợp tác vi sinh vật mạnh mẽ hơn.

2.2. Tối ưu hóa Quá trình Lựa chọn Hợp tác vi sinh vật phù hợp

Việc lựa chọn hợp tác vi sinh vật phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được hiệu quả cao trong tiền xử lý sinh học. Các loài vi sinh vật khác nhau có khả năng phân hủy các thành phần lignocellulose khác nhau. Việc kết hợp các loài có hoạt tính bổ trợ lẫn nhau có thể tạo ra hiệu ứng hiệp đồng, giúp tăng cường khả năng phân hủy tổng thể. Cần thực hiện phân tích metagenomic để xác định các vi sinh vật bản địa tiềm năng và xây dựng hợp tác vi sinh vật tối ưu.

III. Cách Phát Triển Hợp Tác Vi Sinh Vật Tiền Xử Lý Hiệu Quả

Phát triển hợp tác vi sinh vật hiệu quả đòi hỏi một quy trình có hệ thống, bắt đầu bằng việc thu thập và phân lập các vi sinh vật phân giải lignin và vi sinh vật phân giải cellulose từ các nguồn tự nhiên. Sau đó, cần thực hiện các thí nghiệm để đánh giá khả năng phân hủy và tương tác giữa các loài. Các kỹ thuật phân tích vi sinh vật, bao gồm PCR và giải trình tự gen, có thể được sử dụng để xác định và mô tả đặc điểm của các vi sinh vật tiềm năng. Cuối cùng, cần tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để đảm bảo hợp tác vi sinh vật hoạt động hiệu quả trong quá trình lên men.

3.1. Phân lập Vi sinh vật Nấm phân hủy gỗ và Vi khuẩn phân hủy Cellulose

Quá trình phân lập vi sinh vật bắt đầu bằng việc thu thập mẫu từ các môi trường tự nhiên giàu lignocellulose, chẳng hạn như đất, gỗ mục hoặc chất thải nông nghiệp. Các mẫu được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để khuyến khích sự phát triển của các nấm phân hủy gỗ và vi khuẩn phân hủy cellulose. Các chủng phân lập được kiểm tra khả năng phân hủy lignin và cellulose bằng các phương pháp hóa học và sinh học. Theo tài liệu gốc của Vu Ngoc Ha, sử dụng các vi sinh vật bản địa mang lại hiệu quả cao và bền vững.

3.2. Đánh giá Khả năng Phân hủy và Tương tác giữa Vi sinh vật

Sau khi phân lập, các vi sinh vật được đánh giá về khả năng phân hủy lignocellulose bằng các xét nghiệm khác nhau. Các xét nghiệm này bao gồm đo lượng đường khử được tạo ra từ quá trình phân hủy cellulose và hemicellulose, cũng như đo lượng lignin bị loại bỏ. Tương tác giữa các vi sinh vật cũng được nghiên cứu để xác định các cặp hoặc nhóm có hiệu ứng hiệp đồng. Phân tích enzyme lignocellulase đóng vai trò quan trọng trong quá trình này, giúp xác định enzyme có hoạt tính cao.

3.3. Tối ưu hóa Điều kiện Nuôi cấy để Tăng Hiệu quả

Để đảm bảo hợp tác vi sinh vật hoạt động hiệu quả, điều kiện nuôi cấy cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, độ ẩm, và thành phần môi trường cần được điều chỉnh để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và hoạt động của các vi sinh vật. Các kỹ thuật mô hình hóa quá trình có thể được sử dụng để dự đoán và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy.

IV. Enzyme Lignocellulase Chìa Khóa Tiền Xử Lý Sinh Học

Enzyme lignocellulase đóng vai trò trung tâm trong tiền xử lý sinh học nguyên liệu lignocellulosic. Các enzyme này, bao gồm cellulase, xylanase, và lignin peroxidase, có khả năng phá vỡ các liên kết hóa học trong lignocellulose, giải phóng đường và tạo điều kiện cho quá trình lên men. Hiệu quả của tiền xử lý sinh học phụ thuộc lớn vào hoạt tính và đặc tính của các enzyme lignocellulase. Nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện sản xuất và hoạt tính của các enzyme này thông qua kỹ thuật di truyền và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

4.1. Cellulase và Xylanase Phân giải Cellulose và Hemicellulose

Cellulase và xylanase là hai loại enzyme quan trọng trong quá trình phân hủy cellulose và hemicellulose. Cellulase phá vỡ các liên kết β-1,4-glycosidic trong cellulose, trong khi xylanase phân giải xylan, thành phần chính của hemicellulose. Hoạt động hiệp đồng của hai enzyme này giúp giải phóng đường hiệu quả hơn. Việc cải thiện sản xuất và hoạt tính của cellulase và xylanase là một mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu tiền xử lý sinh học.

4.2. Lignin Peroxidase Phân hủy Lignin hiệu quả

Lignin peroxidase là một enzyme oxy hóa có khả năng phân hủy lignin, một polymer phức tạp cản trở quá trình phân hủy cellulose. Lignin peroxidase sử dụng hydro peroxide (H2O2) để oxy hóa lignin, phá vỡ cấu trúc và làm cho cellulose dễ tiếp cận hơn với các enzyme khác. Việc phát triển các chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất lignin peroxidase hiệu quả là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng.

4.3. Ứng dụng Enzyme Lignocellulase trong Công nghiệp

Enzyme lignocellulase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, bao gồm sản xuất ethanol sinh học, biogas, và các sản phẩm sinh học khác. Chúng cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp giấy và dệt may để cải thiện chất lượng sản phẩm và giảm thiểu tác động đến môi trường. Nghiên cứu tiếp tục tập trung vào việc mở rộng ứng dụng của enzyme lignocellulase trong các lĩnh vực khác nhau.

V. Ứng Dụng Tiền Xử Lý Sinh Học Lignocellulosic trong Thực Tế

Tiền xử lý sinh học bằng hợp tác vi sinh vật đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng phương pháp này có thể cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất ethanol sinh học và giảm chi phí sản xuất. Ngoài ra, tiền xử lý sinh học cũng có thể được sử dụng để sản xuất biogas và các sản phẩm sinh học khác từ nguyên liệu lignocellulosic.

5.1. Sản xuất Ethanol Sinh học từ Phế thải Nông nghiệp

Phế thải nông nghiệp, bao gồm bã mía, rơm rạ, và vỏ trấu, là nguồn nguyên liệu lignocellulosic dồi dào và rẻ tiền. Tiền xử lý sinh học bằng hợp tác vi sinh vật có thể được sử dụng để chuyển đổi các phế thải nông nghiệp này thành đường, sau đó được lên men thành ethanol sinh học. Phương pháp này giúp giảm thiểu lượng chất thải nông nghiệp và sản xuất nhiên liệu tái tạo, đóng góp vào sự bền vững môi trường.

5.2. Sản xuất Biogas từ Nguyên liệu Lignocellulosic

Tiền xử lý sinh học cũng có thể được sử dụng để cải thiện quá trình sản xuất biogas từ nguyên liệu lignocellulosic. Quá trình này giúp phá vỡ cấu trúc phức tạp của lignocellulose, làm cho các chất hữu cơ dễ tiếp cận hơn với các vi sinh vật phân hủy kỵ khí. Biogas là một nguồn năng lượng tái tạo có thể được sử dụng để sản xuất điện, nhiệt hoặc nhiên liệu cho xe cộ. Theo các nghiên cứu, sự hợp tác vi sinh vật sẽ giúp quá trình đạt hiệu quả cao hơn.

5.3. Đánh giá Hiệu quả Kinh tế của Quá trình Tiền Xử Lý Sinh Học

Để đánh giá tính khả thi của tiền xử lý sinh học trong quy mô công nghiệp, cần thực hiện phân tích chi phí. Các yếu tố như chi phí nguyên liệu, chi phí enzyme lignocellulase, chi phí năng lượng, và chi phí vận hành cần được xem xét. So sánh với các phương pháp tiền xử lý khác để xác định tính cạnh tranh của tiền xử lý sinh học.

VI. Tương Lai Phát Triển Hợp Tác Vi Sinh Vật Trong Tiền Xử Lý

Hướng nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào việc cải thiện hiệu quả và giảm chi phí của tiền xử lý sinh học bằng cách sử dụng kỹ thuật di truyền để tạo ra các vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao hơn và khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt tốt hơn. Nghiên cứu cũng sẽ tập trung vào việc phát triển các quy trình tích hợp, kết hợp tiền xử lý sinh học với các phương pháp khác, chẳng hạn như tiền xử lý hóa học hoặc vật lý, để đạt được hiệu quả tối ưu.

6.1. Kỹ thuật Di truyền Cải thiện Vi sinh vật Phân Hủy

Kỹ thuật di truyền có thể được sử dụng để cải thiện các vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose. Bằng cách chuyển gen mã hóa các enzyme lignocellulase có hoạt tính cao hơn vào các vi sinh vật, có thể tạo ra các chủng có khả năng phân hủy lignocellulose hiệu quả hơn. Kỹ thuật di truyền cũng có thể được sử dụng để tăng cường khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt của các vi sinh vật, chẳng hạn như nhiệt độ cao hoặc pH thấp.

6.2. Quy trình Tích hợp Tiền Xử Lý Sinh Học và Phương pháp khác

Các quy trình tích hợp kết hợp tiền xử lý sinh học với các phương pháp khác, chẳng hạn như tiền xử lý hóa học hoặc vật lý, có thể đạt được hiệu quả phân hủy cao hơn so với việc sử dụng một phương pháp duy nhất. Ví dụ, tiền xử lý sinh học có thể được sử dụng để loại bỏ một phần lignin, sau đó tiền xử lý hóa học có thể được sử dụng để phá vỡ các liên kết còn lại. Quy trình tích hợp giúp tận dụng ưu điểm của từng phương pháp và giảm thiểu nhược điểm.

6.3. Tiềm năng Ứng dụng Công nghệ Xanh và Kinh tế Tuần hoàn

Tiền xử lý sinh học bằng hợp tác vi sinh vật đóng góp vào sự phát triển của công nghệ xanh và kinh tế tuần hoàn. Phương pháp này giúp chuyển đổi phế thải nông nghiệp thành các sản phẩm có giá trị, giảm thiểu lượng chất thải và bảo vệ môi trường. Tiền xử lý sinh học cũng có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm sinh học, chẳng hạn như ethanol sinh học và biogas, giúp giảm sự phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch và giảm phát thải khí nhà kính.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Dự báo nhân khẩu học toàn cầu cho thấy dân số thế giới có thể chạm ngưỡng 9,7 tỷ người vào năm 2050 và tiếp tục tăng lên 10,9 tỷ người trong nửa thế kỷ tới. Cùng với sự tăng trưởng kinh tế nhanh chóng, nhu cầu năng lượng và tổng lượng phát thải khí nhà kính dự kiến sẽ tăng gần 50% so với mức cơ sở năm 2020. Trong bối cảnh nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn kiệt và gây ra biến đổi khí hậu nghiêm trọng, năng lượng tái tạo đã trở thành trọng tâm chiến lược toàn cầu. Năng lượng sinh học hiện chiếm khoảng 70% tổng mức tiêu thụ năng lượng tái tạo, trong đó nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai từ sinh khối lignocellulose giữ vai trò hạt nhân.

Nguồn phụ phẩm nông nghiệp và lâm nghiệp ước tính cung cấp hơn 1,3 tỷ tấn sinh khối khô mỗi năm. Cấu trúc lignocellulose chứa hàm lượng carbon hữu cơ dồi dào với 40% đến 60% xenluloza, 20% đến 40% hemixenluloza và 10% đến 24% lignin. Tuy nhiên, liên kết đan xen phức tạp giữa mạng lưới polyme vô định hình của lignin và các bó sợi tinh thể xenluloza tạo nên rào cản phân giải sinh học cực kỳ bền vững. Các giải pháp tiền xử lý truyền thống bằng hóa chất hoặc nhiệt điện thường đòi hỏi chi phí năng lượng lớn, ăn mòn thiết bị và sinh ra các hợp chất ức chế độc hại.

Nghiên cứu này được triển khai nhằm thiết kế, tuyển chọn và tối ưu hóa hệ vi sinh vật phối hợp đa tầng (bao gồm vi khuẩn, nấm sợi và nấm men) để tiền xử lý sinh học các phụ phẩm lignocellulose tiêu biểu như cám mì và rơm mì. Toàn bộ thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Công nghệ Sinh học và Thực phẩm thuộc Đại học Khoa học Nông nghiệp và Đời sống Hungary (MATE) trong giai đoạn 2020 đến 2023. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi bền vững khi nâng hiệu suất phân hủy cơ chất lên 54% đến 60%, tạo tiền đề nâng cao hiệu quả đường hóa và tối ưu chu trình sản xuất cồn sinh học quy mô công nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng Lý thuyết phân giải sinh khối lignocellulose và Nguyên lý tương hỗ chuyển hóa trong quần thể vi sinh vật (Microbial Synergistic Interactions). Mô hình chu trình chuyển hóa sinh học tổng thể trải qua 3 giai đoạn kế tiếp: tiền xử lý phá vỡ cấu trúc cơ chất, thủy phân đường hóa nhờ hệ enzym ngoại bào và lên men chuyển hóa đường thành ethanol.

Các khái niệm học thuật cốt lõi được áp dụng xuyên suốt bao gồm:

• Phức hệ sinh khối lignocellulose: Cấu trúc liên kết ba thành phần chính gồm sợi xenluloza tuyến tính (độ trùng hợp từ 1510 đến 5500), mạng lưới phân nhánh hemixenluloza và khung polyme phenolic ba chiều của lignin (cấu thành từ ba đơn vị monolignol chính p-hydroxyphenyl, guaiacyl và syringyl).
• Hệ vi sinh vật phối hợp (Microbial Consortium): Tập hợp cộng sinh của các chủng vi sinh vật sở hữu hệ enzym tương hỗ, cùng phối hợp phân cắt các liên kết hóa học phức tạp mà một chủng đơn lẻ không thể thực hiện hiệu quả.
• Hệ enzym phân giải sinh học: Phức hệ enzym đa dạng gồm cellulase (endoglucanase, exoglucanase, beta-glucosidase), xylanase phân cắt hemixenluloza và enzym biến tính lignin (laccase, peroxidase).
• Tỷ lệ tích lũy đường khử (Reducing Sugar Accumulation Ratio): Chỉ số động học đo lường lượng đường đơn được giải phóng vào dung dịch so với mẫu đối chứng sau các mốc thời gian xử lý.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu thực nghiệm gồm 27 chủng vi sinh vật thuần khiết được cung cấp từ Ngân hàng Vi sinh vật Nông nghiệp và Công nghiệp Quốc gia Hungary (NCAIM). Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm phân nhóm các chủng theo chức năng sinh hóa đặc thù:

• Nhóm vi khuẩn phân giải xenluloza: 10 chủng thuộc chi Bacillus như Bacillus subtilis (B.01223), Bacillus licheniformis (B.01231), Bacillus cereus (B.01952), Bacillus coagulans (B.01139).
• Nhóm vi khuẩn phân giải lignin: 7 chủng thuộc chi Rhodococcus (Rhodococcus opacus B.01915, Rhodococcus fascians B.01608) và Pseudomonas putida (B.01522).
• Nhóm nấm sợi: 3 chủng đại diện gồm Aspergillus niger (F.00632), Penicillium chrysogenum (F.00814), Trichoderma viride (F.00795).
• Nhóm nấm men: 7 chủng thuộc chi Yarrowia (Yarrowia lipolytica Y.00613, Yarrowia divulgata Y.00810) và Pichia stipitis (Y.01047).

Quy trình phân tích định lượng được chuẩn hóa nghiêm ngặt:

• Xác định độ sụt giảm khối lượng khô: Sử dụng phương pháp trọng lượng sau khi sấy mẫu ở 105°C trong 24 giờ và ổn định ẩm trong bình hút ẩm 48 giờ.
• Định lượng đường khử: Sử dụng phương pháp đo quang Somogyi-Nelson ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ UV-Vis Helios Gamma.
• Đo hoạt độ enzym ngoại bào: Hoạt tính tổng cellulase (FPase), endoglucanase (CMCase) và xylanase được đo quang và quy đổi theo đơn vị chuẩn quốc tế IU/mL. Hoạt tính beta-glucosidase được định lượng thông qua phản ứng giải phóng p-nitrophenol ở bước sóng 410 nm.
• Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Định lượng glucose, xylose, maltose, cellobiose và ethanol trên hệ thống Thermo Fisher Scientific trang bị cột Aminex HPX-87H và đầu dò chỉ số khúc xạ RI ở 45°C.

Dữ liệu được thu thập lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức. Xử lý thống kê được thực hiện trên phần mềm SPSS 20.0 bằng phân tích phương sai một chiều ANOVA và kiểm nghiệm đa khoảng Tukey với mức ý nghĩa p < 0,05. Phân tích cụm phân cấp theo phương pháp phương sai tối thiểu Ward và phân tích thành phần chính (PCA) được ứng dụng để mô hình hóa mối quan hệ đa biến giữa các thông số enzym và khả năng giải phóng đường. Chu trình tiền xử lý kéo dài 7 ngày ở 30°C với tốc độ lắc 140 vòng/phút, đường hóa trong 4 giờ ở 50°C và lên men yếm khí trong 7 ngày ở 30°C.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, quá trình tiền xử lý cám mì bằng các đơn chủng vi khuẩn Bacillus đã ghi nhận mức sụt giảm khối lượng khô cơ chất đạt từ 54% đến 60% sau 7 ngày nuôi cấy, vượt trội đáng kể so với mức sụt giảm khoảng 30% ở mẫu đối chứng do hiện tượng tự thủy phân trong quá trình khử trùng nhiệt ẩm. Trong đó, các chủng Bacillus cereus và Bacillus coagulans thể hiện hiệu năng phân cắt cơ chất cao nhất.

Thứ hai, việc kết hợp các chủng vi sinh vật thành hệ phối hợp đa chủng (consortium) đã tạo ra sự đột phá về khả năng biểu hiện enzym ngoại bào. Các tổ hợp vi khuẩn đồng nuôi cấy 2 thành phần và 3 thành phần (như tổ hợp AB gồm Bacillus subtilis và Bacillus coagulans, hoặc tổ hợp tam phân ABC) đạt hoạt tính tổng cellulase (FPase) cao gấp gần 2 lần và hoạt tính xylanase cao gấp hơn 3 lần so với nuôi cấy đơn chủng tương ứng. Hoạt tính endoglucanase (CMCase) của các tổ hợp này cũng tăng từ 20% đến 60%.

Thứ ba, động học tích lũy đường khử cho thấy lượng đường tự do trong dịch thủy phân tăng liên tục và đạt đỉnh trong khoảng 48 đến 72 giờ đầu tiên của quá trình tiền xử lý, trước khi có xu hướng giảm dần ở các ngày tiếp theo do vi sinh vật bắt đầu tiêu thụ đường để duy trì sinh trưởng. Độ pH của môi trường trong các tổ hợp có hoạt lực phân giải mạnh dao động ổn định quanh mức 6,5 đến 8,0 nhờ sự cân bằng giữa chuyển hóa axit hữu cơ và sản phẩm amoniac hóa.

Thứ tư, kết quả phân tích thành phần chính (PCA) trên 11 tổ hợp vi khuẩn Bacillus cho thấy trục thành phần chính thứ nhất (PC1) giải thích tới 66,05% tổng phương sai dữ liệu, liên kết chặt chẽ với các biến hoạt tính FPase, CMCase và xylanase. Điều này chứng minh tác động hiệp đồng mạnh mẽ giữa enzym phân cắt mạch xenluloza và enzym thủy phân hemixenluloza trong việc phá vỡ cấu trúc lignocellulose.

Thảo luận kết quả

Hiệu năng vượt trội của hệ vi sinh vật phối hợp bắt nguồn từ cơ chế cộng sinh chuyển hóa (metabolic syntrophy). Khi nuôi cấy phối hợp, chủng phân giải hemixenluloza tiết xylanase loại bỏ lớp vỏ b bọc bên ngoài sợi xơ, tạo điều kiện thuận lợi cho enzym cellulase của chủng cộng sinh tiếp cận sâu vào các vi sợi xenluloza tinh thể. Sự hiện diện đồng thời của nấm men giúp chuyển hóa các phân tử đường ức chế và hợp chất phenolic độc hại sinh ra từ lignin, giải phóng enzym khỏi cơ chế ức chế sản phẩm ngược. Mức hao hụt khối lượng 54% đến 60% trong nghiên cứu này cao hơn hẳn so với mức khoảng 22% từng được ghi nhận trong các thử nghiệm vi khuẩn đơn lẻ trên phế phụ phẩm rơm rạ ở điều kiện chìm.

Các mối quan hệ phức tạp giữa thông số nuôi cấy và hoạt tính sinh hóa có thể được biểu diễn trực quan thông qua biểu đồ phân tán PCA hai chiều và sơ đồ cây phân cụm Ward. Dữ liệu thực nghiệm phân tách rõ ràng 24 biến thể thành 3 cụm riêng biệt: Cụm A (gồm Bacillus cereus và Bacillus coagulans) thể hiện hoạt lực tổng hợp cao nhất, Cụm B có hoạt tính xylanase nổi trội nhưng năng lực thủy phân tổng thể ở mức trung bình, và Cụm C mang hoạt tính phân giải yếu. Việc trực quan hóa này khẳng định vai trò then chốt của việc sàng lọc và bố trí thứ tự chủng cấy trong kỹ thuật lên men hai pha.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Chuẩn hóa quy trình tiền xử lý sinh học phân đoạn đa chủng: Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học cần ứng dụng quy trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus kết hợp nấm sợi theo phương thức cấy sole (cách nhau 24 giờ). Mục tiêu là rút ngắn chu trình tiền xử lý xuống còn 72 giờ và nâng tỷ lệ tích lũy đường khử lên trên 35%, triển khai thử nghiệm diện rộng trong thời gian 12 tháng.
2. Tích hợp nấm men giải độc phenolic vào hệ thống tiền xử lý: Các trung tâm phát triển năng lượng sinh học cần đưa các chủng nấm men như Yarrowia lipolytica và Pichia stipitis vào quy trình tiền xử lý sinh học nhằm giảm tối thiểu 50% hàm lượng độc chất phenolic trước giai đoạn đường hóa. Mục tiêu hoàn thiện hệ thống pilot quy mô 500 lít trong vòng 18 tháng.
3. Tối ưu hóa tỷ lệ phối trộn sinh khối nông nghiệp tại cơ sở chế biến: Các nhà máy sản xuất cồn sinh học và hợp tác xã nông nghiệp nên áp dụng công thức phối trộn phụ phẩm cám mì và rơm rạ theo tỷ lệ khối lượng 50:50 hoặc 75:25. Giải pháp này giúp giảm 20% đến 30% chi phí cơ chất đầu vào, thực hiện chuyển giao công nghệ trong 6 tháng.
4. Hoàn thiện khung chính sách khuyến khích kinh tế tuần hoàn sinh khối: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cùng Bộ Công Thương cần xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia về tiền xử lý phụ phẩm nông nghiệp bằng phương pháp sinh học và ban hành gói tín dụng xanh, hướng tới mục tiêu 100% phế phụ phẩm trồng trọt được tái chế thành năng lượng sạch trong giai đoạn 2024 đến 2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Thực phẩm: Luận văn cung cấp khung dữ liệu chi tiết về tương tác vi sinh vật, động học enzym và phương pháp thiết kế hệ vi sinh vật nhân tạo đa tầng có khả năng ứng dụng trong các đề tài nghiên cứu chuyên sâu.
2. Kỹ sư vận hành và chuyên gia R&D tại các nhà máy sản xuất Bioethanol: Nhóm đối tượng này có thể tiếp cận quy trình tối ưu hóa quá trình đường hóa và lên men cồn sinh học từ sinh khối không ăn được, giúp cắt giảm từ 20% đến 40% chi phí mua enzym thương mại đắt đỏ.
3. Doanh nghiệp chế biến nông sản và xử lý chất thải hữu cơ: Cung cấp giải pháp công nghệ sinh học khép kín để biến các dòng phế phụ phẩm (cám mì, rơm rạ, bã ngô) thành sản phẩm có giá trị kinh tế cao, đáp ứng các tiêu chuẩn giảm phát thải khí nhà kính.
4. Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Khoa học Môi trường và Năng lượng Tái tạo: Tài liệu là nguồn tham khảo phương pháp luận chuẩn xác về thiết kế thí nghiệm vi sinh, đo hoạt độ enzym quốc tế và xử lý số liệu đa biến nâng cao thông qua PCA và Cluster Analysis.

Câu hỏi thường gặp

Tiền xử lý sinh học có ưu điểm gì vượt trội so với tiền xử lý hóa học truyền thống?

Tiền xử lý sinh học vận hành ở điều kiện nhiệt độ ôn hòa khoảng 30°C và áp suất thường, không tiêu tốn lượng nhiệt lớn như phương pháp nổ hơi hay thủy nhiệt. Phương pháp này hoàn toàn không sử dụng axit hoặc kiềm đậm đặc, giúp loại bỏ nguy cơ ăn mòn máy móc và không sinh ra các chất ức chế lên men nguy hại như furfural hay HMF, đồng thời đạt hiệu suất hao hụt sinh khối từ 54% đến 60%.

Tại sao việc sử dụng hệ vi sinh vật phối hợp lại hiệu quả hơn nuôi cấy đơn chủng?

Không một vi sinh vật đơn lẻ nào có thể tiết ra đầy đủ mọi loại enzym cần thiết để bẻ gãy hoàn toàn phức hệ lignocellulose. Việc phối hợp các chủng vi khuẩn và nấm giúp nâng hoạt tính enzym tổng cellulase lên gần 2 lần và xylanase lên hơn 3 lần nhờ cơ chế hỗ trợ trao đổi chất, phân chia chức năng phân giải xenluloza, hemixenluloza và biến tính lignin.

Thời gian tiền xử lý vi sinh vật tối ưu được xác định là bao lâu?

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định mốc thời gian tối ưu là 72 giờ đầu tiên. Tại thời điểm này, hoạt lực enzym và nồng độ đường khử tự do đạt giá trị cực đại. Kéo dài thời gian nuôi cấy vượt quá 72 giờ sẽ dẫn đến hao hụt carbohydrate do vi sinh vật chuyển sang sử dụng đường đơn cho hoạt động sống nội bào.

Nấm men đóng vai trò gì trong hệ vi sinh vật tiền xử lý sinh khối?

Các chủng nấm men đặc thù như Yarrowia lipolytica và Pichia stipitis có khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu cao, thích nghi tốt với môi trường khắc nghiệt và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm sinh ra từ lignin. Nấm men đóng vai trò như chất bổ trợ sinh học giúp bảo vệ các chủng vi khuẩn nhạy cảm và hạn chế hiện tượng ức chế enzym.

Nghiên cứu giải quyết bài toán chênh lệch nhiệt độ giữa đường hóa và lên men như thế nào?

Quá trình đường hóa bằng enzym cellulase ngoại sinh đạt hiệu suất tối ưu ở 50°C trong khi nấm men Saccharomyces cerevisiae lên men tốt nhất ở 30°C. Luận văn đã áp dụng phương pháp thủy phân và lên men riêng biệt (SHF) với giai đoạn đường hóa ngắn 4 giờ, sau đó điều chỉnh pH về 4,0 trước khi cấy nấm men để đạt hiệu suất chuyển hóa cồn sinh học tối ưu.

Kết luận

• Nghiên cứu đã chứng minh tính khả thi và hiệu quả vượt bậc của giải pháp tiền xử lý sinh học đối với sinh khối lignocellulose bằng hệ vi sinh vật phối hợp đa tầng.
• Tổ hợp vi khuẩn Bacillus cùng nấm sợi và nấm men giúp nâng cao hoạt tính tổng cellulase lên gấp 2 lần và xylanase lên gấp hơn 3 lần so với nuôi cấy đơn chủng.
• Xác lập khung thời gian tiền xử lý tối ưu ở mốc 72 giờ, kiểm soát độ sụt giảm khối lượng khô cơ chất đạt mức 54% đến 60% mà không tạo ra các độc chất ức chế lên men.
• Đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm và mô hình hóa đa biến PCA, cung cấp công cụ khoa học chính xác cho việc thiết kế các hệ vi sinh vật cộng sinh công nghiệp.
• Mở ra lộ trình ứng dụng công nghệ sinh học xanh giai đoạn 2024 đến 2026, thúc đẩy chuyển đổi phế phụ phẩm nông nghiệp thành nhiên liệu sinh học thế hệ mới vì mục tiêu phát triển bền vững toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

I⁄I/^NIE HUNGARIAN UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND LIFE SCIENCES Development of microbial consortium for biological pretreatment of lignocellulosic raw materials PhD. Thesis Vu Ngoc Ha Vi Budapest 2023 Doctoral School Name: Doctoral School of Food Science Field: Food Science Head: Prof. Livia Simon-Sarkadi D. Department of Nutrition Science Institution of Food Science and Technology Hungarian University of Agriculture and Life Sciences (MATE), Hungary Supervisor: Prof.

Department of Bioengineering and Alcoholic Drink Technology Institution of Food Science and Technology Hungarian University of Agriculture and Life Sciences (MATE), Hungary Prof. Vijai Kumar Gupta Ph. Biorefining and Advanced Materials Research Centre Scotland’s Rural College (SRUC), UK The applicant met the requirement of the regulations of the Hungarian University of Agriculture and Life Sciences and the thesis is accepted for the defense process. Signature of Head of Doctoral School Signature of Supervisors il TABLE OF CONTENT 1.

AND OUTLLIN Eivssicssnaissicsnnuneienisnsinenannsoaanbait tiviwnetowwsnsnadasoubsnnnaisetunaransswsatisn 1 lui: SU ole (CE (Cl) 1 L2. - TCSs ccaisoiczasoziaseinenn onnibivenscininrsinsiiuresaissnneivesiew tensa unnn tis leanne vanrdn ain lvaleidvaieaenansionlewiv 3 LITERATURE RIB VIEW sangtsstooititoagsies4LSSG. 4 Pilele TCE1TUlÖ§ TkzussoanotindoibitiDGEIGHHOIAGGEUOHROEHUSSNEIDSIGBDHIGNIOHRGIAGEAINGMRASESSAHERRiiNM 5 2:12: Hemice lulose ccavssscmemcemmensmanseaten See RIE UE ER 2) DAB. LAGI sznusioiiitpttineilEDiEIDESDSIEBIHEIBEERGEIIERHIEIRHEIREXEPSNSIEABEGEERIIEHSTHEIERGHĐSMESGPBiABBMM 6 2.

Pretreatment of lignocellulosic b1OImasSS.- ---- + 25232 *++E* + £*EEsereereerserrserree 7 22Qle PHYSICA Prewrea tiie t oc cececeemcerennersentnennrnee cermin tener 8 50; Chemica ppnetne altri en basics stesasssiiessnsisscisummntisnanssuision cmwciivansnnsiie tieduoacutinentlenbataaiiatmealanaets 9 22.3» -PHYsiOCheniical Preheat tit sccorcess seeeoeenrerreneayenvevenaennensncemmennnesmmusermmerrenveneneres 11 2.GÉbloetHanolpf6dl6HOi:sssssseeasenriniiesbitaodiiieibitigsbiBEEHUHOR-ISEEL469)023380368 21 SACCHATT EH CATION.-nnninenerssermnnnrannnnnernactinerpinscmnnns sienttaninsaiinwofsspnatoiesnensdnenneieauriirauinanidnrantigeneaneinannee see 21 AlCOHONIC fSFEIfIGIIEOTH ssssssessnerren cues 23958 8R4 140008356156 2Sh3ESE1EĐESGGAESSSS-EELRDHSAIRNGEESRORG-G14E4856051 22 MATERIALS AND METHOIDS. --- --- +21 2S S1 2x TH HT TH TH ng Hư 23 3.1, Lipnocellilose subSHáảÍEssesssssoeoasssrotrdoilstidbilioiigtsltKOREERSEHGEIHIRUĐBIESgSeSufe 23 3/2: - ,MIIGTGBTENHISHHBsswswpueeoiboeiiegoitdgioilotabeSAdS90LRQĐADiGBQOIAriSSLGAigaHgASGERJWANidtaibpszsrjNiOqesy 23 3. Effect of bacteria, yeast and their consortia on the pretreatment of lignocellulose. Fungal biolopical pretreatiientcc css cannnsmnmnsiasienuniovanmantnsievenseitnwsnctneevendsnnawdns 24 3,5, Optimization of microbial pretredtnent ccsmsccmepnasmancmmncmmancmemearmenemn 25 3.

Effect of culture medium and plH.2, Elector iqitid SOG TANG sssc-vesssenscssmsienan menmenretaseamuamreeearenesem recur 25 3. Effect of cultivation method. ‘(Constivction of complex Microbial CONSOLE ssccsseesssonnernennsasnnsnasonnrenrennenxesanevaneavounnans 26 3. Effect of quality of lignocellulosic bioimasses.

Saccharification and fermentation of pretreated biomass: cases study. 26 39, Analytical 116 thodSersccucmmnnmesusscanmupmaa are EERE 27 3.1, Détermination of deoradation tate avvccsccasnnammmnnmnnaraninemanunrmanenns 27 3. Determination of reducing SU Bai iis: cscccvenecetersurnascteeneneesonsvrsesrtannestatavin spassenieerearens 20. EnzZymalicactivity AŠŠ4WŠ‹ssoandotnnasoobDaDDOEEHCEGEDDIHESQGĐIAIGBĐSSSEENGEGINIHHMSSSSAISSEEESXSRHESS 27 3.

Determination of total phenolic €OTIf€TI{. Determination of amino acid COTIẨ€TIE. Determination of bioconversion TAÍ€. - -- -- LG 22222222 221111111 1 1 125225111111 ng xxg 29 3:10.

Statistical analysis sscsensssassensassssssnassanssnsevsnsssaves staavnssannssaseassnnsanp sae oe sensnsenamapeaaceeasssseeats 29 RESULT AND DISCUSSION ses.cnseumscrmnep arama ne aE RT 31 4. Bacterial pretreatment of wheat bran.l„ Cellulolytie Bach cree oscencanaventememmenduacmcnc mime arma: 31 41. Ligninolytic bacteria :sscssssssscsscssmsseruesssenes nares emaecmnmasmeasmeanen naa 43 4. Construction of the mixed cultures of cellulolytic and ligninolytic strains.

_ Fungal pretreatment of lignocellulosic biO1maSsS. Utilization of yeast as supplement hố. Optimization of operating parameters. Effect of culture medium and plH.

Effect of the liquid:solid raf1O. Effect of cultivation methOS. --- 6 + k1 12k TH ngàn HT TH HH 67 4. Development of the effective microbial COTSOTẨ1A.1, PrONnusiiS ap pProde hl yowcrere apie ecssiernanecrernimeennet isi aa 69 4.

Construction of complex microbial COTRSOTẨHA. Performance of newly developed microbial conSOTẨ1a. Application of newly developed microbial €OTSOTẨA. Optimization saccharification process.

Saccharification of pretreated wheat bran using mono- and co-cultures. Ethanol fermentation of biologically pretreated wheat bran. 90 Tu 1521 El IGS SNC © E2 ky sang DtoicsfifeslnrstsftrrsnssatlibreibviesloostoisosbUtonbdi noobsso=biisliiostilvoistttogdtsir 94 il Abbreviations ANOVA Analysis of Variance CFU Colony Forming Units DP Degree of depolymerization of carbohydrates FPU Filter paper unit (Cellulase enzyme activity) GDS Gram per dried substrate HPLC High-Performance Liquid Chromatography Ils Ionic liquids pretreatment OD Optical Density Organosolv pretreatment PC Principal component PCA Principal Component Analysis Refractive index SHF Separate hydrolysis and fermentation SPSS Statistical Analysis Software SSF Simultaneous saccharification and fermentation YEPD Yeast extract peptone dextrose ili List of figures Figure 2.1 Hierarchy of structures of lignocellulosic b1OfSS.-- -- 55s ss + ++x+seeesssss 4 Figure 2.2 Cellulose structure (Terzopoulou et al.3 Hemicellulose structure (Terzopoulou et al.4 Three monomer types in lignin (Duval and Lawoko, 2014).- -----+ss<csxssxsse2 6 Figure 2.6 Different lignocellulose pretreatment approaches (Abraham et al.7 Overview of biological pretreatment and its applications (Narayanaswamy et al.5 Ethanol conversion process from lignocellulosic biomass.1 Dried weight loss of wheat bran after 7-day of cultivation of Bacillus strains .2 Reducing sugar accumulation ratio of Bacillus strains after 24, 48 and 72 hours of cultivation. Capital letters (A, B, C) indicate the difference by treatment time and lower-case letters (a, b, c, d, e) demonstrate difference by SÍTA1TS.-- - - + + 2321123 9 1 1 1 1 1x ng re 32 Figure 4.3 Correlation of pH and reducing sugar yield produced in pretreatment by individual Bacillus strains B.B, coasulans BOVI39 (HĨ sncassscossaaauvenscneracmnvmennmnenemmenze meas 33 Figure 4.4 Total cellulase activity (A), endo glucanase activity (B), B-glucosidase activity (C) and xylanase activity (D) of Bacillus strains at 72 hrs of enzyme harvest .5 Cluster analysis and its characteristic using Ward’s minimum variance, based on hydrolytic enzyme and reducing sugar in pretreatment by Bacillus strains.6 Dried weight loss of wheat bran after 7-day of cultivation of Bacillus consortia .7 Reducing sugar accumulation ratio of Bacillus co-cultures after 24, 48 and 72 hours of cultivation.

Capital letters (A, B, C) indicate the difference by treatment time and lower-case letters (a; b; Gd, €) đeni6iisfFa(6:đ1ITofefice BY SA HÍẾ ocr ceccnmanenvensonaneeeeenremensacannmenmenemermnenaenonaan 40 Figure 4.8 Principal component analysis (PCA) plot (A: component plot in rotated space; B: plot of regression factor on the first and second axes from PCA of 11 Bacillus consortia) .9 Dried weight loss of wheat bran after 7-day of cultivation of ligninolytic strains .10 Comparison of enzyme production capacity of 8 lignin-degrading strains at 48 hrs of HICDĐIIGT Reeeee entre tetas ten errr ee ern rece er ert ent ere 46 Figure 4.11 The correlation between degrading enzyme activities and sugar yield.12 Total phenolic content generated by ligninolytic cOnnSOTfa.13 The sugar conversion of pretreated lignocellulosic biomass using ligninolytic strains ((A and their cosculltures: (B) ssieacocsssmexseancenantasennsauiusinesanaumsasvernaadton onasiaucasemeesnawuceltne teatien Nee 50 Figure 4.14 Cluster analysis and its characteristic using Ward’s minimum variance, based on various parameters in pretreatment by bacterial COMSOTEHIA 0.15 Enzymatic properties of three clusters I (A), cluster II (B) and cluster II (C).16 The sugar conversion of pretreated lignocellulosic biomass by bacterial consortia in three clusters (cluster I (A), cluster IT (B), cluster IIT (C)) .17 Weight loss of wheat bran by the pretreatment of fungi strains and their consortia .18 Reducing sugar vs. time of pretreatment by Ẩung1.- ---- 55 525 +22 *+2+2sc£z£zsxss 58 Figure 4.19 The sugar conversion of pretreated biomass by fungi and their consortia .20 Reducing sugar accumulation ratio of yeast strains and their consortium after 24, 48 Aid 72 HS OPCW V AOR iccsmssversnseessccareosanneermennenemenenaacen emma REED 61 Figure 4.21 The sugar conversion of pretreated lignocellulosic biomass using yeast and their co- GUNHEỂlinssekuandsissmdlsnbinanernarliseceeslidlEesaosligttdgestplielpsoiclskcbsrosiilldiposSialkaEieliusEboritialobsgsfllidigdlisitaesoollisssaiostoslEindindise 63 Figure 4.22 Degradation efficiency in biological pretreatment by fungi using different culture medium and pH values: weight loss (A), reducing sugar yield (B).- ----5+++s<+<ss++s+ss+ 64 1V Figure 4.23 Degradation efficiency by bacterial co-cultures using different culture medium (A: Weisht loss, B: reducing stpar Viel d) nrscsnscusssnasn scanner Meo 64 Figure 4.24 Comparison of enzymatic characteristics under cultivation of bacteria and fungi in submerged pretreatment (A: FPase, B:CMCase, C: xylanase and D:laccase).25 Effect of moisture in degradation efficiencies in biological pretreatment using bacteria (A) and fungi (B) oo.26 Effect of two cultivation methods on degradation efficiency in biological pretreatment of lignocellulosic biomass: Suspended (A) and submerged (B) pretreatment.27 Effect of two cultivation methods on enzymatic production in biological pretreament of lignocellulosic biomass (A suspended and B submerged pretreatment) .28 Cluster analysis of degrading criteria and their characteristics in the pretreatment by the complex consortia using Ward’s metÏod.29 The correlation between weight loss and reducing sugars from pretreated wheat ee i aca a re 74 Figure 4.30 Enzyme production by microbes at 72 hrs of pretreatimenf.31 The sugar conversion of pretreated lignocellulosic biomass.32 Weight loss of lignocelluloses using microbial consortia BFY4 (A), BFY5 (B).33 Enzyme activities after 72 hrs of lignocellulose pretreatment by microbial consortia BFY4 (A) and BFY5 0.34 Sugar conversion of different mixtures of substrate under cultivation of BFY4 (A) and BEY 5 (8) ssssenmnsacassmsancmcncnunncmmanar cm 80 9930321T83149501094498G801001143G133504E0400/5041530S549380055 80 Figure 4.35 Comparison of the reducing sugar accumulation ratio in hydrolysates after 72 hrs pretreatment then after 4 hrs hydrolysis of lignocellulosic biomass.36 Saccharification and ethanol production using mono-cultures and co-cultures (maximum 3 members) pretreated wheat bran hydrolysates. --- eeeeee tee teeteeteeenee 85 Figure 4.37 Saccharification and ethanol production using complex consortia (from 4 members and above) pretreated wheat bran hydrolysates .- -- 1 SH nh ng HH He 86 Figure 4.38 Bioconversion rate with microbial consortia using pretreated wheat bran hydrolysates eee eee re 87 List of tables Table 3.1 List of microorganisms used in this Study. ccc eceeceseceeseeeeesseceeeeeeeeseceseeeneeseeeeenees 23 Table 3.2 Description of the fungal consortia.

All synthetic microbial communities were at least 3 TC CALS cscs caeraerarrrewesereawranaie cscs as RES US WS WER Na EAD TET HETOS WN SIOE SSS HE STEN SANT SAVES ESES ISA ODEO 24 Table 3.3 Experimental design for evaluation the effect of cultivation method.4 Preparation various mixtures of lignocellulosic bioimass.1 Description of the cellulolytic COTISOTẨHA.-- 55 22+ 322332 **2E+vE+vEererrerrrrrrrrrrrrer 38 Table 4.2 Enzymatic production of various enzymes by monoculture and co-culture in the pretreatment hydrolysate at 72 hours of €uÏ(IVaf{IOTI.3 Total phenolic content (mg/ml) accumulation ratio of ligninolytic strains after 7 day WUD) oe 45 Table 4.4 Enzymatic production by monoculture and co-culture of lignin-degrading strain in the pretreatment hydrolysate at 72 hours of CuÏ{TVAfIOII.5 Degradation efficiency of co-cultures of cellulolytic and ligninolytic strains .6 Enzyme production by fungi species and their conSOTfIUI.-- -5- 55 <+ss++ss>++ 59 Table 4.7 Degradation profiles by €aSÍ. - ác t1 TH HT TH nh HH HH 62 Table 4.8 Degradation parameters (weight loss, reducing sugar accumulation, pH) of wheat bran substrate in the cultivation of mono and mixed culture in the pretreatmenf.9 Reducing sugar accumulation ratio under pretreatment of various lignocellulosic Elö†ftaS5iušlfiE Microbial CONSOTAUI res cmcamssansemerennanmamaaramarmmae aR 78 Table 4.10 Effect of substrate loadings in saccharification efficacy of pretreated biomass .11 Effect of enzyme dosages 1n saccharification efficacy of pretreated biomass.12 List of microbial consortia used in the pretreatment of lignocellulosic biomass. INTRODUCTION AND OUTLINE 1. Introduction It has been predicted that the world's population may reach 9.7 billion in 2050 and 10.9 billion in the next 50 years (Roser, 2013).

As a result of the increasing population and economic growth, by 2050, global energy consumption and energy-related carbon dioxide emissions will increase nearly 50% compared with 2020 (Energy Information Administration, 2021). Fossil fuel, natural gas, coal and nuclear energy cannot satisfy human beings' demands. The reliance on oil and gas makes the world economy dependent on the limited number of exporting countries and escalates gasoline prices. Moreover, CO2 emissions as the result of burning fossil energy from the industrial zone or means of transport vehicles have been claimed as the main reasons for serious environmental issues such as global warming, and climate change which could damage the natural ecosystem.

Thus, many governments are stimulating the utilization of renewable energies and resources to aim toward the three dimensions (three Ps) of sustainability, namely Profitability (affordable energy), Planet (climate change) and People (social stability). The renewable source will be a promising and sustainable source of energy alternatives to address the future environmental problem and energy scarcity. Different types of renewable energy are currently being extensively researched, namely solar, wind, geothermal, hydrothermal and biofuels. Among renewable energy sources, bioenergy (energy from bio-based sources) is the largest renewable energy present in the form of liquid fuels such as biofuel, diesel, or gasoline.

In 2017, bioenergy accounted for 70% of renewable energy consumption (World Bioenergy Association, 2019). Biomass can be obtained from many sources such as forestry or agriculture waste streams. There are three classifications of biofuel listed first-, second-, and third-generation biofuels.