Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây, ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu.

• Tác giả: Trần Văn Nam
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Chí
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng trên vỏ và dịch trái cây
• 2.2. Đặc điểm chung của nấm men
• 2.3. Thành phần hóa học của nấm men
• 2.4. Đặc điểm hình thái của nấm men
• 2.5. Cấu tạo tế bào nấm men
• 2.6. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
• 2.7. Sự sinh sản của nấm men
• 2.8. Nhu cầu dinh dưỡng của nấm men
• 2.9. Sự trao đổi chất của nấm men
• 2.10. Phân loại nấm men
• 2.11. Vai trò của nấm men
• 2.12. Ứng dụng của nấm men
• 2.13. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.13.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.13.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
• 3.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
• 3.5. Môi trường nuôi cấy
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp thu nhận mẫu
• 3.7.2. Phương pháp pha loãng mẫu
• 3.7.3. Phương pháp phân lập và tuyển chọn nấm men tổng số
• 3.7.4. Phương pháp cấy chuyển và giữ giống
• 3.7.5. Quan sát chủng giống qua khuẩn lạc
• 3.7.6. Xác định khả năng lên men qua khả năng sinh khí
• 3.7.7. Thử khả năng catalaza
• 3.7.8. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD
• 3.7.9. Phương pháp chưng cất xác định nồng độ cồn
• 3.7.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men từ vỏ quả một số loại quả
• 4.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt nhất
• 4.2.1. Thử khả năng lên men
• 4.2.2. Thử khả năng lên men đường saccharose và maltose
• 4.2.3. Kết quả thí nghiệm khả năng tăng sinh
• 4.2.4. Nghiên cứu khả năng sinh rượu của các chủng nấm men đã chọn
• 4.2.4.1. Định danh sơ bộ chủng VPk1
• 4.2.4.2. Quan sát hình thái tế bào
• 4.2.4.3. Thử nghiệm catalase
• 4.3. Tối ưu hóa điều kiện môi trường sinh trưởng và phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1
• 4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 4.3.2. Ảnh hưởng của pH
• 4.3.3. Khả năng sử dụng nguồn nitơ (peptone)
• 4.3.4. Khả năng sử dụng nguồn carbon (đường glucose)
• 4.3.5. Thử khả năng lên men trên môi trường dịch quả
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 5.1. Tài liệu Tiếng Việt
• 5.2. Tài liệu tiếng anh
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận văn thạc sĩ 'Phân lập và tuyển chọn nấm men lên men rượu cao từ vỏ trái cây' tập trung vào việc tìm kiếm và chọn lọc các chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ nguồn nguyên liệu là vỏ trái cây. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập nấm men từ các loại vỏ trái cây khác nhau, sau đó tuyển chọn nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất để ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất rượu từ trái cây.

1.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu giúp củng cố kiến thức về nấm men và quá trình lên men, đồng thời rèn luyện kỹ năng nghiên cứu khoa học cho sinh viên. Việc phân lập nấm men từ vỏ trái cây cũng mở ra hướng đi mới trong việc tìm kiếm các chủng nấm men tự nhiên có tiềm năng ứng dụng cao.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trực tiếp vào sản xuất rượu từ trái cây, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Đây cũng là nguồn tài liệu tham khảo quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm.

II. Tổng quan về nấm men và quá trình lên men

Nấm men là vi sinh vật đơn bào, có khả năng sống trong môi trường giàu đường và chất dinh dưỡng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, đặc biệt là trong sản xuất rượu. Các chủng nấm men rượu như Saccharomyces cerevisiae thường được sử dụng phổ biến do khả năng lên men mạnh và ổn định. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm kiếm các chủng nấm men từ trái cây có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất rượu.

2.1. Đặc điểm của nấm men

Nấm men có cấu tạo tế bào phức tạp, bao gồm thành tế bào, màng tế bào chất và các bào quan như ti thể. Chúng có khả năng sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào. Nấm men cũng có khả năng thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau, từ môi trường hiếu khí đến yếm khí.

2.2. Quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hóa đường thành rượu và CO2 nhờ hoạt động của nấm men. Quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ đường và nguồn dinh dưỡng. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao nhất.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập nấm men từ vỏ trái cây, sau đó tiến hành tuyển chọn nấm men dựa trên khả năng lên men và sinh trưởng. Các chủng nấm men được đánh giá qua khả năng sinh khí, tăng sinh khối và sản xuất rượu. Kết quả cho thấy chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 có hoạt lực lên men cao nhất và được chọn để nghiên cứu sâu hơn.

3.1. Phân lập nấm men

Các mẫu vỏ trái cây được thu thập và xử lý để phân lập nấm men. Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy trên môi trường Hansen và quan sát hình thái khuẩn lạc. Các chủng nấm men được phân lập sau đó được đánh giá về khả năng lên men.

3.2. Tuyển chọn nấm men

Các chủng nấm men được tuyển chọn dựa trên khả năng lên men đường saccharose và maltose, cũng như khả năng tăng sinh khối. Chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 được xác định là chủng có hoạt lực lên men cao nhất và được chọn để nghiên cứu sâu hơn.

IV. Ứng dụng và kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây. Chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 được xác định là chủng có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất rượu. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao chất lượng rượu mà còn mở ra hướng đi mới trong việc tận dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất rượu

Chủng nấm men được tuyển chọn có thể ứng dụng trực tiếp vào sản xuất rượu từ trái cây, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu cũng góp phần đa dạng hóa các sản phẩm rượu trên thị trường.

4.2. Kết luận

Nghiên cứu đã đạt được mục tiêu đề ra, phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men cao. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sản xuất rượu từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sản xuất và tiêu thụ đồ uống có cồn là một nét văn hóa truyền thống lâu đời tại Việt Nam với nhiều dòng sản phẩm cổ truyền gắn liền với từng địa phương như rượu ngô Bản Phố (Lào Cai), rượu Làng Vân (Bắc Giang), rượu Bàu Đá (Bình Định), rượu Gò Đen (Long An), rượu Phú Lễ (Bến Tre) hay rượu Xuân Thạnh (Trà Vinh). Bên cạnh các dòng rượu truyền thống chưng cất từ ngũ cốc, rượu vang hoa quả du nhập từ phương Tây đang từng bước được người tiêu dùng nội địa đón nhận nhờ nồng độ cồn nhẹ, hương thơm tự nhiên và tác dụng hỗ trợ tiêu hóa. Tuy nhiên, ngành công nghiệp chế biến rượu vang quả tại Việt Nam mới phát triển vài thập kỷ gần đây, quy mô sản xuất còn nhiều hạn chế và chưa đáp ứng đầy đủ yêu cầu ngày càng cao của thị trường. Một trong những biện pháp kỹ thuật then chốt để nâng cao chất lượng, ổn định độ cồn và tạo lập hương vị đặc trưng cho rượu vang là khai thác nguồn vi sinh vật bản địa thông qua việc phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men tự nhiên cư trú trực tiếp trên bề mặt vỏ trái cây nguyên liệu.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây" được thực hiện với các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể:

• Mục tiêu của đề tài:

  1. Phân lập được các chủng nấm men từ vỏ quả ở các vùng miền khác nhau.
  2. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao nhất trong các chủng đã phân lập được.

• Yêu cầu và nhiệm vụ nghiên cứu:

  1. Phân lập được chủng nấm men có trên vỏ quả.
  2. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men rượu cao nhất để sản xuất rượu vang.
  3. Sơ bộ định danh chủng có hoạt lực cao nhất trong sản xuất rượu vang.
  4. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng đã tuyển chọn.
  5. Thử khả năng lên men trên môi trường dịch quả cho chủng tốt nhất.

• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm men tự nhiên hiện diện trên vỏ của nhiều loại quả sạch gồm na, ổi, bưởi, chuối, hồng xiêm, trứng gà (lòng đỏ), khế, cam, dứa, quất, nhãn và nho.
  • Phạm vi không gian: 42 mẫu quả sạch được thu thập tại huyện Nam Đàn (tỉnh Nghệ An), huyện Đại Từ (tỉnh Thái Nguyên), tỉnh Vĩnh Phúc, tỉnh Thanh Hóa và một số mẫu quả thu nhận tại chợ.
  • Phạm vi thời gian và địa điểm: Đề tài được triển khai thực nghiệm từ tháng 11/2015 đến tháng 5/2016 tại Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc chuyên ngành Công nghệ sinh học, sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm vi sinh vật học trong phòng thí nghiệm.

Khung lý thuyết và khái niệm khoa học

• Hệ vi sinh vật trên vỏ và dịch quả: Phân bố tự nhiên gồm nấm mốc (chiếm 76 – 90%), nấm men (chiếm 9 – 22%), cùng một tỷ lệ nhỏ xạ khuẩn và vi khuẩn. Các chi nấm men điển hình gồm Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, Zygopichia và Hansenula.
• Đặc tính sinh học và sinh hóa của nấm men: Tế bào nấm men đơn bào, nhân thực, sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân cắt, sinh sản hữu tính bằng bào tử nang. Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ glucan và mannoprotein.
• Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu: Nấm men là sinh vật kỵ khí tùy tiện. Trong điều kiện yếm khí, nấm men thực hiện quá trình dị hóa đường đơn (glucose, fructose) qua con đường Embden – Meyerhof – Parnas (EMP). Pyruvat bị khử carboxyl thành axetaldehyt nhờ enzyme pyruvat-decacboxilase, sau đó axetaldehyt bị khử thành ethanol nhờ alcohol-dehydrogenase theo phương trình tổng quát: $$\text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6 + 2\text{ADP} + 2\text{H}_3\text{PO}_4 \rightarrow 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 + 2\text{ATP} + 2\text{H}_2\text{O}$$
• Hiện tượng hô hấp ức chế lên men khi có mặt oxy được kiểm soát bởi hiệu ứng Pasteur. Quá trình lên men rượu đạt hiệu quả tối ưu trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn, nhiệt độ từ 28 – 32°C, pH môi trường từ 4 – 5 và nồng độ đường từ 10 – 18%.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập và chuẩn bị mẫu: 42 mẫu quả sạch được thu hái trực tiếp từ trên cây, bảo quản ở 4°C và xử lý dịch rửa bề mặt vỏ.
• Phân lập và làm thuần: Dịch rửa quả được pha loãng thập phân theo các nồng độ từ $10^{-1}$ đến $10^{-5}$. Hút 100 µl dịch mẫu pha loãng cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch Hansen dinh dưỡng (thành phần 1 lít gồm: 20 g glucose, 10 g peptone, 3 g $\text{KH}_2\text{PO}_4$, 2,5 g $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$, 20 g agar, điều chỉnh pH = 5, thanh trùng ở 121°C trong 30 phút). Nuôi ủ ở 30°C trong 48 giờ.
• Cấy chuyển và giữ giống: Các khuẩn lạc thuần khiết được cấy ria ziczac lên môi trường thạch nghiêng Hansen, ủ ở 30°C trong 2 – 3 ngày, bảo quản ở 0 – 4°C và định kỳ cấy chuyển 2 – 3 tuần/lần.
• Đánh giá hình thái và tế bào: Quan sát đại thể khuẩn lạc (màu sắc, bề mặt, độ lồi, kích thước); làm tiêu bản hiển vi nhuộm xanh methylen để kiểm tra hình thái tế bào và phương thức sinh sản.
• Thử nghiệm sinh lý, sinh hóa:
  • Thử nghiệm catalase: Sử dụng dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 30% nhỏ lên sinh khối nấm men trên phiến kính để quan sát hiện tượng sủi bọt khí.
  • Đánh giá hoạt lực lên men bằng ống Durham: Môi trường Hansen lỏng chứa 1 – 2% các nguồn carbon (glucose, saccharose, maltose) có đặt ống Durham ngược. Đo thời gian nấm men sinh khí $\text{CO}_2$ đẩy ống Durham nổi cao 5 cm (tương đương 5 ml $\text{CO}_2$).
• Đo mật độ tế bào (OD): Nuôi cấy lắc lỏng ở 30°C, tốc độ 150 vòng/phút; đo độ hấp thụ quang học OD tại bước sóng 620 nm trên máy quang phổ UV-VIS định kỳ mỗi 4 giờ.
• Xác định nồng độ rượu: Lấy 100 ml dịch dấm chín sau lên men đem chưng cất thu 50 ml rượu thô. Xác định nồng độ cồn bằng cồn kế thủy tinh và tra bảng quy đổi về nhiệt độ tiêu chuẩn 20°C.
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và phần mềm IRRISTAT.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Phần này làm rõ lý do chọn đề tài dựa trên thực trạng sản xuất rượu truyền thống và rượu vang hoa quả tại Việt Nam. Khóa luận nêu bật sự cần thiết của việc tuyển chọn các dòng nấm men bản địa từ vỏ quả tự nhiên nhằm nâng cao chất lượng và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Tác giả xác lập 2 mục tiêu lớn, 5 yêu cầu kỹ thuật cụ thể, đồng thời khẳng định ý nghĩa khoa học trong việc rèn luyện phương pháp nghiên cứu vi sinh và ý nghĩa thực tiễn đối với công nghệ lên men thực phẩm.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa cơ sở lý luận vi sinh vật học gồm:

• Thành phần hệ vi sinh vật tự nhiên trên vỏ và dịch quả (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn).
• Cấu tạo giải phẫu tế bào nấm men: vách tế bào glucan-mannan, màng sinh chất, ti thể, không bào và các thể vùi nội bào.
• Quá trình trao đổi chất, dinh dưỡng carbon (đường đơn, đường đôi), dinh dưỡng nitơ (peptone, muối amon), khoáng chất ($\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{MgSO}_4$) và vitamin.
• Cơ chế sinh sản vô tính (nảy chồi, phân cắt) và hữu tính (tạo bào tử nang đơn bội, hợp tử nhị bội).
• Lịch sử ứng dụng nấm men trong sản xuất cồn, bánh mì, bia, rượu vang và protein sinh khối cho chăn nuôi.
• Tổng thuật các nghiên cứu trong nước (Mai Đàm Linh, Ngô Thị Phương Dung, Lý Nguyễn Bình) và quốc tế (Shivaji, Dangelly Lins, Panneerselvam) về phân lập nấm men chịu cồn từ hoa quả và bánh men truyền thống.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết các thông số kỹ thuật thực nghiệm:

• Danh mục 42 mẫu vỏ quả phân bố theo 4 vùng địa lý (Nghệ An, Vĩnh Phúc, Thanh Hóa, Thái Nguyên) và chợ.
• Hóa chất sử dụng: glucose, saccharose, maltose, tinh bột, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$, peptone, agar, $\text{H}_2\text{O}_2$ 30%, thuốc nhuộm xanh methylen.
• Thiết bị phòng thí nghiệm: Nồi hấp tiệt trùng MITECOM, tủ sấy, tủ ấm, máy ly tâm lạnh, máy lắc, máy quang phổ UV-VIS Labomed INC, kính hiển vi quang học, cồn kế thủy tinh.
• Công thức phối chế môi trường phân lập Hansen và quy trình thực hiện 5 nội dung nghiên cứu.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương này công bố chi tiết các dẫn liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả phân lập: Từ 42 mẫu quả ban đầu đã phân lập và làm thuần được 50 chủng nấm men riêng biệt trên môi trường Hansen. Khuẩn lạc sau 2 ngày nuôi cấy có đường kính từ 1,0 – 4,0 mm, hình tròn hoặc hơi tròn, lồi hoặc bẹt, màu sắc biến thiên từ trắng sữa đến trắng ngà, bề mặt mịn hoặc bóng (Bảng 4.1).
• Tuyển chọn chủng nấm men qua khả năng sinh khí $\text{CO}_2$ trên môi trường glucose: Thời gian đẩy nổi ống Durham 5 cm của 50 chủng dao động từ 16 giờ đến trên 48 giờ. Đã lựa chọn được 12 chủng có hoạt lực mạnh nhất với thời gian lên men dưới 30 giờ (Bảng 4.2).
• Khả năng đồng hóa saccharose và maltose: Thử nghiệm 12 chủng ưu tú trên môi trường chứa saccharose và maltose cho thấy khả năng lên men có sự khác biệt rõ rệt giữa các chủng (Bảng 4.3).

STT	Ký hiệu chủng	Nguồn gốc mẫu	Thời gian lên men Glucose (giờ)	Thời gian lên men Saccharose (giờ)	Thời gian lên men Maltose (giờ)
1	VPk1	Vỏ khế (Vĩnh Phúc)	16	22,30	19,30
2	NAld2	Vỏ quả lòng đỏ (Nghệ An)	17	24,00	19,00
3	THd1	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	20	> 48	> 48
4	THd3	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	20	24,00	24,00
5	THd4	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	20	36,00	> 48
6	NAo1	Vỏ ổi (Nghệ An)	20	22,00	23,00
7	TNc4	Vỏ chuối (Thái Nguyên)	24	24,00	36,00
8	TNc7	Vỏ cam (Thái Nguyên)	24	> 48	> 48
9	THd6	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	25	36,00	48,00
10	THd5	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	26	24,00	> 48
11	NAna1	Vỏ na (Nghệ An)	26	> 48	24,00
12	VPk2	Vỏ khế (Vĩnh Phúc)	27	36,00	> 48

• Tuyển chọn chủng xuất sắc nhất: Chủng VPk1 phân lập từ vỏ quả khế (Vĩnh Phúc) có tốc độ lên men nhanh nhất trên glucose (16 giờ), đồng thời đồng hóa tốt cả maltose (19,30 giờ) và saccharose (22,30 giờ).
• Động học tăng sinh khối: Theo dõi đường cong sinh trưởng qua đo mật độ quang $\text{OD}_{620}$ theo thời gian.
• Định danh sơ bộ: Chủng VPk1 có tế bào hình ovan/bầu dục, sinh sản bằng nảy chồi, thử nghiệm catalase dương tính (sủi bọt mạnh với dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 30%), sơ bộ định danh thuộc loài Saccharomyces cerevisiae VPk1.
• Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của chủng S. cerevisiae VPk1: Đánh giá dải nhiệt độ, dải pH, nồng độ nguồn nitơ (peptone) và nồng độ nguồn carbon (đường glucose).
• Lên men trên môi trường dịch quả thực tế: Chủng VPk1 được thử nghiệm lên men trên dịch quả nho ở 19°Brix; chưng cất và xác định hàm lượng cồn trong dịch dấm chín.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các kết quả đạt được về số lượng chủng phân lập, các chỉ tiêu sinh lý của chủng S. cerevisiae VPk1 và đề xuất kiến nghị tiếp tục hoàn thiện nghiên cứu ở quy mô lớn hơn.

---

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng cụ thể

1. Phân lập thành công 50 chủng nấm men thuần khiết từ 42 mẫu vỏ quả thu thập tại 4 tỉnh thành và chợ, thiết lập bảng mô tả hình thái khuẩn lạc chi tiết (đường kính khuẩn lạc từ 1 – 4 mm).
2. Sàng lọc qua ống Durham xác định 12 chủng có hoạt lực sinh khí $\text{CO}_2$ mạnh trên glucose trong khoảng 16 – 27 giờ.
3. Tuyển chọn được chủng VPk1 (phân lập từ vỏ khế Vĩnh Phúc) có hoạt lực cao nhất: sinh 5 ml $\text{CO}_2$ sau 16 giờ trên môi trường glucose, sau 19,30 giờ trên môi trường maltose và sau 22,30 giờ trên môi trường saccharose.
4. Định danh sơ bộ chủng VPk1 là Saccharomyces cerevisiae VPk1 dựa trên hình thái tế bào oval, nảy chồi, thử nghiệm enzyme catalase dương tính và phổ đồng hóa đường rộng.
5. Xác định các điều kiện môi trường tối ưu (nhiệt độ, pH, peptone, glucose) cho chủng VPk1 và kiểm chứng khả năng lên men tạo cồn trên dịch quả nho ở 19°Brix.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tác giả đề xuất đưa chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 vào ứng dụng thực tế trong sản xuất rượu vang quả, nhằm thay thế các loại men thương phẩm trôi nổi, giúp ổn định chất lượng, gia tăng nồng độ cồn tự nhiên và khai thác hương vị trái cây đặc trưng.

Đóng góp khoa học so với các nghiên cứu trước

• Khóa luận làm phong phú thêm bộ sưu tập vi sinh vật bản địa phục vụ công nghệ lên men thực phẩm tại Việt Nam, đặc biệt là nguồn nấm men phân lập trực tiếp từ vỏ quả tươi ở các vùng sinh thái phía Bắc (Thái Nguyên, Vĩnh Phúc) và Bắc Trung Bộ (Nghệ An, Thanh Hóa).
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đối chứng về khả năng lên men các nguồn carbohydrate khác nhau giữa các chủng nấm men hoang dã.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Việc định danh chủng VPk1 mới chỉ dừng lại ở mức độ sơ bộ dựa trên đặc điểm hình thái tế bào hiển vi và thử nghiệm hóa sinh catalase; chưa tiến hành phân tích sinh học phân tử (giải trình tự vùng gen 18S rRNA hoặc 26S D1/D2 domain) để xác định loài một cách tuyệt đối.
• Quy mô thử nghiệm lên men dịch quả mới dừng lại ở thể tích nhỏ trong phòng thí nghiệm trên dịch quả nho 19°Brix, chưa tiến hành thử nghiệm mở rộng trên nhiều loại dịch quả nhiệt đới khác.
• Nghiên cứu chưa định lượng chi tiết các sản phẩm phụ trong dịch lên men như hàm lượng methanol, aldehyde, este, acid bay hơi hay các loại rượu bậc cao (dầu fusel).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để khẳng định chính xác tên loài và vị trí phân loại học của chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1.
• Mở rộng khảo sát động học lên men trên dịch ép của nhiều loại quả nhiệt đới sẵn có tại Việt Nam (chuối, xoài, thanh long, dứa, ổi).
• Nâng quy mô lên men lên cấp pilot bán công nghiệp, kiểm tra độ ổn định di truyền của chủng giống và đánh giá toàn diện các chỉ tiêu hóa lý, cảm quan của sản phẩm vang thành phẩm.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho:

• Sinh viên, học viên cao học chuyên ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực phẩm và Vi sinh vật học ứng dụng cần tài liệu mẫu về quy trình phân lập, làm sạch và tuyển chọn vi sinh vật từ nguồn mẫu tự nhiên.
• Cán bộ kỹ thuật và nghiên cứu viên tại các phòng thí nghiệm lên men thực phẩm quan tâm đến phương pháp sàng lọc hoạt tính sinh cồn bằng ống Durham và kỹ thuật chưng cất xác định nồng độ cồn bằng cồn kế.
• Phần đáng tham khảo nhất trong tài liệu là phương pháp bố trí thí nghiệm đối chứng khả năng lên men các loại đường đơn và đường đôi (glucose, saccharose, maltose) của 12 chủng ưu tú, cùng quy trình chuẩn bị môi trường Hansen chuẩn hóa để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ngoại cảnh (nhiệt độ, pH, nguồn dinh dưỡng C và N).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài đã thu thập bao nhiêu mẫu vỏ quả và tại những địa phương nào?

Khóa luận đã thu thập tổng cộng 42 mẫu quả sạch thuộc các loại na, ổi, bưởi, chuối, hồng xiêm, trứng gà (lòng đỏ), khế, cam, dứa, quất, nhãn và nho tại 4 tỉnh: huyện Nam Đàn (tỉnh Nghệ An), huyện Đại Từ (tỉnh Thái Nguyên), tỉnh Vĩnh Phúc, tỉnh Thanh Hóa và một số mẫu quả tươi mua tại chợ.

2. Phương pháp nào được sử dụng để sàng lọc sơ bộ khả năng lên men của 50 chủng nấm men?

Tác giả sử dụng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng có đặt ống Durham ngược. Chỉ tiêu đánh giá là đo thời gian nấm men sinh lượng khí $\text{CO}_2$ đủ để đẩy ống Durham nổi cao 5 cm (tương đương thể tích 5 ml $\text{CO}_2$).

3. Chủng nấm men nào đạt hoạt lực lên men rượu cao nhất và được phân lập từ nguồn mẫu nào?

Chủng nấm men đạt hoạt lực cao nhất là VPk1, được phân lập từ mẫu vỏ quả khế thu thập tại tỉnh Vĩnh Phúc.

4. Thời gian làm nổi ống Durham của chủng VPk1 trên các loại đường là bao lâu?

Chủng VPk1 làm nổi ống Durham sau 16 giờ nuôi cấy trên môi trường chứa glucose, sau 19,30 giờ trên môi trường chứa maltose và sau 22,30 giờ trên môi trường chứa saccharose.

5. Việc định danh sơ bộ chủng VPk1 được thực hiện dựa trên những bằng chứng khoa học nào?

Định danh sơ bộ dựa trên: đặc điểm hình thái tế bào hình ovan dưới kính hiển vi quang học, hình thức sinh sản vô tính bằng nảy chồi, phản ứng catalase dương tính (sủi bọt khí khi tiếp xúc với $\text{H}_2\text{O}_2$ 30%) và khả năng đồng hóa mạnh các loại đường hexose và disaccharide, từ đó xác định chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Văn Nam đã thực hiện thành công việc phân lập 50 chủng nấm men từ 42 mẫu vỏ quả tươi thu thập tại nhiều vùng miền ở Việt Nam. Qua các bước sàng lọc thực nghiệm chặt chẽ, đề tài đã tuyển chọn được chủng ưu tú VPk1 phân lập từ vỏ quả khế tại Vĩnh Phúc với khả năng lên men mạnh mẽ trên cả ba nguồn đường glucose, saccharose và maltose. Kết quả định danh sơ bộ và tối ưu hóa các thông số nuôi cấy khẳng định chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 là nguồn giống vi sinh vật tiềm năng để ứng dụng vào công nghệ chế biến rượu vang hoa quả chất lượng cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ở nước ta, rượu là một thức uống có cồn rất phổ biến, mang đậm tính truyền thống, gắn bó lâu đời và không thể thiếu được trong cuộc sống tinh thần và văn hóa dân tộc. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại rượu nổi tiếng như rượu ngô Bản Phố, một loại rượu đặc sản của người Mông ở Bản Phố, cao nguyên Bắc Hà, Lào Cai; rượu Làng Vân, đặc sản cổ truyền Bắc Giang; rượu Bầu Đá, đặc sản của miền đất võ Bình Định; rượu Gò Đen của quê hương Long An; rượu Phú Lễ của miền đất Đồng khởi Bến Tre; rượu Xuân Thạnh của Trà Vinh [1]. Bên cạnh những loại rượu truyền thống đấy giờ đây ở trên thị trường nước ta còn du nhập thêm rượu vang từ các nước phương tây. Chế biến rượu vang quả đối với các nước trên thế giới đã là một nghề cổ xưa nhưng ở Việt Nam chỉ mới xuất hiện vài chục năm gần đây [7].

Việc tiêu thụ rượu vang tuy không mạnh nhưng từng bước được người tiêu dùng ưa chuộng do có độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, có tác dụng kích thích tiêu hoá… và rượu vang dần dần được chọn thay cho các loại rượu mạnh [7] trong các dịp lễ tết. Tuy nhiên, ngành công nghiệp sản xuất rượu vang ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế, chưa thực sự đáp ứng được yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu vang là vấn đề rất được quan tâm hiện nay. Một trong những phương pháp cải tiến chất lượng là sử dụng nguồn nấm men tự nhiên được phân lập từ nguyên liệu cho quá trình sản xuất rượu vang sẽ cho rượu có độ cồn cao, chất lượng rượu ổn định và mùi vị đặc trưng [15].

Xuất phát tử thực tế đó em xin thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây”. Hoạt động này giúp cải thiện và tăng cường chất lượng rượu vang, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế của các loại quả và phần nào đáp ứng nhu cầu sử dụng các dạng nước uống có cồn đa dạng hiện nay. Mục tiêu của đề tài Phân lập được các chủng nấm men từ vỏ quả ở các vùng miền khác nhau. n 2 Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao nhất trong các chủng đã phân lập được.

Yêu cầu của đề tài Phân lập được chủng nấm men có trên vỏ quả. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men rượu cao nhất để sản xuất rượu vang. Sơ bộ định danh chủng có hoạt lực cao nhất trong sản xuất rượu vang. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng đã tuyển chọn.

Thử khả năng lên men trên môi trường dịch quả cho chủng tốt nhất. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này.

Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng nấm men có khả năng lên men cao, ứng dụng trong ngành sản xuất rượu vang, cũng như các sản phẩm len men khác. Đem lại năng suất, chất lượng cao. Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.

n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng trên vỏ và dịch trái cây. Hệ vi sinh vật trên vỏ và dịch trái cây tương đối phong phú và phức tạp. trong đó nấm mốc (76 – 90%), nấm men (9 – 22%) còn lại chiếm tỷ lệ thấp là vi khuẩn không sinh bào tử hoặc có bào tử, xạ khuẩn và Micobacter.

 Nấm men - Nấm men rượu vang: Saccharomyces Vini và S. Hai loại này được dùng chủ yếu để lên men rượu vang. - Nấm men nhọn đầu: Hansenias pora apiculata giống men này làm giảm chất lượng vang. Giống men này rất phổ biến ở cỏ dại.

- Pichia có hình dáng ovan. Kích thước tế bào không lớn lắm (3,6 – 7,2 x 3 - 5µm). Giống men này làm hỏng vang. - Zygopichia làm đục vang sau khi chiết chai.

- Hansenula có khả năng sinh trưởng nhanh trên bề mặt dịch quả sinh trưởng được ở vang có 9 – 13% cồn. Nó là tác nhân mạnh mẽ tạo cho vang có các este bay hơi (làm vang có mùi thơm riêng biệt) nhưng đồng thời nó cũng làm đục vang.  Vi khuẩn và nấm mốc Hầu hết vi khuẩn đều gây “bệnh” cho vang nhưng có một loại thuộc vi khuẩn lactic phát triển biến axit malic thành axit lactic (lên men malo – lactic). Vi khuẩn này tham gia vào làm chín vang làm cho vang có mùi thơm hoàn thiện.

Trên vỏ trái cây cũng chứa các bào tử của giống Mucor, nấm hình chổi xuề hay bàn tay (mốc xanh) và As pergilusniger (mốc đen) là những tác nhân nguy hiểm cho vang nhưng cũng có nấm mốc Botrytis cinera làm tăng chất lượng cho vang [15]. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là loại vi sinh vật đơn bào, có khả năng sống trong môi trường dinh dưỡng có chứa đường, nitơ, photpho và các chất hữu cơ, vô cơ khác. Chúng là n 4 các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong các môi trường hiếu khí và yếm khí [9]. Đa số chúng sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi hình thức phân cắt tế bào.

Thành tế bào có chứa manane. Nấm men sống và tồn tại phân bổ rất rộng rãi trong tự nhiên nhất là trong môi trường có chứa dịch đường, pH thấp ví dụ như trong môi trường dịch hoa quả, dịch rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, trong đất trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ [9]. Thành phần hóa học của nấm men Tế bào nấm men chứa đến 80% là nước. Bởi vậy, trong nấm men bia ép tỉ lệ giữa trọng lượng ướt và trọng lượng khô là 4:1.

Nguyên tố chủ yếu là carbon, chiếm < 50% chất khô. Các nguyên tố chính khác như oxy (30 – 35%), nitơ (75%) hydro (5%) và photpho (1%). Hàm lượng chất khoáng tổng số khoảng 5 - 10% chất khô của tế bào. Trong tế bào còn chứa rất nhiều các thành phần khác như nhôm, canxi, đồng, crom, sắt, chì, natri, kali, lưu huỳnh, magie, niken,.

Các nhóm thành phần chính gồm các chất cao phân tử, đó là các protein (40 – 45% chất khô), carbohydrat (30 – 35%), axit nucleic (6 – 8%) và lipit (4 – 5%). Thành phần chính xác của các nhóm cao phân tử trong mỗi chủng nấm men khác nhau do điều kiện nuôi cấy, pha phát triển [9]. Đặc điểm hình thái của nấm men Tế bào nấm men có hình dạng: Hình cầu, hình ovan hoặc là hình elip, hình quả chanh, hình trụ hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài thành sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường môi trường xung quanh.

Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các điều kiện môi trường tiêu chuẩn. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn: Đường kính khoảng 7µm; chiều dài khoảng 8 – 12µm (1µm – micro mét = 10-6 m). Với kích thước này ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong 1 lít dịch lên men vào khoảng 10m2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Khối lượng nấm men là 500 kg so với trâu bò cùng khối lượng thì một ngày đêm nấm men tổng n 5 hợp được 50 tấn protein, còn trâu bò chỉ tổng hợp được 0,5 kg (như vậy gấp 100,000 lần).

Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không khác mấy so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men chỉ số này là 1,055 – 1,060, ở vi khuẩn 1,050 - 1,112) [5]. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ.) ở cơ thể xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp.

Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào. Vỏ tế bào: Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện.

Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Thành tế bào: Thành tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền cao, chiều dày là 150 – 250nm. Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ li ti để nước, đường và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào có thể đi qua được. Thành tế bào chiếm khoảng 20% tổng khối lượng chất khô của tế bào.

Thành tế bào có khoảng 90% là carbohydrat, phần còn lại là protein, trong số các carbohydrat, glucan là nhiều nhất, chúng chiếm khoảng 30 – 50% tổng lượng chất khô của thành tế bào. Các glucan sắp xếp thành các cấu trúc hình sợi nhỏ, dài, chúng liên kết với nhau bằng liên kết β-1,3 và β-1,6. Hầu hết cacbohydrat còn lại là mannoprotein. Nhiệm vụ của thành tế bào là bảo vệ tế bào trước các tác động bên ngoài, khống chế các quá trình trao đổi chất và áp suất thẩm thấu ở trong và ngoài tế bào, n 6 quyết định hình dáng của tế bào.

Thành tế bào quyết định sự tương tác giữa các tế bào với môi trường bên ngoài.