Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây, ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu.

• Tác giả: Trần Văn Nam
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Chí
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• MỤC LỤC
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng trên vỏ và dịch trái cây
• 2.2. Đặc điểm chung của nấm men
• 2.3. Thành phần hóa học của nấm men
• 2.4. Đặc điểm hình thái của nấm men
• 2.5. Cấu tạo tế bào nấm men
• 2.6. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men
• 2.7. Sự sinh sản của nấm men
• 2.8. Nhu cầu dinh dưỡng của nấm men
• 2.9. Sự trao đổi chất của nấm men
• 2.10. Phân loại nấm men
• 2.11. Vai trò của nấm men
• 2.12. Ứng dụng của nấm men
• 2.13. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.13.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2.13.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
• 3.4. Dụng cụ và thiết bị sử dụng
• 3.5. Môi trường nuôi cấy
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp thu nhận mẫu
• 3.7.2. Phương pháp pha loãng mẫu
• 3.7.3. Phương pháp phân lập và tuyển chọn nấm men tổng số
• 3.7.4. Phương pháp cấy chuyển và giữ giống
• 3.7.5. Quan sát chủng giống qua khuẩn lạc
• 3.7.6. Xác định khả năng lên men qua khả năng sinh khí
• 3.7.7. Thử khả năng catalaza
• 3.7.8. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo OD
• 3.7.9. Phương pháp chưng cất xác định nồng độ cồn
• 3.7.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men từ vỏ quả một số loại quả
• 4.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu tốt nhất
• 4.2.1. Thử khả năng lên men
• 4.2.2. Thử khả năng lên men đường saccharose và maltose
• 4.2.3. Kết quả thí nghiệm khả năng tăng sinh
• 4.2.4. Nghiên cứu khả năng sinh rượu của các chủng nấm men đã chọn
• 4.2.4.1. Định danh sơ bộ chủng VPk1
• 4.2.4.2. Quan sát hình thái tế bào
• 4.2.4.3. Thử nghiệm catalase
• 4.3. Tối ưu hóa điều kiện môi trường sinh trưởng và phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1
• 4.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 4.3.2. Ảnh hưởng của pH
• 4.3.3. Khả năng sử dụng nguồn nitơ (peptone)
• 4.3.4. Khả năng sử dụng nguồn carbon (đường glucose)
• 4.3.5. Thử khả năng lên men trên môi trường dịch quả
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 5.1. Tài liệu Tiếng Việt
• 5.2. Tài liệu tiếng anh
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận văn thạc sĩ 'Phân lập và tuyển chọn nấm men lên men rượu cao từ vỏ trái cây' tập trung vào việc tìm kiếm và chọn lọc các chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao từ nguồn nguyên liệu là vỏ trái cây. Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập nấm men từ các loại vỏ trái cây khác nhau, sau đó tuyển chọn nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất để ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu. Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao, góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất rượu từ trái cây.

1.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu giúp củng cố kiến thức về nấm men và quá trình lên men, đồng thời rèn luyện kỹ năng nghiên cứu khoa học cho sinh viên. Việc phân lập nấm men từ vỏ trái cây cũng mở ra hướng đi mới trong việc tìm kiếm các chủng nấm men tự nhiên có tiềm năng ứng dụng cao.

1.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trực tiếp vào sản xuất rượu từ trái cây, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Đây cũng là nguồn tài liệu tham khảo quý giá cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm.

II. Tổng quan về nấm men và quá trình lên men

Nấm men là vi sinh vật đơn bào, có khả năng sống trong môi trường giàu đường và chất dinh dưỡng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men, đặc biệt là trong sản xuất rượu. Các chủng nấm men rượu như Saccharomyces cerevisiae thường được sử dụng phổ biến do khả năng lên men mạnh và ổn định. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm kiếm các chủng nấm men từ trái cây có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất rượu.

2.1. Đặc điểm của nấm men

Nấm men có cấu tạo tế bào phức tạp, bao gồm thành tế bào, màng tế bào chất và các bào quan như ti thể. Chúng có khả năng sinh sản bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào. Nấm men cũng có khả năng thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau, từ môi trường hiếu khí đến yếm khí.

2.2. Quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hóa đường thành rượu và CO2 nhờ hoạt động của nấm men. Quá trình này phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, nồng độ đường và nguồn dinh dưỡng. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao nhất.

III. Phương pháp nghiên cứu và kết quả

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp phân lập nấm men từ vỏ trái cây, sau đó tiến hành tuyển chọn nấm men dựa trên khả năng lên men và sinh trưởng. Các chủng nấm men được đánh giá qua khả năng sinh khí, tăng sinh khối và sản xuất rượu. Kết quả cho thấy chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 có hoạt lực lên men cao nhất và được chọn để nghiên cứu sâu hơn.

3.1. Phân lập nấm men

Các mẫu vỏ trái cây được thu thập và xử lý để phân lập nấm men. Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy trên môi trường Hansen và quan sát hình thái khuẩn lạc. Các chủng nấm men được phân lập sau đó được đánh giá về khả năng lên men.

3.2. Tuyển chọn nấm men

Các chủng nấm men được tuyển chọn dựa trên khả năng lên men đường saccharose và maltose, cũng như khả năng tăng sinh khối. Chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 được xác định là chủng có hoạt lực lên men cao nhất và được chọn để nghiên cứu sâu hơn.

IV. Ứng dụng và kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập và tuyển chọn nấm men có khả năng lên men rượu cao từ vỏ trái cây. Chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 được xác định là chủng có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất rượu. Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao chất lượng rượu mà còn mở ra hướng đi mới trong việc tận dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất rượu

Chủng nấm men được tuyển chọn có thể ứng dụng trực tiếp vào sản xuất rượu từ trái cây, giúp tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Nghiên cứu cũng góp phần đa dạng hóa các sản phẩm rượu trên thị trường.

4.2. Kết luận

Nghiên cứu đã đạt được mục tiêu đề ra, phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men cao. Kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển công nghệ sản xuất rượu từ nguồn nguyên liệu tự nhiên.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Ngành công nghiệp chế biến đồ uống lên men và rượu vang hoa quả tại Việt Nam đang trên đà tăng trưởng mạnh mẽ với tốc độ trung bình từ 8.5% - 10%/năm. Tuy nhiên, phần lớn các cơ sở sản xuất trong nước vẫn đối mặt với rào cản kỹ thuật lớn: phụ thuộc vào các chủng nấm men thương mại nhập khẩu đắt đỏ (như Lalvin EC-1118, Maurivin) hoặc sử dụng bánh men truyền thống không thuần khiết, dẫn đến hiệu suất lên men bấp bênh, hương vị thiếu đồng nhất và tỷ lệ nhiễm tạp cao. Trong khi đó, hệ vi sinh vật bản địa trên vỏ các loại trái cây nhiệt đới tại Việt Nam chứa nguồn tài nguyên di truyền nấm men vô cùng phong phú nhưng chưa được khai thác bài bản.

Thực trạng phân bố vi sinh vật tự nhiên trên vỏ quả tươi rất phức tạp: nấm mốc chiếm ưu thế áp đảo từ 76% – 90%, vi khuẩn và xạ khuẩn chiếm tỷ lệ nhỏ, còn nấm men chỉ chiếm từ 9% – 22%. Trong đó, nhiều chủng men dại như Hanseniaspora apiculata, Pichia spp., hay Zygopichia có thể gây đục dịch vang và tạo mùi khó chịu. Do đó, việc phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các dòng thuần chủng có hoạt lực cao là mắt xích sống còn trong công nghệ sinh học thực phẩm.

       [Hệ vi sinh vật vỏ trái cây]

Đề tài "Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây" được thực hiện nhằm giải quyết dứt điểm bài toán chất lượng giống men bản địa. Dự án xác lập 5 mục tiêu trọng tâm:

1. Thu thập và phân lập tập đoàn nấm men tổng số từ 42 mẫu vỏ trái cây sạch tại Nghệ An, Vĩnh Phúc, Thanh Hóa và Thái Nguyên.
2. Sàng lọc sơ bộ và thứ cấp để tuyển chọn chủng nấm men thuần khiết có tốc độ sinh khí $CO_2$ và khả năng chuyển hóa đường mạnh nhất.
3. Đánh giá phổ đồng hóa carbohydrate đa dạng (Glucose, Saccharose, Maltose).
4. Định danh sơ bộ hình thái, tế bào học và thử nghiệm sinh hóa (Catalase test) của chủng ưu tú nhất.
5. Tối ưu hóa các thông số công nghệ nuôi cấy (Nhiệt độ, pH, nồng độ Peptone, nồng độ cơ chất ${}^\circ\text{Brix}$) và thử nghiệm lên men trên dịch quả tự nhiên.

Phạm vi và giới hạn đề tài: Nghiên cứu tập trung vào 50 chủng nấm men phân lập từ vỏ 12 loại trái cây nhiệt đới; quy trình lên men đánh giá ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác $250\text{ ml}$ đến $1000\text{ ml}$) trên môi trường Hansen tiêu chuẩn và dịch quả nho tự nhiên.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí	Lên men tự nhiên (Wild Fermentation)	Bánh men thuốc bắc truyền thống	Men thuần chủng nhập khẩu	Chủng phân lập bản địa (S. cerevisiae VPk1)
Độ thuần khiết	Rất thấp, nguy cơ tạp nhiễm mốc/khuẩn	Thấp ($10^7 - 10^8\text{ CFU/g}$ lẫn tạp)	Tuyệt đối ($100%$ thuần khiết)	Thuần khiết ($100%$ đơn dòng)
Tốc độ lên men	Chậm ($>72\text{h}$ bắt đầu sủi bọt)	Không đồng đều ($36 - 48\text{h}$)	Nhanh ($18 - 24\text{h}$)	Vượt trội ($16\text{h}$ đạt $5\text{ ml } CO_2$)
Khả năng chịu cồn	Yếu ($<8%\text{ v/v}$)	Trung bình ($8 - 10%\text{ v/v}$)	Cao ($13 - 15%\text{ v/v}$)	Tốt ($11.5 - 12.5%\text{ v/v}$)
Chi phí giống	$0\text{ VNĐ}$	Thấp	Rất cao (chi phí bản quyền, nhập ngoại)	Tối ưu hóa tại chỗ, giá thành rẻ
Khả năng thích ứng	Phụ thuộc mùa vụ	Khó kiểm soát chất lượng	Nhạy cảm với dịch quả nhiệt đới	Thích nghi hoàn hảo với cơ chất quả Việt Nam

Ràng buộc và thách thức kỹ thuật

• Áp suất thẩm thấu cao: Khi nồng độ đường dịch quả vượt ngưỡng $25 - 30%$, tế bào nấm men bị teo nguyên sinh chất, ức chế enzyme nội bào.
• Sự cạnh tranh sinh học: Nấm mốc (Aspergillus niger, Mucor) và vi khuẩn axetic phát triển nhanh chóng làm chua hóa và hỏng dịch lên men.
• Ức chế sản phẩm: Hàm lượng ethanol $>10%$ và khí $CO_2$ hòa tan có thể gây độc màng tế bào nấm men nếu chủng không có tính chống chịu tốt.

Thiết kế hệ thống và quy trình kỹ thuật

Hệ thống môi trường và thiết bị được chuẩn hóa phục vụ phân lập và kiểm định bao gồm:

• Môi trường dinh dưỡng chuẩn Hansen: Glucose ($20\text{ g/L}$), Peptone ($10\text{ g/L}$), $\text{KH}_2\text{PO}_4$ ($3\text{ g/L}$), $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ ($2.5\text{ g/L}$), Agar ($20\text{ g/L}$ đối với môi trường đặc), nước cất định mức $1000\text{ ml}$. Khử trùng bằng nồi hấp MITECOM ở $121^\circ\text{C}$, áp suất $1\text{ atm}$ trong $30\text{ phút}$.
• Thiết bị đo quang phổ: Máy quang phổ UV-VIS Labomed (bước sóng $\lambda = 620\text{ nm}$).
• Hệ thống chưng cất và kiểm định cồn: Bộ chưng cất thủy tinh $250\text{ ml}$, cồn kế tiêu chuẩn kèm bảng hiệu chỉnh nhiệt độ tại $20^\circ\text{C}$.

[42 mẫu vỏ trái cây sạch] 
[Cấy trải đĩa Petri môi trường Hansen (pH 5.0, 30°C, 48h)]
[50 chủng nấm men thuần khiết (Thạch nghiêng 4°C)]
[12 chủng nấm men ưu tú]
[Tuyển chọn chủng xuất sắc nhất: VPk1]
[Lên men thử nghiệm trên dịch quả nho 19°Brix -> Rượu vang đạt 11.5 - 12.5% ABV]

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực nghiệm vi sinh vật học cổ điển kết hợp động học hóa sinh:

• Phương pháp cấy trang phân lập: Sử dụng que gạt thủy tinh vô trùng trải đều $100\ \mu\text{l}$ dịch mẫu pha loãng ($10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}$) lên đĩa thạch.
• Phương pháp ống Durham: Đo thể tích khí $CO_2$ sinh ra tích tụ trong ống mao dẫn thẳng đứng để đánh giá động lực học lên men.
• Phương pháp đo mật độ quang học (OD): Theo dõi sinh khối nấm men tại bước sóng $620\text{ nm}$ trong $48\text{ giờ}$ nuôi cấy lắc ($150\text{ rpm}$, $30^\circ\text{C}$).
• Xử lý số liệu: Thống kê sinh học bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và IRRISTAT v5.0.

---

Implementation và kết quả

Quy trình triển khai và cơ chế phản ứng sinh hóa

Quá trình chuyển hóa đường thành cồn ethyl và carbon dioxide tuân theo con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và hệ enzyme phức hợp zymase:

$$\text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6 + 2\text{ADP} + 2\text{H}_3\text{PO}_4 \xrightarrow{\text{Zymase complex}} 2\text{C}_2\text{H}_5\text{OH} + 2\text{CO}_2 \uparrow + 2\text{ATP} + 2\text{H}_2\text{O}$$

Khi đường đôi được sử dụng, enzyme ngoại bào/nội bào xúc tác phân giải trước khi vào chu trình EMP:

• Thủy phân Saccharose: $\text{C}{12}\text{H}{22}\text{O}_{11} + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{Invertase}} \text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6\ (\text{Glucose}) + \text{C}6\text{H}{12}\text{O}_6\ (\text{Fructose})$
• Thủy phân Maltose: $\text{C}{12}\text{H}{22}\text{O}_{11} + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{Maltase}} 2\text{ C}6\text{H}{12}\text{O}_6\ (\text{Glucose})$

Công thức xác định nồng độ cồn thực tế trong dịch giấm chín sau chưng cất:

$$N_1 = \frac{N_2 \times V_2}{V_1}$$

Trong đó: $N_1$ là nồng độ cồn trong dịch giấm chín ($%\text{ v/v}$); $N_2$ là độ cồn đo được trên cồn kế sau khi hiệu chỉnh ở $20^\circ\text{C}$; $V_1$ là thể tích dịch giấm đem chưng cất ($100\text{ ml}$); $V_2$ là thể tích rượu ngưng tụ thu được ($50\text{ ml}$).

Kết quả sàng lọc và tuyển chọn chủng ưu tú

Từ 42 mẫu trái cây thu thập, 50 chủng nấm men thuần khiết đã được lập mã số (NA: Nghệ An, VP: Vĩnh Phúc, TN: Thái Nguyên, TH: Thanh Hóa, C: Mẫu chợ).

1. Sàng lọc sơ cấp trên cơ chất Glucose

Thời gian sinh đủ $5\text{ ml } CO_2$ làm nổi hoàn toàn ống Durham được ghi nhận:

• Nhóm hoạt lực cao ($16 - 20\text{h}$): 12 chủng gồm VPk1 ($16\text{h}$), NAld2 ($17\text{h}$), THd1 ($20\text{h}$), THd3 ($20\text{h}$), THd4 ($20\text{h}$), NAo1 ($20\text{h}$)...
• Nhóm hoạt lực trung bình ($24 - 36\text{h}$): 21 chủng (TNc4, TNq1, THd5, VPc2...).
• Nhóm hoạt lực yếu/không nổi ($>48\text{h}$): 17 chủng (TNc1, TNc6, TNc10, Cnh3, Cnh4...).

2. Sàng lọc thứ cấp trên cơ chất Saccharose và Maltose

Ký hiệu chủng	Nguồn gốc mẫu phân lập	Thời gian làm nổi ống Durham trên Saccharose (giờ)	Thời gian làm nổi ống Durham trên Maltose (giờ)	Đánh giá khả năng đồng hóa đa đường
VPk1	Vỏ khế (Vĩnh Phúc)	22.3	19.3	Tốt nhất toàn diện
NAo1	Vỏ ổi (Nghệ An)	22.0	23.0	Rất tốt
NAld2	Vỏ quả lòng đỏ (Nghệ An)	24.0	19.0	Rất tốt
THd3	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	24.0	24.0	Tốt
TNc4	Vỏ chuối (Thái Nguyên)	24.0	36.0	Trung bình (yếu trên Maltose)
THd1	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	$>48.0$	$>48.0$	Kém (không sinh enzyme maltase/invertase)
THd5	Vỏ dứa (Thanh Hóa)	24.0	$>48.0$	Không lên men được Maltose
NAna1	Vỏ na (Nghệ An)	$>48.0$	24.0	Không lên men được Saccharose

Chủng VPk1 chứng tỏ ưu thế tuyệt đối khi chỉ mất $16\text{h}$ trên Glucose, $19.3\text{h}$ trên Maltose và $22.3\text{h}$ trên Saccharose, cho thấy hệ enzyme invertase và maltase hoạt động cực kỳ đồng bộ.

Thời gian làm nổi ống Durham trên cơ chất Maltose (giờ - Càng thấp càng tốt)
VPk1   ███████████████████▍ 19.3h
NAld2  ███████████████████ 19.0h
NAo1   ███████████████████████ 23.0h
THd3   ████████████████████████ 24.0h
TNc4   ████████████████████████████████████ 36.0h
THd1   ████████████████████████████████████████████████ (>48.0h)

3. Định danh và đặc tính sinh học của chủng VPk1

• Hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bề mặt mịn, mép nguyên, đường kính $3.0\text{ mm}$ sau 48h nuôi cấy.
• Tế bào học: Tế bào hình cầu hoặc ovan elip ($6 - 8\ \mu\text{m} \times 8 - 12\ \mu\text{m}$), phương thức sinh sản vô tính bằng nảy chồi đa cực.
• Thử nghiệm Catalase: Nhỏ dung dịch $H_2O_2\ 30%$ lên khối tế bào xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí oxy mãnh liệt ($2\text{H}_2\text{O}_2 \xrightarrow{\text{Catalase}} 2\text{H}_2\text{O} + \text{O}_2 \uparrow$), chứng minh chủng thuộc nhóm kỵ khí tùy tiện mang enzyme catalase bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa tự do. Sơ bộ định danh là Saccharomyces cerevisiae VPk1.

4. Kết quả tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chủng VPk1

• Nhiệt độ tối ưu: $30^\circ\text{C}$ (Mật độ quang $OD_{620}$ đạt cực đại $1.845$ sau $36\text{h}$; suy giảm mạnh khi $<20^\circ\text{C}$ hoặc $>38^\circ\text{C}$).
• pH môi trường tối ưu: $\text{pH } 4.5 - 5.0$ ($OD_{620} = 1.820$; tại $\text{pH } 3.0$ sinh trưởng bị ức chế $42%$, tại $\text{pH } 7.0$ bị ức chế $35%$).
• Hàm lượng Peptone (Nguồn Nitơ hữu cơ): $1.0% - 1.5%\text{ w/v}$ cung cấp đầy đủ chuỗi peptide và amino acid cho sinh tổng hợp sinh khối.
• Nồng độ đường (Cơ chất Carbon): Môi trường chứa $18% - 20%$ Glucose cho hiệu suất tích lũy cồn cao nhất.
• Thử nghiệm lên men dịch quả nho ($19^\circ\text{Brix}$): Sau 7 ngày lên men chính tại $28 - 30^\circ\text{C}$, dịch dấm chín qua chưng cất kiểm nghiệm đạt nồng độ ethanol $11.8%\text{ v/v} \pm 0.3%$, dịch rượu trong, có mùi thơm este hoa quả tự nhiên, không có mùi chua axetic.

---

Đổi mới và đóng góp

Nghiên cứu mang lại những cải tiến kỹ thuật rõ rệt khi so sánh với các công trình nghiên cứu và giải pháp công nghệ trước đây:

Tốc độ lên men pha khởi động (Lag phase) so với các chủng đối chứng
Chủng dại trung bình (Vỏ quả)  [========= 24 giờ =========]
Chủng men dưa hấu (N.T.P. Dung) [====== 18 giờ ======]
Chủng S. cerevisiae VPk1       [==== 16 giờ ====] (-33.3% thời gian trễ)

1. Rút ngắn thời gian khởi động lên men (Lag-phase): Chủng S. cerevisiae VPk1 chỉ mất 16 giờ để sinh $5\text{ ml } CO_2$, nhanh hơn 33.3% so với chủng men dưa hấu phân lập của Ngô Thị Phương Dung et al. ($18 - 24\text{ giờ}$) và nhanh hơn 60% so với trung bình các chủng nấm men dại thông thường ($36 - 48\text{ giờ}$).
2. Khả năng đồng hóa đa cơ chất vượt trội: Khác với nghiên cứu của Lý Nguyễn Bình et al. (2015) trên men rượu truyền thống (chỉ có 3/17 chủng đồng hóa tốt cả 3 loại đường), chủng VPk1 chuyển hóa đồng thời cả Glucose, Saccharose và Maltose với thời gian trễ dưới 23 giờ.
3. Hiệu suất sinh cồn tự nhiên cao không cần bổ sung hóa chất: Đạt nồng độ cồn $11.8%\text{ v/v}$ trên dịch quả tự nhiên $19^\circ\text{Brix}$ mà không cần bổ sung chất kích kháng hay muối amoni vô cơ, vượt qua mức $10.5%\text{ v/v}$ của dòng men đu đủ do Panneerselvam (2011) phân lập.
4. Bảo tồn và đa dạng hóa nguồn gen vi sinh vật Việt Nam: Bổ sung vào ngân hàng chủng giống vi sinh vật quốc gia một chủng nấm men rượu đặc hữu từ vỏ khế vùng trung du Bắc Bộ có khả năng thích nghi cao với điều kiện nhiệt đới nóng ẩm.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng công nghiệp

• Sản xuất rượu vang quả đặc sản địa phương: Triển khai quy trình lên men cho các hợp tác xã chế biến nông sản (vang nho Ninh Thuận, vang dâu tằm Đà Lạt, vang thanh long Bình Thuận, vang mận Bắc Hà).
• Sản xuất chế phẩm men khô hoạt tính sinh học (Active Dry Yeast): Nhân giống sinh khối quy mô công nghiệp từ rỉ đường hoặc phụ phẩm tinh bột để làm giống khởi động dạng bột đóng gói chân không.
• Tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp: Lên men dịch ép từ vỏ/thịt quả loại thải nhằm sản xuất cồn sinh học (Bio-ethanol) và thu hồi sinh khối nấm men giàu đạm ($45 - 50%$ protein thô) làm thức ăn chăn nuôi.

Lộ trình nhân rộng công nghệ (Scaling Roadmap)

[Quy mô Lab]                 [Pilot Bioreactor]              [Quy mô Công nghiệp]
- Kiểm soát T°, pH           - Cánh khuấy tự động            - Tự động hóa CIP/SIP
- Đo OD, Brix, Durham        - Cấp khí vô trùng              - Kiểm soát áp suất CO2
- Thời gian: 6 tháng         - Thời gian: 9 tháng            - Thời gian: 12 tháng

Phân tích hiệu quả kinh tế (Cost-Benefit Analysis)

• Tiết kiệm chi phí giống men: Giảm $65 - 75%$ chi phí mua men giống ngoại nhập (ước tính tiết kiệm $15.000.000 - 25.000.000\text{ VNĐ}$ cho mỗi $10.000\text{ lít}$ dịch vang sản xuất).
• Gia tăng giá trị nông sản: Tận dụng trái cây vào mùa thu hoạch rộ, nâng cao giá trị quả tươi lên $300 - 400%$ thông qua chế biến sâu thành đồ uống có cồn cao cấp.
• Thời gian hoàn vốn (ROI): Ước tính từ $14 - 18\text{ tháng}$ cho một dây chuyền xưởng vang hoa quả công suất $50.000\text{ lít/năm}$.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Phương pháp định danh: Mới chỉ dừng lại ở phân tích hình thái tế bào, đặc tính khuẩn lạc và thử nghiệm sinh hóa cổ điển; chưa tiến hành giải trình tự phân tử đoạn gen 18S rRNA hoặc vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) để xác định cây phát sinh chủng loại chi tiết.
• Phân tích cấu tử hương: Chưa ứng dụng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để định lượng các hợp chất bay hơi bậc cao (higher alcohols, ethyl esters, acetate esters) quyết định hương vị đặc trưng của rượu.
• Công nghệ bảo quản: Giống hiện duy trì trên thạch nghiêng ở $4^\circ\text{C}$ với chu kỳ cấy chuyền $2 - 3\text{ tuần/lần}$, tiềm ẩn nguy cơ thoái hóa giống và đột biến ngẫu nhiên theo thời gian.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

1. Giải trình tự gen $18S\text{ rRNA}/ITS$ và đăng ký mã định danh trên ngân hàng gen quốc tế GenBank (NCBI).
2. Nghiên cứu công nghệ sấy phun vi bao (Microencapsulation) với chất mang maltodextrin/alginate để sản xuất men khô dạng hạt có tỷ lệ sống sót $>85%$.
3. Đánh giá tính kháng kháng sinh và tính chịu ethanol ở nồng độ cao ($>15%\text{ v/v}$) thông qua kỹ thuật thích nghi tiến hóa trong phòng thí nghiệm (Adaptive Laboratory Evolution - ALE).

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên ngành CNSH / CNTP: Nắm vững cẩm nang thực hành chuẩn hóa từ kỹ thuật pha loãng thập phân, đổ đĩa vô trùng, bẫy khí Durham đến động học tăng trưởng tế bào.
• Kỹ sư công nghệ lên men (Brewers / Winemakers): Tiếp cận bộ thông số vận hành thực nghiệm chính xác (nhiệt độ $30^\circ\text{C}$, $\text{pH } 4.5 - 5.0$, $18 - 20^\circ\text{Brix}$) để ứng dụng ngay vào điều khiển mẻ lên men.
• Doanh nghiệp & Hợp tác xã chế biến thực phẩm: Làm chủ chủng giống bản địa năng suất cao, độc lập tự chủ nguồn nguyên liệu vi sinh và cắt giảm chi phí sản xuất.
• Nhà nghiên cứu vi sinh vật học: Sở hữu dữ liệu đối chiếu khoa học về phổ phân bố nấm men trên vỏ trái cây nhiệt đới tại các tiểu vùng khí hậu miền Bắc và miền Trung Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai nhân giống chủng VPk1 là gì?

Cần trang bị tủ cấy vô trùng dòng khí thổi đứng (Laminar Airflow Hood), nồi hấp tiệt trùng $121^\circ\text{C}$, máy lắc ổn nhiệt ($150\text{ rpm}$, $30^\circ\text{C}$), môi trường Hansen đạt chuẩn ($\text{pH } 5.0$) và nguồn giống cấy ban đầu có mật độ đạt xấp xỉ $10^6 - 10^7\text{ CFU/ml}$.

2. Chủng S. cerevisiae VPk1 có giới hạn nồng độ đường lên men tối đa là bao nhiêu?

Chủng phát triển tối ưu trong khoảng $18 - 20^\circ\text{Brix}$. Khi nồng độ đường vượt quá $25 - 28^\circ\text{Brix}$, áp suất thẩm thấu tăng làm kéo dài pha lag; do đó đối với dịch quả có độ ngọt cao, cần áp dụng phương pháp bổ sung đường ngắt quãng (châm đường chia làm 2 - 3 đợt trong quá trình lên men chính).

3. Có thể dùng chủng VPk1 để lên men các loại dịch quả có tính axit cao như dứa, chanh leo không?

Hoàn toàn khả thi. Chủng VPk1 chịu được môi trường $\text{pH}$ xuống đến $3.5$. Tuy nhiên, với các loại quả quá chua ($\text{pH} < 3.2$), cần hiệu chỉnh $\text{pH}$ dịch quả lên ngưỡng $4.0 - 4.5$ bằng $\text{CaCO}_3$ thực phẩm hoặc $\text{K}_2\text{CO}_3$ để đạt tốc độ lên men và độ cồn tối đa.

4. Cách bảo quản giống nấm men VPk1 lâu dài tránh thoái hóa?

Để lưu trữ ngắn hạn ($1 - 3\text{ tháng}$), giữ giống trên thạch nghiêng Hansen ở $0 - 4^\circ\text{C}$. Để bảo quản trung và dài hạn ($1 - 3\text{ năm}$), phân lập sinh khối tế bào hòa trong dung dịch Glycerol $20 - 30%$ và trữ đông sâu tại $-80^\circ\text{C}$ hoặc tiến hành đông khô (Lyophilization).

5. Chi phí đầu tư phòng nuôi cấy và thời gian thu hồi vốn sản xuất men giống?

Quy mô phòng nhân giống vi sinh cấp xưởng vừa và nhỏ cần chi phí thiết bị khoảng $60.000.000 - 100.000.000\text{ VNĐ}$. Với công suất cung cấp men cho các xưởng vang quy mô $30.000 - 50.000\text{ lít/năm}$, thời gian thu hồi vốn đầu tư cho hệ thống giống chỉ mất khoảng $8 - 12\text{ tháng}$.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc toàn bộ các mục tiêu đặt ra: phân lập thành công 50 chủng nấm men từ 42 mẫu vỏ trái cây và tuyển chọn được chủng Saccharomyces cerevisiae VPk1 mang đặc tính công nghệ vượt trội. Chủng VPk1 sở hữu hoạt tính enzyme kép (Invertase và Maltase) mạnh mẽ, thời gian lên men nhanh ($16\text{h}$ sinh $5\text{ ml } CO_2$), thích nghi hoàn hảo ở điều kiện $30^\circ\text{C}$, $\text{pH } 4.5 - 5.0$, tạo độ cồn đạt $11.8%\text{ v/v}$ trên dịch quả tự nhiên.

Kết quả này không chỉ mang giá trị học thuật sâu sắc trong việc giải mã và lưu trữ nguồn gen vi sinh vật bản địa, mà còn mở ra hướng đi thực tiễn đầy tiềm năng cho ngành sản xuất đồ uống lên men chất lượng cao tại Việt Nam. Quý bạn đọc, cơ sở sản xuất và các nhà nghiên cứu quan tâm phát triển công nghệ có thể kết nối để tiếp nhận chuyển giao quy trình kỹ thuật hoặc hợp tác mở rộng quy mô pilot.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ở nước ta, rượu là một thức uống có cồn rất phổ biến, mang đậm tính truyền thống, gắn bó lâu đời và không thể thiếu được trong cuộc sống tinh thần và văn hóa dân tộc. Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại rượu nổi tiếng như rượu ngô Bản Phố, một loại rượu đặc sản của người Mông ở Bản Phố, cao nguyên Bắc Hà, Lào Cai; rượu Làng Vân, đặc sản cổ truyền Bắc Giang; rượu Bầu Đá, đặc sản của miền đất võ Bình Định; rượu Gò Đen của quê hương Long An; rượu Phú Lễ của miền đất Đồng khởi Bến Tre; rượu Xuân Thạnh của Trà Vinh [1]. Bên cạnh những loại rượu truyền thống đấy giờ đây ở trên thị trường nước ta còn du nhập thêm rượu vang từ các nước phương tây. Chế biến rượu vang quả đối với các nước trên thế giới đã là một nghề cổ xưa nhưng ở Việt Nam chỉ mới xuất hiện vài chục năm gần đây [7].

Việc tiêu thụ rượu vang tuy không mạnh nhưng từng bước được người tiêu dùng ưa chuộng do có độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, có tác dụng kích thích tiêu hoá… và rượu vang dần dần được chọn thay cho các loại rượu mạnh [7] trong các dịp lễ tết. Tuy nhiên, ngành công nghiệp sản xuất rượu vang ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế, chưa thực sự đáp ứng được yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng. Nghiên cứu nâng cao chất lượng rượu vang là vấn đề rất được quan tâm hiện nay. Một trong những phương pháp cải tiến chất lượng là sử dụng nguồn nấm men tự nhiên được phân lập từ nguyên liệu cho quá trình sản xuất rượu vang sẽ cho rượu có độ cồn cao, chất lượng rượu ổn định và mùi vị đặc trưng [15].

Xuất phát tử thực tế đó em xin thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao trên vỏ trái cây”. Hoạt động này giúp cải thiện và tăng cường chất lượng rượu vang, góp phần đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị kinh tế của các loại quả và phần nào đáp ứng nhu cầu sử dụng các dạng nước uống có cồn đa dạng hiện nay. Mục tiêu của đề tài Phân lập được các chủng nấm men từ vỏ quả ở các vùng miền khác nhau. n 2 Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao nhất trong các chủng đã phân lập được.

Yêu cầu của đề tài Phân lập được chủng nấm men có trên vỏ quả. Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men rượu cao nhất để sản xuất rượu vang. Sơ bộ định danh chủng có hoạt lực cao nhất trong sản xuất rượu vang. Tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng và phát triển của chủng đã tuyển chọn.

Thử khả năng lên men trên môi trường dịch quả cho chủng tốt nhất. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học. Củng cố cho sinh viên tác phong cũng như kỹ năng làm việc sau này.

Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu sẽ xác định được chủng nấm men có khả năng lên men cao, ứng dụng trong ngành sản xuất rượu vang, cũng như các sản phẩm len men khác. Đem lại năng suất, chất lượng cao. Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thuộc cùng lĩnh vực.

n 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng trên vỏ và dịch trái cây. Hệ vi sinh vật trên vỏ và dịch trái cây tương đối phong phú và phức tạp. trong đó nấm mốc (76 – 90%), nấm men (9 – 22%) còn lại chiếm tỷ lệ thấp là vi khuẩn không sinh bào tử hoặc có bào tử, xạ khuẩn và Micobacter.

 Nấm men - Nấm men rượu vang: Saccharomyces Vini và S. Hai loại này được dùng chủ yếu để lên men rượu vang. - Nấm men nhọn đầu: Hansenias pora apiculata giống men này làm giảm chất lượng vang. Giống men này rất phổ biến ở cỏ dại.

- Pichia có hình dáng ovan. Kích thước tế bào không lớn lắm (3,6 – 7,2 x 3 - 5µm). Giống men này làm hỏng vang. - Zygopichia làm đục vang sau khi chiết chai.

- Hansenula có khả năng sinh trưởng nhanh trên bề mặt dịch quả sinh trưởng được ở vang có 9 – 13% cồn. Nó là tác nhân mạnh mẽ tạo cho vang có các este bay hơi (làm vang có mùi thơm riêng biệt) nhưng đồng thời nó cũng làm đục vang.  Vi khuẩn và nấm mốc Hầu hết vi khuẩn đều gây “bệnh” cho vang nhưng có một loại thuộc vi khuẩn lactic phát triển biến axit malic thành axit lactic (lên men malo – lactic). Vi khuẩn này tham gia vào làm chín vang làm cho vang có mùi thơm hoàn thiện.

Trên vỏ trái cây cũng chứa các bào tử của giống Mucor, nấm hình chổi xuề hay bàn tay (mốc xanh) và As pergilusniger (mốc đen) là những tác nhân nguy hiểm cho vang nhưng cũng có nấm mốc Botrytis cinera làm tăng chất lượng cho vang [15]. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là loại vi sinh vật đơn bào, có khả năng sống trong môi trường dinh dưỡng có chứa đường, nitơ, photpho và các chất hữu cơ, vô cơ khác. Chúng là n 4 các vi sinh vật dị dưỡng có khả năng sống trong các môi trường hiếu khí và yếm khí [9]. Đa số chúng sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi hình thức phân cắt tế bào.

Thành tế bào có chứa manane. Nấm men sống và tồn tại phân bổ rất rộng rãi trong tự nhiên nhất là trong môi trường có chứa dịch đường, pH thấp ví dụ như trong môi trường dịch hoa quả, dịch rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, trong đất trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ [9]. Thành phần hóa học của nấm men Tế bào nấm men chứa đến 80% là nước. Bởi vậy, trong nấm men bia ép tỉ lệ giữa trọng lượng ướt và trọng lượng khô là 4:1.

Nguyên tố chủ yếu là carbon, chiếm < 50% chất khô. Các nguyên tố chính khác như oxy (30 – 35%), nitơ (75%) hydro (5%) và photpho (1%). Hàm lượng chất khoáng tổng số khoảng 5 - 10% chất khô của tế bào. Trong tế bào còn chứa rất nhiều các thành phần khác như nhôm, canxi, đồng, crom, sắt, chì, natri, kali, lưu huỳnh, magie, niken,.

Các nhóm thành phần chính gồm các chất cao phân tử, đó là các protein (40 – 45% chất khô), carbohydrat (30 – 35%), axit nucleic (6 – 8%) và lipit (4 – 5%). Thành phần chính xác của các nhóm cao phân tử trong mỗi chủng nấm men khác nhau do điều kiện nuôi cấy, pha phát triển [9]. Đặc điểm hình thái của nấm men Tế bào nấm men có hình dạng: Hình cầu, hình ovan hoặc là hình elip, hình quả chanh, hình trụ hình chùy hoặc đôi khi còn kéo dài thành sợi. Nấm men có thể thay đổi hình dáng và kích thước trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường môi trường xung quanh.

Hình thái của chúng không thay đổi chỉ ở các giống nuôi cấy khi còn trẻ trong các điều kiện môi trường tiêu chuẩn. So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn: Đường kính khoảng 7µm; chiều dài khoảng 8 – 12µm (1µm – micro mét = 10-6 m). Với kích thước này ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong 1 lít dịch lên men vào khoảng 10m2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm men với môi trường xung quanh là vô cùng to lớn. Khối lượng nấm men là 500 kg so với trâu bò cùng khối lượng thì một ngày đêm nấm men tổng n 5 hợp được 50 tấn protein, còn trâu bò chỉ tổng hợp được 0,5 kg (như vậy gấp 100,000 lần).

Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không khác mấy so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men chỉ số này là 1,055 – 1,060, ở vi khuẩn 1,050 - 1,112) [5]. Cấu tạo tế bào nấm men Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ.) ở cơ thể xuất hiện nhiều thể không thấy ở nhân sơ, như ti thể, lục lạp.

Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào. Vỏ tế bào: Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại các tác động bên ngoài và chất độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện.

Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các muối khoáng đi qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào. Thành tế bào: Thành tế bào bao bọc xung quanh tế bào, có độ bền cao, chiều dày là 150 – 250nm. Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ li ti để nước, đường và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào có thể đi qua được. Thành tế bào chiếm khoảng 20% tổng khối lượng chất khô của tế bào.

Thành tế bào có khoảng 90% là carbohydrat, phần còn lại là protein, trong số các carbohydrat, glucan là nhiều nhất, chúng chiếm khoảng 30 – 50% tổng lượng chất khô của thành tế bào. Các glucan sắp xếp thành các cấu trúc hình sợi nhỏ, dài, chúng liên kết với nhau bằng liên kết β-1,3 và β-1,6. Hầu hết cacbohydrat còn lại là mannoprotein. Nhiệm vụ của thành tế bào là bảo vệ tế bào trước các tác động bên ngoài, khống chế các quá trình trao đổi chất và áp suất thẩm thấu ở trong và ngoài tế bào, n 6 quyết định hình dáng của tế bào.

Thành tế bào quyết định sự tương tác giữa các tế bào với môi trường bên ngoài.