Nghiên cứu nhận diện và nhân bản gen defensin từ ruồi lính đen (Hermetia illucens) vào plasmid pTAG2

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học in silico identification and cloning of a defensin gene from the, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp

• Tác giả: Dinh Xuan Hoang
• Người hướng dẫn: Ph. Lê Minh Thông
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Nhận diện và nhân bản gen defensin từ ruồi lính đen (Hermetia illucens) vào plasmid pTAG2
• Loại tài liệu: Graduate thesis
• Năm xuất bản: 2019-2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• AFFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• 1. CHƯƠNG 1: TÓM TẮT
• 2. CHƯƠNG 2: INTRODUCTION
• 2.1. Antimicrobial peptides (AMPs)
• 2.2. Mechanisms of action
• 2.3. Insect defensins
• 2.4. Black soldier fly (Hermetia illucens)
• 3. CHƯƠNG 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and location of the study
• 3.2. Materials and reagents
• 3.3. Identification of Candidate Defensin Genes from BSF Genomes
• 3.4. Evaluation of Physicochemical Properties
• 3.5. Verification of transformants with DNA insert using PCR
• 3.6. Competent Cell Preparation
• 4. CHƯƠNG 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Antimicrobial activity prediction
• 4.2. The 3D structure analysis of chr1_def4
• 4.3. Primer design and PCR amplification
• 4.4. PCR amplicons purification and sequencing
• 5. CHƯƠNG 5: CONCLUSION AND FUTURE WORK
• APPENDIX
• appendix.1. LIST OF ABBREVIATIONS
• appendix.2. LIST OF TABLES
• appendix.3. LIST OF FIGURES

Tóm tắt

I. Tổng quan về gen defensin từ ruồi lính đen Hermetia illucens

Gen defensin là một trong những thành phần quan trọng trong hệ miễn dịch của nhiều loài động vật, bao gồm cả ruồi lính đen (Hermetia illucens). Nghiên cứu về gen này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phòng vệ tự nhiên mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong công nghệ sinh học. Ruồi lính đen được biết đến với khả năng sản xuất các peptid kháng vi khuẩn, có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như y tế và nông nghiệp.

1.1. Đặc điểm sinh học của ruồi lính đen Hermetia illucens

Ruồi lính đen là một loài côn trùng thuộc họ Stratiomyidae, nổi bật với khả năng phân hủy chất hữu cơ. Chúng có thể phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng và có vai trò quan trọng trong chu trình sinh thái.

1.2. Vai trò của gen defensin trong hệ miễn dịch

Gen defensin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây bệnh. Chúng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nấm và virus, giúp duy trì sức khỏe cho loài vật.

II. Thách thức trong việc nhân bản gen defensin từ ruồi lính đen

Việc nhân bản gen defensin từ ruồi lính đen gặp nhiều thách thức, bao gồm việc xác định chính xác các gen mã hóa và tối ưu hóa quy trình nhân bản. Các phương pháp truyền thống có thể không hiệu quả trong việc xử lý các gen phức tạp từ loài này.

2.1. Khó khăn trong việc xác định gen defensin

Xác định gen defensin từ genome của ruồi lính đen yêu cầu sử dụng các công nghệ tiên tiến như phân tích in silico và các thuật toán học máy để dự đoán các gen có khả năng mã hóa peptid kháng vi khuẩn.

2.2. Thách thức trong quy trình nhân bản gen

Quy trình nhân bản gen defensin cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác. Việc lựa chọn vectơ plasmid phù hợp như pTAG2 cũng là một yếu tố quan trọng.

III. Phương pháp xác định và nhân bản gen defensin

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp in silico để xác định gen defensin từ genome của ruồi lính đen. Sau đó, các gen này được nhân bản vào plasmid pTAG2 thông qua các thí nghiệm PCR và cloning.

3.1. Sử dụng công nghệ in silico để xác định gen

Công nghệ in silico cho phép phân tích genome của ruồi lính đen để tìm ra các gen defensin tiềm năng. Các thuật toán học máy được áp dụng để dự đoán hoạt tính kháng vi khuẩn của các gen này.

3.2. Quy trình PCR và cloning gen vào plasmid pTAG2

Quy trình PCR được thực hiện để khuếch đại gen defensin đã xác định, sau đó gen này được chèn vào plasmid pTAG2 để tạo ra các dòng tế bào biến đổi gen.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy gen defensin từ ruồi lính đen có khả năng kháng vi khuẩn mạnh mẽ. Việc nhân bản thành công gen này vào plasmid pTAG2 mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong y tế và nông nghiệp.

4.1. Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn của gen defensin

Các thí nghiệm cho thấy gen defensin từ ruồi lính đen có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn, bao gồm cả những chủng kháng thuốc. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng trong phát triển thuốc kháng sinh mới.

4.2. Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Gen defensin có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm sinh học mới, giúp cải thiện sức khỏe cây trồng và vật nuôi, đồng thời giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về gen defensin từ ruồi lính đen không chỉ cung cấp kiến thức mới về hệ miễn dịch của loài này mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y tế và nông nghiệp.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu gen defensin

Nghiên cứu gen defensin từ ruồi lính đen có thể giúp phát hiện ra các peptid kháng vi khuẩn mới, góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay.

5.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng các peptid kháng vi khuẩn trong thực tiễn, mở rộng khả năng ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự lạm dụng và sử dụng sai mục đích thuốc kháng sinh trong nhiều thập kỷ qua đã thúc đẩy sự tiến hóa nhanh chóng của các cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh. Nguy cơ bước vào kỷ nguyên "hậu kháng sinh" đang đặt ra gánh nặng lớn cho hệ thống y tế toàn cầu, đòi hỏi cấp thiết phải tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới có khả năng tiêu diệt hoặc vượt qua các cơ chế đề kháng này. Trong số các giải pháp tiềm năng, các peptid kháng khuẩn (Antimicrobial Peptides - AMPs), đặc biệt là nhóm defensin ở côn trùng, nhận được sự quan tâm lớn nhờ tính bảo thủ tiến hóa, phổ kháng khuẩn rộng và vai trò điều hòa miễn dịch bẩm sinh.

Ruồi lính đen (Hermetia illucens - BSF) là loài côn trùng có giá trị sinh thái và kinh tế cao, thường sinh sống và phân giải các nguồn chất thải hữu cơ giàu vi sinh vật. Môi trường sống đặc thù này tạo áp lực chọn lọc để ruồi lính đen phát triển hệ thống miễn dịch bẩm sinh mạnh mẽ với nguồn AMPs dồi dào. Tuy nhiên, các nghiên cứu miễn dịch học phân tử và khai phá hệ gen của loài này vẫn còn hạn chế so với các loài côn trùng mô hình. Việc kết hợp các công cụ tin sinh học (in silico) với thực nghiệm sinh học phân tử để nhận diện và nhân bản gen defensin từ Hermetia illucens có ý nghĩa quan trọng trong việc khám phá các ứng viên kháng khuẩn mới phục vụ y học và xử lý môi trường.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của đề tài là nhận diện và phân tích các gen giả định mã hóa defensin trong hệ gen ruồi lính đen (Hermetia illucens) thông qua các thuật toán học máy và công cụ dự đoán in silico, từ đó lựa chọn ứng viên tiềm năng nhất để khuếch đại và tách dòng vào plasmid pTAG2. Nghiên cứu thực hiện 3 nội dung chính:

1. Nội dung 1 (Content 1): Nhận diện in silico các gen defensin ứng viên từ dữ liệu hệ gen ruồi lính đen.
2. Nội dung 2 (Content 2): Thiết kế mồi và khuếch đại PCR đoạn gen defensin mục tiêu từ DNA bộ gen ruồi lính đen.
3. Nội dung 3 (Content 3): Nhân bản (cloning) sản phẩm PCR vào plasmid vector pTAG2.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Trình tự hệ gen và mẫu DNA bộ gen tách chiết từ ruồi lính đen (Hermetia illucens); gen mã hóa defensin giả định (chr1_def4); plasmid tách dòng pTAG2 (kích thước vector dạng thẳng khoảng 3095 bp); tế bào chủ vi khuẩn Escherichia coli DH5α.
• Thời gian và địa điểm: Đề tài được thực hiện từ tháng 10/2023 đến tháng 03/2024 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử và Y sinh (LA1.702), Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc tế – Đại học Quốc gia TP.HCM và Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và tổng quan tài liệu

Khóa luận tổng quan các kiến thức nền tảng về cấu trúc, cơ chế tác động và các chiến lược sản xuất AMPs:

• Cơ chế tác động của AMPs: AMPs là các chuỗi peptide ngắn, đa số mang điện tích dương (cationic) và có tính lưỡng cực (amphipathic). Cơ chế chính là phá hủy màng tế bào vi khuẩn thông qua các mô hình: mô hình thùng gỗ (barrel-stave), mô hình lỗ xuyến (toroidal-pore), mô hình thảm (carpet model) và mô hình tập hợp (aggregate model). Ngoài ra, AMPs còn có các cơ chế phi màng như ức chế tổng hợp DNA, RNA, protein hoặc ức chế tổng hợp thành tế bào thông qua việc liên kết với Lipid II.
• Defensin côn trùng: Nhóm peptide bảo thủ chứa 6 gốc cysteine hình thành 3 cầu nối disulfide nội phân tử, tạo nên nếp gấp cấu trúc không gian CSαβ (cysteine-stabilized α-helix/β-sheet motif).
• Phương pháp thu nhận AMPs: Tổng quan các hướng tiếp cận bao gồm chiết xuất tự nhiên, tổng hợp hóa học pha rắn (SPPS), biểu hiện protein không tế bào (CFPS), thiết kế peptide de novo và công nghệ DNA tái tổ hợp (sử dụng các hệ thống biểu hiện vi khuẩn E. coli, nấm men Pichia pastoris, tế bào côn trùng Sf9 kết hợp vector dung hợp scaffold protein như GFP).

Phương pháp nghiên cứu thực tế

Nghiên cứu áp dụng quy trình tích hợp giữa phân tích tính toán in silico và thực nghiệm sinh học phân tử:

[Dữ liệu hệ gen BSF] 
[Dự đoán In Silico (CAMP, APD3, ExPASy, I-TASSER)] 
[Lựa chọn ứng viên chr1_def4] 
[Thiết kế mồi & Tách chiết DNA mẫu ruồi] 
[Khuếch đại Gradient PCR & Tinh sạch amplicons] 
[Nối TA Ligation vào vector pTAG2 & Kiểm tra PCR M13] 
[Biến nạp sốc nhiệt vào E. coli DH5α & Giải trình tự Sanger]

• Phân tích in silico:
  • Đánh giá khả năng kháng khuẩn của 31 trình tự defensin giả định (thu nhận từ dữ liệu hệ gen và phiên mã của Võ Duy Sơn, phân bố trên các nhiễm sắc thể 1, 5, 6) bằng cơ sở dữ liệu CAMP với 3 mô hình học máy: Support Vector Machine (SVM), Random Forest (RF) và Artificial Neural Network (ANN) theo ngưỡng chuẩn 0.5.
  • Phân tích tính chất lý hóa bằng công cụ APD3 (Antimicrobial Peptide Database) Calculator & Predictor và ExPASy ProtParam/pI-Mw (điện tích ròng, tỷ lệ kỵ nước, điểm đẳng điện pI, chỉ số Boman).
  • Mô hình hóa cấu trúc 3D của ứng viên tiềm năng bằng máy chủ trực tuyến I-TASSER.
  • Gióng hàng chuỗi bằng thuật toán Decipher và hiển thị trên phần mềm UGENE.
• Thực nghiệm sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA: Sử dụng phương pháp kết tủa muối (salting out) từ mẫu chân ruồi lính đen trưởng thành với đệm ly giải chứa EDTA 0.01 M, SDS 1%, ủ Proteinase K (0.1 mg/mL), chiết tách bằng chloroform và kết tủa bằng isopropanol cùng CH3COONa 3 M (pH 8.0).
  • Kiểm tra chất lượng DNA: Điện di trên gel agarose 1% (chạy trong đệm TAE 0.5X, 100V trong 30 phút, nhuộm GelRed) và đo quang phổ UV-Vis bằng máy NanoDrop One.
  • Thiết kế mồi và PCR: Thiết kế cặp mồi BSF-mDef4, kiểm tra tính đặc hiệu bằng NCBI Primer-BLAST. Thực hiện phản ứng Gradient PCR trên máy Eppendorf Vapo.protect Mastercycler với thang nhiệt độ bắt cặp từ 50°C đến 60°C (các mốc 53°C, 56°C, 59°C).
  • Tinh sạch sản phẩm PCR: Kết tủa DNA bằng isopropanol và natri axetat 3 M (pH 5.2), rửa bằng ethanol 80%.
  • Phản ứng nối (TA Cloning): Nối đoạn PCR chèn (126 bp) vào vector pTAG2 dạng thẳng (~3095 bp) bằng enzyme T4 DNA ligase và đệm 2X Rapid Ligation Buffer (Promega) với tỷ lệ phân tử chèn:vector là 10:1, ủ ở 16°C trong 16 giờ.
  • Kiểm tra phản ứng nối: Chạy PCR kiểm tra sản phẩm nối bằng cặp mồi phổ quát M13 (M13-F: 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ và M13-R: 5’-CGGATAACAATTTCACACAG-3’).
  • Biến nạp di truyền: Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp hóa học CaCl2 (0.1 M); biến nạp sản phẩm nối bằng phương pháp sốc nhiệt (42°C trong 45 giây), nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng và trải đĩa chọn lọc LB thạch chứa Ampicillin (100 µg/mL).
  • Giải trình tự: Phân tích kết quả giải trình tự Sanger và đối chiếu bằng phần mềm CLC Main Workbench.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chapter 1. Introduction (Mở đầu)

Chương này nêu bật thực trạng gia tăng đề kháng kháng sinh và tính cấp thiết của việc tìm kiếm các phân tử kháng khuẩn mới. Tác giả giới thiệu tiềm năng miễn dịch học của ruồi lính đen (Hermetia illucens), xác định khoảng trống nghiên cứu về hệ thống defensin của loài này và xác lập mục tiêu, phạm vi cùng 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm của đề tài.

Chapter 2. Literature Review (Tổng quan tài liệu)

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết toàn diện:

• Phân tích cấu trúc, phân loại và các mô hình cơ chế tác động diệt khuẩn của AMPs tại màng tế bào và nội bào.
• Tổng quan về defensin côn trùng, cơ chế điều hòa biểu hiện thông qua các con đường truyền tín hiệu Toll và Imd.
• Đặc điểm sinh học, vai trò sinh thái và tiềm năng ứng dụng của ruồi lính đen trong xử lý chất thải sinh học.
• Khảo cứu các thuật toán và công cụ in silico nhận diện AMPs (ADAM, AMPA, iAMP-2L, AntiBP2, CAMP).
• Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp sản xuất AMPs: chiết xuất tự nhiên, tổng hợp hóa học, tổng hợp không tế bào (CFPS) và công nghệ DNA tái tổ hợp.

Chapter 3. Materials and Methods (Vật liệu và Phương pháp)

Chương 3 trình bày chi tiết danh mục thiết bị, hóa chất, chủng vi khuẩn (E. coli DH5α), plasmid pTAG2 và toàn bộ quy trình thực nghiệm:

• Phương pháp sàng lọc in silico 31 defensin ứng viên từ bộ dữ liệu của Võ Duy Sơn.
• Quy trình tách chiết DNA bộ gen ruồi lính đen bằng phương pháp salting-out.
• Thiết kế mồi BSF-mDef4 và quy trình tối ưu nhiệt độ Gradient PCR.
• Phương pháp tinh sạch amplicons bằng kết tủa isopropanol.
• Phản ứng nối TA cloning vào pTAG2, quy trình chuẩn bị tế bào khả biến CaCl2, biến nạp sốc nhiệt và kiểm tra bằng PCR mồi M13.

Chapter 4. Results and Discussion (Kết quả và Thảo luận)

Chương 4 phân tích chi tiết các kết quả đạt được qua từng bước thực nghiệm:

Hạng mục thực nghiệm	Kết quả chính	Thông số / Giá trị cụ thể
Dự đoán In Silico (CAMP)	31/31 trình tự defensin vượt ngưỡng	Điểm SVM, RF, ANN đều > 0.5
Tính chất lý hóa (chr1_def4)	Ứng viên tối ưu nhất	Điện tích ròng: +7; pI = 9.69; Kỵ nước: cao; Boman index: 1.44 kcal/mol
Cấu trúc không gian 3D	Nếp gấp CSαβ đặc trưng	Chuỗi xoắn α, phiến gấp β song song ngược và 2 cặp cầu disulfide
Tách chiết DNA mẫu ruồi	Mẫu 3 đạt chất lượng cao nhất	Nồng độ: 82.4 ng/µL; A260/A280 = 2.204; A260/A230 = 3.184
Tối ưu Gradient PCR	Khuếch đại đặc hiệu băng 126 bp	Nhiệt độ bắt cặp tối ưu: 53°C (thử nghiệm 53°C, 56°C, 59°C)
Tinh sạch sản phẩm PCR	Thu nhận đoạn chèn sạch	Nồng độ: 33.x ng/µL; A260/A280 = 1.89; A260/A230 = 0.41
Phản ứng nối TA Cloning	Nối thành công vào vector pTAG2	PCR M13 xuất hiện băng tái tổ hợp ~406 bp và băng tự nối ~280 bp
Giải trình tự Sanger	Trình tự khuếch đại chính xác 100%	Khớp hoàn toàn với trình tự thiết kế in silico của chr1_def4
Biến nạp vào E. coli DH5α	Đĩa mẫu chưa mọc khuẩn lạc	Đĩa đối chứng dương mọc tốt; đối chứng âm không mọc

Tác giả thảo luận sâu về nguyên nhân chưa thu được khuẩn lạc biến nạp: sự hiện diện của muối dư sau tinh sạch (tỷ số A260/A230 thấp = 0.41) gây ức chế phản ứng chuyển gen, hiệu suất của tế bào khả biến hóa học CaCl2 và khả năng độc tính nội tại của chuỗi peptide kháng khuẩn đối với vi khuẩn chủ E. coli.

Chapter 5. Conclusion and Future Perspectives (Kết luận và Triển vọng)

Tổng kết việc hoàn thành nhận diện in silico, tối ưu PCR khuếch đại đoạn gen 126 bp và thực hiện thành công phản ứng nối ligase tạo plasmid tái tổ hợp. Đồng thời, chương này đề xuất các giải pháp tối ưu hóa quy trình tinh sạch và hướng chuyển đổi hệ thống biểu hiện phù hợp trong các nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

1. Sàng lọc và phân tích in silico:
   • Xác định toàn bộ 31 gen defensin giả định trên các nhiễm sắc thể 1, 5 và 6 của Hermetia illucens đều có tiềm năng kháng khuẩn theo các thuật toán học máy SVM, RF và ANN trên cơ sở dữ liệu CAMP.
   • Chọn lọc thành công peptide chr1_def4 (thuộc vùng peptide trưởng thành) làm ứng viên sáng giá nhất nhờ sở hữu điện tích dương ròng cao nhất (+7), điểm đẳng điện lý thuyết cao (pI = 9.69), tỷ lệ kỵ nước cao và chỉ số Boman đạt 1.44 kcal/mol. Mô hình 3D từ I-TASSER khẳng định cấu trúc nếp gấp CSαβ bền vững với 2 cặp cầu nối disulfide.
2. Khuếch đại thực nghiệm đoạn gen đích:
   • Tách chiết thành công DNA bộ gen từ chân ruồi lính đen với nồng độ 82.4 ng/µL, độ tinh sạch cao (A260/A280 = 2.204, A260/A230 = 3.184 ở mẫu 3).
   • Thiết kế cặp mồi đặc hiệu BSF-mDef4 (Forward: 5’-CGACTTACCTGTAATATTTTGGAC-3’, Reverse: 5’-CTACCCCCTACAGACGCAAATTTTTCG-3’) và xác định được nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho phản ứng PCR là 53°C, tạo ra sản phẩm khuếch đại duy nhất có kích thước đúng 126 bp.
   • Tinh sạch đoạn amplicons đạt độ sạch A260/A280 = 1.89. Kết quả giải trình tự Sanger đối chiếu trên CLC Main Workbench xác nhận trình tự đoạn khuếch đại hoàn toàn trùng khớp với trình tự dự đoán của chr1_def4.
3. Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp:
   • Hoàn thành phản ứng TA cloning chèn phân đoạn 126 bp vào vector pTAG2 dạng thẳng (~3095 bp) bằng T4 DNA ligase (tỷ lệ phân tử 10:1).
   • Kiểm tra sản phẩm nối bằng PCR với cặp mồi phổ quát M13 ghi nhận sự xuất hiện của phân đoạn kích thước ~406 bp, chứng minh đoạn gen mã hóa defensin chr1_def4 đã được gắn thành công vào vector plasmid pTAG2.

Đóng góp của đề tài

• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm và bằng chứng phân tử đầu tiên về việc nhân bản đoạn gen mã hóa defensin chr1_def4 từ hệ gen ruồi lính đen vào vector pTAG2.
• Chứng minh tính khả thi và hiệu quả của quy trình kết hợp công cụ học máy, tin sinh học với các kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản trong việc sàng lọc và phân lập gen mã hóa peptide kháng khuẩn từ nguồn gen sinh vật bản địa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Hiệu suất biến nạp di truyền: Quá trình biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt chưa thu được khuẩn lạc tái tổ hợp trên đĩa thạch chọn lọc chứa ampicillin (100 µg/mL).
• Yếu tố tồn dư muối: Phương pháp tinh sạch amplicons bằng kết tủa isopropanol cho tỷ số A260/A230 đạt 0.41, cho thấy còn tồn dư muối từ đệm natri axetat và đệm PCR, có thể đã gây ức chế phản ứng nối hoặc cản trở quá trình nhận DNA của tế bào khả biến.
• Phạm vi thực nghiệm: Do hạn chế về mặt thời gian và điều kiện phòng thí nghiệm, đề tài chưa thể triển khai các khảo sát sâu hơn về độc tính tế bào của AMP đối với E. coli hoặc thử nghiệm các hệ vector biểu hiện khác.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Cải tiến quy trình tinh sạch DNA (như áp dụng cột thu hồi silica chuyên dụng) để loại bỏ triệt để muối và tạp chất ức chế.
• Tối ưu hóa phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến hoặc áp dụng kỹ thuật biến nạp điện (electroporation) nhằm nâng cao hiệu suất chuyển gen.
• Khảo sát các hệ thống biểu hiện dung hợp (sử dụng protein mang/scaffold như GFP) nhằm giảm thiểu độc tính của peptide đối với tế bào chủ vi khuẩn, hoặc chuyển giao sang các hệ thống biểu hiện nhân thực như nấm men Pichia pastoris hoặc tế bào côn trùng.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Di truyền học, Y dược và Tin sinh học (Bioinformatics).
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chi tiết sàng lọc peptide kháng khuẩn in silico kết hợp nhiều mô hình học máy (SVM, RF, ANN trên CAMP; APD3; I-TASSER).
  • Phương pháp thiết kế mồi, tối ưu Gradient PCR và kỹ thuật TA cloning trên vector pTAG2.
  • Các phân tích thực tế về nguyên nhân lỗi, ảnh hưởng của tỷ số độ sạch quang phổ (A260/A230) và các thách thức khi thao tác với gen mã hóa peptide kháng khuẩn có độc tính đối với vi khuẩn chủ.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao ứng viên chr1_def4 lại được lựa chọn trong số 31 gen defensin dự đoán từ hệ gen ruồi lính đen?

Trong số 31 trình tự defensin giả định phân tích trên cơ sở dữ liệu CAMP (tất cả đều vượt ngưỡng điểm 0.5), chr1_def4 thể hiện các chỉ số lý hóa nổi bật nhất khi dự đoán qua APD3: sở hữu điện tích dương ròng cao nhất (+7), điểm đẳng điện lý thuyết cao (pI = 9.69), tỷ lệ axit amin kỵ nước cao và chỉ số Boman đạt 1.44 kcal/mol. Các đặc tính này tối ưu cho cơ chế gắn kết tĩnh điện và xâm nhập màng tế bào vi khuẩn.

2. Cặp mồi BSF-mDef4 được thiết kế có trình tự như thế nào và điều kiện PCR tối ưu là gì?

Cặp mồi BSF-mDef4 được thiết kế để khuếch đại đoạn gen 126 bp mã hóa peptide trưởng thành:

• Mồi xuôi (BSF-mDef4-F): 5’-CGACTTACCTGTAATATTTTGGAC-3’ (Tm = 55.63°C).
• Mồi ngược (BSF-mDef4-R): 5’-CTACCCCCTACAGACGCAAATTTTTCG-3’ (Tm = 64.25°C). Qua thử nghiệm Gradient PCR (50–60°C), nhiệt độ bắt cặp tối ưu được xác định là 53°C, cho băng sản phẩm rõ nét duy nhất tại kích thước 126 bp.

3. Phản ứng nối gen vào plasmid pTAG2 được kiểm tra bằng phương pháp nào và kích thước sản phẩm mong đợi là bao nhiêu?

Phản ứng nối được kiểm tra trực tiếp bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi phổ quát M13 (M13-F và M13-R). Khi đoạn gen 126 bp được chèn thành công vào vector pTAG2, kích thước sản phẩm PCR M13 mong đợi là khoảng 406 bp (gồm đoạn chèn 126 bp cộng với đoạn vector khoảng 280 bp). Trường hợp vector tự nối (không có đoạn chèn), sản phẩm PCR sẽ có kích thước khoảng 280 bp.

4. Những nguyên nhân chính nào được tác giả thảo luận dẫn đến việc chưa thu được khuẩn lạc sau khi biến nạp vào E. coli DH5α?

Tác giả đã chỉ ra 3 nguyên nhân tiềm ẩn:

1. Độ tinh sạch của mẫu DNA sau tinh sạch có tỷ số A260/A230 thấp (0.41), phản ánh sự tồn dư của muối natri axetat hoặc muối trong đệm PCR gây ức chế phản ứng biến nạp.
2. Hiệu suất của tế bào khả biến điều chế bằng phương pháp CaCl2 chưa đủ cao.
3. Độc tính tự nhiên của peptide kháng khuẩn (AMPs) đối với tế bào vi khuẩn chủ E. coli, làm ức chế sự sinh trưởng hoặc gây chết tế bào mang plasmid tái tổ hợp.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Đinh Xuân Hoàng đã hoàn thành mục tiêu nhận diện in silico hệ gen defensin của ruồi lính đen (Hermetia illucens) và lựa chọn thành công ứng viên tiềm năng chr1_def4 với các đặc tính lý hóa tối ưu. Nghiên cứu đã khuếch đại thành công đoạn gen 126 bp mã hóa peptide trưởng thành, xác nhận trình tự chính xác bằng giải trình tự Sanger và hoàn thành phản ứng nối TA cloning vào plasmid vector pTAG2 (kiểm chứng bằng băng PCR M13 đạt 406 bp). Dù quá trình biến nạp vào E. coli DH5α còn gặp trở ngại do yếu tố tồn dư muối và đặc tính độc sinh học của AMPs, kết quả đạt được đã đặt nền tảng thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu biểu hiện và ứng dụng peptide kháng khuẩn từ ruồi lính đen trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IN SILICO IDENTIFICATION AND CLONING OF A DEFENSIN GENE FROM THE GENOME OF THE BLACK SOLDIER FLY (HERMETIA ILLUCENS) INTO PLASMID pTAG2 Major : BIOTECHNOLOGY Student : DINH XUAN HOANG Student ID : 19126053 Academic year : 2019-2023 Thu Duc City, 03/2024 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATE THESIS IN SILICO IDENTIFICATION AND CLONING OF A DEFENSIN GENE FROM THE GENOME OF THE BLACK SOLDIER FLY (HERMETIA ILLUCENS) INTO PLASMID pTAG2 Advisor Student LE MINH THONG, Ph. DINH XUAN HOANG Thu Duc City, 03/2024 ACKNOWLEDGEMENT I wish to extend my deepest gratitude and appreciation to the individuals and organizations whose unwavering support and contributions have been invaluable throughout my journey in completing this graduate thesis. First and foremost, I am profoundly thankful to my thesis advisor, Dr. Lê Minh Thông, for his consistent guidance, patience, encouragement, and expertise.

His dedication and mentorship have been instrumental in shaping the direction of this research. Iam sincerely grateful to Dr. Cao Thi Thanh Loan for her companionship and assistance throughout the completion of this thesis. My heartfelt thanks are extended to my family for their boundless love, support, and belief in my abilities.

Their encouragement sustained me during the challenging phases of this journey. I would also like to express my gratitude to the participants of this study, namely Mr. Lê Phi Hung, Mr. Lê Tran Minh Nhân, Mr.

Trần Hoàng Dai Phúc, Mr. Nguyễn Thanh Liêm, Mr. Vĩnh Thịnh, and my laboratory teammates, for their willingness to share insights and provide support. Their contributions are deeply appreciated.

Acknowledgment is due to the LA1.702: Biomedicine and Molecular Biotechnology Laboratory at International University - Vietnam National University and Nong Lam University for providing the necessary resources, facilities, and opportunities that enabled me to undertake this research. I am particularly grateful to the administrators of the Faculty of Biological Sciences and all the lecturers for their unwavering support and resources throughout my studies. Special thanks to Dr. Lê Dinh Đôn, the academic mentor of class DH19SM, for his care and guidance over the five years of my university journey.

This thesis would not have been possible without the collective efforts and support of all those mentioned above. Thank you for being an integral part of this important milestone in my academic career. AFFIRMATION AND COMMITMENT My name is Dinh Xuan Hoang, student ID: 19126053, class: DH19SM (Phone: [phone], email: [e-mail] ), Faculty of Biological Sciences, Nong Lam university Ho Chi Minh City. I declared that all results presented in this graduate thesis were conducted by myself.

All the data and information are entirely accurate and unbiased. I fully accept responsibility for these commitments in front of the committee. Thu Due City, February 28", 2024 Student’s signature Dinh Xuan Hoang 1 ABSTRACT The study was conducted to explore the capabilities of in silico techniques and gene cloning methods in identifying and cloning genes encoding antimicrobial peptides from the black soldier fly (Hermetia illucens) into the pTAG2 plasmid vector. To demonstrate the efficacy of this approach, PCR and cloning experiments were performed to identify specific peptide-encoding genes from the genome of Hermetia illucens.

Analysis of the results using various machine learning algorithms available on the CAMP database revealed that all 31 putative defensin genes exhibited antimicrobial activity. Notably, putative defensin chrl def4 showed particularly promising physicochemical properties, with high values for net charge, hydrophobicity, and pI with the Antimicrobial Peptide Database Calculator and Predictor. The successful identification and ligation of the gene encoding chr1_def4 into the pTAG2 vector were achieved through PCR and cloning experiments. The results demonstrate success in identifying and cloning antimicrobial peptide genes from Hermetia illucens.

This development opens the door to further research and potential applications of antimicrobial peptides from this fly species in the medical and environmental industries. Keywords: In silico techniques, gene cloning, antimicrobial peptides, black soldier fly (Hermetia illucens), defensin genes.