Đặt vấn đề Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Ranadive, 1994). Mức độ tiêu thụ hàng năm trên thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn (Lomascolo, Stentelaire, Asther, & Lesage- Meessen, 1999). Vanillin còn thể hiện các đặc tính chống khuẩn và chống oxy hóa vanillin (Sinha, Sharma, & Sharma, 2008), đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư (Sinha et al. Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugenol, lignin…Trong đó, vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại là tổng hợp hóa học.
Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogam (S. Yoon et al. Tuy nhiên, vanilin nhân tạo không được đánh giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường (Muheim & Lerch, 1999). Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn cơ chất như acid ferulic, eugenol, isogenol, lignin,… Trong các nguồn cơ chất trên, acid ferulic được nghiên nhiều về các con đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên.
Acid ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp. Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy acid ferulic để tạo ra vanillin như Amycolatopsis sp. strain HR167 (Achterholt, Priefert, & Steinbuchel, 2000), Delftia acidovorans (R. Plaggenborg, Steinbuchel, & Priefert, 2001), Pseudomonas putida (R.
Plaggenborg, Overhage, Steinbüchel, & Priefert, 2003), Streptomyces setonii (Sutherland, Crawford, & Pometto, 1983), Pseudomonas 2 fluorescens (Narbad & Gasson, 1998),… Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng độ vanillin tạo ra. Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử. Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gen sinh tổng hợp cũng như không có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. coli được xem là một ứng cử viên tiềm năng cho sản xuất vanillin bằng các hệ thống vector biểu hiện chứa các gen liên quan tới con đường chuyển hóa sinh học từ acid ferulic đến vanillin (fcs, ech) và gen tham gia vào sự tăng cường tổng hợp vanillin (gltA).
Ở Việt Nam, sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp còn là một vấn đề mới, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở tổng hợp hoá học. Xuất phát từ thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “ Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin trong E. coli”, sử dụng gen fcs và ech được tách dòng từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam và gen gltA từ E. Mục tiêu đề tài - Tách dòng và giải trình tự 2 gen ech và fcs từ chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam.
- Thiết kế vector biểu hiện 3 gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp vanilin. Yêu cầu đề tài - Tách dòng và giải trình tự được gen fcs, ech từ chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 - Gắn được 3 gen fcs, ech, gltA vào vector biểu hiện pET22b(+) 1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Tách dòng và tạo ra vector biểu hiện các gen tạo tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện vanillin trong E.
coli sau này. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm cuả nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới cho sản xuất vanillin tự nhiên. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu về vanillin 2.
Nguồn gốc Vanila là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia. Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học khác nhau được tách chiết từ vỏ quả vanillin chiếm thành phần chủ yếu (Daphna Havkin-Frenkel & Belanger, 2007). Lịch sử về nguồn gốc vanilin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930. Người Aztecs (Mexico) được coi là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ.
Sau đó, người Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu song mọi cố gắng để có thể trồng được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên. Cho đến khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanila (Sinha et al. Ngày nay, vanila được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia, Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…(Daphna Havkin-Frenkel & Belanger, 2007).1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới 4 2. Cấu trúc, đặc điểm lí hóa Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu.
Về mặt hóa học vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol (Converti, Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010).2: Công thức cấu tạo Hình 2.3: Vanillin dạng bột (Converti, Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010) Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau: Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin (Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012) Đặc tính Dữ liệu Trọng lượng phân tử 152.15 Nhiệt độ nóng chảy 80-810C Nhiệt độ sôi 2850C Độ hòa tan 1g/100ml Tỉ trọng hơi (không khí=1) 5.2 x 10-3 mmHg ở 250C Hằng số phân li pKa1= 7. Đặc tính sinh học 5 Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,…(Sinha et al. Hoạt tính kháng vi sinh vật Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm (Fitzgerald, Stratford, Gasson, & Narbad, 2005). Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả (López-Malo, Alzamora, & Argaiz, 1995) và trong bảo quản xoài chế biến tươi (Ngarmsak et al., 2006) và chống lại một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans, Cryptococcus neoformans (Boonchird & Flegel, 1982).
Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại Escherichia coli, Lactobacillus p lantarum, Listeria innocua. Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên. Hoạt tính kháng oxy hóa Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính phân hủy các gốc tự do. Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl4) tác nhân gây oxy hóa ở chuột (Makni, Chtourou, Barkallah, & Fetoui, 2012), bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột (Kamat, Ghosh, & Devasagayam, 2000).
Sự có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo. Hoạt tính chống ung thư và đột biến Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến. Vanillin ức chế đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogen peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin C (Gustafson et al. Vanillin ức chế con đường Non-homologous DNA end- joining (NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép DNA bởi ức chế hoạt tính của DNA-PK (DNA protein kinase) (Durant & Karran, 2003), làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột (Akagi et al.
Hoạt tính hạ lipid trong máu Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu mỡ trong máu. Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì. Trước đó đã có nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương, triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng chuột (Srinivasan & Chandrasekhara, 1992). Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng chống tạo hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào hồng cầu (Abraham et al.
Tuy nhiên vanillin được hấp thụ theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa. Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp. Lợi ích sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần so với vanillin tự nhiên (C. Zhang et al.
Các hoạt tính khác Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi (Tawatsin, Wratten, Scott, Thavara, & Techadamrongsin, 2001). Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm (Sinha et al. 7 Trong công nghiệp thực phẩm, vanilla là một phụ gia rất thông dụng, đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream). Ngoài sử dụng trong sản xuất kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống.
Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,….2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm Nguồn: CAS N°: 121-33-5 Mức độ sử dụng (ppm) Sản phẩm Bình thường Tối đa Đồ nướng 74.0 Chất béo, tinh dầu 96.0 Nước sốt ngọt 358.4 Các sản phẩm sữa 221.0 Đồ uống loại II 26.2 Bơ sữa đông lạnh 1.7 Các sản phẩm sữa 247.