Thiết kế vector biểu hiện gene enzyme sinh tổng hợp β-carotene trong E. coli

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1. Mục đích nghiên cứu

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

1.3. Ý nghĩa của đề tài

1.3.1. Ý nghĩa khoa học

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Khái quát về sắc tố β-carotene

2.1.1. Cấu trúc và tính chất lý hóa

2.1.2. Vai trò của sắc tố β-carotene với con người

2.1.2.1. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người

2.1.2.2. Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp

2.1.3. Con đường tổng hợp β-carotene

2.1.4. Nguồn cung cấp β-carotene

2.1.4.1. Nguồn cung từ thực vật

2.1.4.2. Nguồn cung từ vi sinh vật

2.1.4.3. Nguồn cung từ tổng hợp hóa học

2.1.5. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene

2.1.5.1. Đặc điểm của vi khuẩn E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

2.1.5.2. Một số hệ thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E. coli

2.1.5.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.5.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

2.1.5.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu nghiên cứu

3.2. Phạm vi nghiên cứu

3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.4. Nội dung nghiên cứu

3.5. Phương pháp nghiên cứu

3.5.1. Phương pháp thiết kế in silico

3.5.2. Phương pháp lập bản đồ giới hạn

3.5.3. Phương pháp điện di DNA trong gel agarose

3.5.4. Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose

3.5.5. Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện

3.5.6. Phương pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả biến

3.5.7. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt

3.5.8. Phương pháp tách chiết DNA plasmid

4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY

4.2. Kết quả gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY

4.3. Kết quả gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY

4.4. Thiết kế vector biểu hiện mang policistron gồm 5 gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY trên nền tảng vector biểu hiện pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY

4.5. Kết quả gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y

4.6. Kết quả gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY

4.7. Kết quả kiểm tra sự hoạt động của các gene

5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Thiết kế vector biểu hiện gene

Thiết kế vector là bước quan trọng trong việc biểu hiện gene enzyme sinh tổng hợp β-carotene trong E. coli. Vector được thiết kế để chứa các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene, bao gồm idi, crtE, crtI, crtB, và crtY. Các vector này được xây dựng trên nền tảng pRSET-A và pET22b(+), hai hệ thống vector phổ biến trong công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector cần đảm bảo các yếu tố như promoter mạnh, vị trí gắn gene, và khả năng biểu hiện cao trong tế bào vi khuẩn.

1.1. Lựa chọn hệ vector

Hệ vector pRSET-A và pET22b(+) được lựa chọn do khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp cao. pRSET-A có promoter T7, phù hợp cho biểu hiện gene trong E. coli BL21(DE3). pET22b(+) có thêm trình tự tín hiệu tiết, giúp protein được tiết ra ngoài tế bào, thuận lợi cho quá trình thu hồi.

1.2. Thiết kế polycistron

Các gene idi, crtE, crtI, crtB, và crtY được thiết kế thành một polycistron để đảm bảo sự đồng biểu hiện của các enzyme. Polycistron này được chèn vào vector, tạo thành vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY.

II. Biểu hiện gene trong E

Biểu hiện gene trong E. coli là quá trình chuyển đổi thông tin di truyền thành protein tái tổ hợp. E. coli được sử dụng làm hệ thống biểu hiện do khả năng sinh trưởng nhanh, dễ biến nạp, và chi phí thấp. Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện gene bao gồm promoter, số bản sao vector, và điều kiện nuôi cấy.

2.1. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện

Để tối ưu hóa biểu hiện gene, các điều kiện như nhiệt độ, thời gian cảm ứng, và nồng độ IPTG được điều chỉnh. Nhiệt độ thấp (25-30°C) thường được sử dụng để tránh sự hình thành thể vùi và tăng khả năng hòa tan của protein.

2.2. Kiểm tra biểu hiện gene

Sự biểu hiện của các gene được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot. Kết quả cho thấy các enzyme được biểu hiện thành công trong E. coli, đặc biệt là crtB và crtY, hai enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp β-carotene.

III. Ứng dụng của β carotene

β-carotene có nhiều ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, và mỹ phẩm. Nó là tiền chất của vitamin A, có vai trò quan trọng trong thị giác và hệ miễn dịch. Ngoài ra, β-carotene còn có khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh tim mạch và ung thư.

3.1. Ứng dụng trong thực phẩm

β-carotene được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên trong thực phẩm, thay thế các chất tạo màu tổng hợp. Nó cũng được bổ sung vào các sản phẩm dinh dưỡng để tăng cường vitamin A.

3.2. Ứng dụng trong dược phẩm

Trong dược phẩm, β-carotene được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến thiếu vitamin A, như quáng gà và khô mắt. Nó cũng được nghiên cứu để ngăn ngừa các bệnh ung thư và tim mạch.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp β-carotene trong E. coli. Kết quả mở ra hướng nghiên cứu mới trong sản xuất β-carotene tái tổ hợp, đáp ứng nhu cầu thực tiễn. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình biểu hiện và sản xuất β-carotene ở quy mô công nghiệp.

Luận Văn Thạc Sĩ: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Các Gene Enzyme Xúc Tác Sinh Tổng Hợp β-Carotene Trong Vi Khuẩn Escherichia Coli