I. Thiết kế vector biểu hiện gene
Thiết kế vector là bước quan trọng trong việc biểu hiện gene enzyme sinh tổng hợp β-carotene trong E. coli. Vector được thiết kế để chứa các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene, bao gồm idi, crtE, crtI, crtB, và crtY. Các vector này được xây dựng trên nền tảng pRSET-A và pET22b(+), hai hệ thống vector phổ biến trong công nghệ sinh học. Việc thiết kế vector cần đảm bảo các yếu tố như promoter mạnh, vị trí gắn gene, và khả năng biểu hiện cao trong tế bào vi khuẩn.
1.1. Lựa chọn hệ vector
Hệ vector pRSET-A và pET22b(+) được lựa chọn do khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp cao. pRSET-A có promoter T7, phù hợp cho biểu hiện gene trong E. coli BL21(DE3). pET22b(+) có thêm trình tự tín hiệu tiết, giúp protein được tiết ra ngoài tế bào, thuận lợi cho quá trình thu hồi.
1.2. Thiết kế polycistron
Các gene idi, crtE, crtI, crtB, và crtY được thiết kế thành một polycistron để đảm bảo sự đồng biểu hiện của các enzyme. Polycistron này được chèn vào vector, tạo thành vector tái tổ hợp pR-iEIBY và pET22-iEIBY.
II. Biểu hiện gene trong E
Biểu hiện gene trong E. coli là quá trình chuyển đổi thông tin di truyền thành protein tái tổ hợp. E. coli được sử dụng làm hệ thống biểu hiện do khả năng sinh trưởng nhanh, dễ biến nạp, và chi phí thấp. Các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện gene bao gồm promoter, số bản sao vector, và điều kiện nuôi cấy.
2.1. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện
Để tối ưu hóa biểu hiện gene, các điều kiện như nhiệt độ, thời gian cảm ứng, và nồng độ IPTG được điều chỉnh. Nhiệt độ thấp (25-30°C) thường được sử dụng để tránh sự hình thành thể vùi và tăng khả năng hòa tan của protein.
2.2. Kiểm tra biểu hiện gene
Sự biểu hiện của các gene được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và Western blot. Kết quả cho thấy các enzyme được biểu hiện thành công trong E. coli, đặc biệt là crtB và crtY, hai enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp β-carotene.
III. Ứng dụng của β carotene
β-carotene có nhiều ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, và mỹ phẩm. Nó là tiền chất của vitamin A, có vai trò quan trọng trong thị giác và hệ miễn dịch. Ngoài ra, β-carotene còn có khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh tim mạch và ung thư.
3.1. Ứng dụng trong thực phẩm
β-carotene được sử dụng làm chất tạo màu tự nhiên trong thực phẩm, thay thế các chất tạo màu tổng hợp. Nó cũng được bổ sung vào các sản phẩm dinh dưỡng để tăng cường vitamin A.
3.2. Ứng dụng trong dược phẩm
Trong dược phẩm, β-carotene được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến thiếu vitamin A, như quáng gà và khô mắt. Nó cũng được nghiên cứu để ngăn ngừa các bệnh ung thư và tim mạch.
IV. Kết luận và kiến nghị
Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp β-carotene trong E. coli. Kết quả mở ra hướng nghiên cứu mới trong sản xuất β-carotene tái tổ hợp, đáp ứng nhu cầu thực tiễn. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình biểu hiện và sản xuất β-carotene ở quy mô công nghiệp.
