Luận Văn Thạc Sĩ: Nghiên Cứu Lên Men Tổng Hợp Kháng Sinh Nhờ Streptomyces 166 28

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu quá trình lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166 28, ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học.

• Tác giả: Soutthida Vongsavath
• Người hướng dẫn: PGS - TS. Cao Văn Thu
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên Cứu Lên Men Tổng Hợp Kháng Sinh Từ Streptomyces 166.28
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về kháng sinh
• 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh
• 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh
• 1.1.3. Phân loại kháng sinh
• 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
• 1.1.5. Các ứng dụng của kháng sinh
• 1.2. Đại cương về xạ khuẩn
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
• 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces
• 1.2.3. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh
• 1.2.4. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn
• 1.2.4.1. Chọn lọc ngẫu nhiên
• 1.2.4.2. Đột biến cải tạo giống
• 1.2.4.3. Bảo quản giống
• 1.2.5. Lên men tổng hợp kháng sinh
• 1.2.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
• 1.2.6.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh
• 1.2.6.2. Các phương pháp chiết tách
• 1.2.7. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh
• 1.2.7.1. Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS)
• 1.2.7.2. Quang phổ hồng ngoại (IR)
• 1.2.8. Một số nghiên cứu liên quan
• 1.2.8.1. Phát hiện nguồn kháng sinh tự nhiên phong phú nhờ nghiên cứu những chất hóa học sinh ra bởi Streptomyces sp. trên ong bắp cày
• 1.2.8.2. Tối ưu hóa môi trường lên men chủng Streptomyces Orientalis 4912 sinh vancomycin
• 2. CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 2.1.1. Chủng xạ khuẩn
• 2.1.2. Vi sinh vật kiểm định
• 2.1.3. Các môi trường
• 2.1.5. Một số dụng cụ, máy móc
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống
• 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh
• 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được
• 2.3. Phương pháp thực nghiệm
• 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn
• 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
• 2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên
• 2.3.4. Đột biến bằng ánh sáng UV
• 2.3.5. Phương pháp đột biến hóa học
• 2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh
• 2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ
• 2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng
• 2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay
• 2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột
• 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
• 3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
• 3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
• 3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
• 3.4. Kết quả đột biến hóa học
• 3.5. Kết quả chọn môi trường lên men
• 3.6. Kết quả lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh
• 3.7. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi
• 3.8. Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột
• 3.9. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• LỜI CẢM ƠN

Tóm tắt

I. Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh

Nghiên cứu lên men là quá trình chính trong việc tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 166.28. Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường thích hợp để tạo ra các sản phẩm trao đổi chất bậc hai, trong đó có kháng sinh. Lên men vi sinh được thực hiện trong điều kiện hiếu khí, với các phương pháp như lên men bề mặt và lên men chìm. Lên men chìm được ưu tiên do hiệu suất cao và khả năng kiểm soát tốt hơn. Quá trình này đòi hỏi sự tối ưu hóa các yếu tố như nhiệt độ, pH, và thành phần môi trường để đạt được hiệu quả tối đa.

1.1. Phương pháp lên men

Có hai phương pháp chính trong lên men vi sinh: lên men bề mặt và lên men chìm. Lên men bề mặt thực hiện trên bề mặt môi trường rắn hoặc bán rắn, trong khi lên men chìm diễn ra trong môi trường lỏng. Lên men chìm được ưa chuộng hơn do hiệu suất cao và khả năng cơ giới hóa. Các kiểu lên men chìm bao gồm lên men mẻ, lên men có bổ sung, lên men liên tục và lên men bán liên tục. Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu và sản xuất.

1.2. Tối ưu hóa môi trường lên men

Việc tối ưu hóa môi trường lên men là yếu tố quyết định hiệu suất tổng hợp kháng sinh. Các yếu tố như nhiệt độ, pH, và thành phần dinh dưỡng cần được điều chỉnh phù hợp với đặc điểm sinh lý của Streptomyces 166.28. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 25-30°C, và pH tối ưu là 6.8-7.5. Ngoài ra, việc bổ sung các chất dinh dưỡng như carbon và nitơ cũng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất lên men.

II. Tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces

Streptomyces là chi vi khuẩn quan trọng trong việc tổng hợp kháng sinh, chiếm khoảng 55% tổng số kháng sinh được biết đến. Streptomyces 166.28 được nghiên cứu để cải tạo giống nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp kháng sinh. Quá trình này bao gồm việc chọn lọc, đột biến và bảo quản giống. Các phương pháp đột biến như sử dụng tia UV và hóa chất được áp dụng để tạo ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao hơn. Sau đó, kháng sinh được chiết tách và tinh chế từ dịch lên men để thu được sản phẩm tinh khiết.

2.1. Cải tạo giống Streptomyces

Cải tạo giống là bước quan trọng để nâng cao hiệu suất tổng hợp kháng sinh. Các phương pháp như đột biến bằng tia UV và đột biến hóa học được sử dụng để tạo ra các chủng Streptomyces có hoạt tính kháng sinh cao hơn. Sau khi đột biến, các chủng được chọn lọc và đánh giá hoạt tính kháng sinh. Các chủng có hiệu suất cao được bảo quản để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

2.2. Chiết tách và tinh chế kháng sinh

Sau quá trình lên men, kháng sinh được chiết tách từ dịch lên men bằng các phương pháp như lọc, ly tâm và chiết bằng dung môi hữu cơ. Quá trình tinh chế bao gồm sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột để thu được kháng sinh tinh khiết. Các phương pháp này đảm bảo kháng sinh đạt tiêu chuẩn chất lượng cao, sẵn sàng cho các ứng dụng trong y học và công nghiệp.

III. Ứng dụng và giá trị thực tiễn

Nghiên cứu này có giá trị thực tiễn cao trong việc sản xuất kháng sinh, đặc biệt trong bối cảnh kháng kháng sinh đang gia tăng. Kháng sinh tổng hợp từ Streptomyces 166.28 có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, cũng như trong các lĩnh vực khác như chăn nuôi và nông nghiệp. Nghiên cứu cũng góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt là trong lĩnh vực lên men vi sinh và tổng hợp kháng sinh.

3.1. Ứng dụng trong y học

Kháng sinh tổng hợp từ Streptomyces 166.28 có tiềm năng lớn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là các bệnh kháng thuốc. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại kháng sinh mới, hiệu quả cao và ít độc tính.

3.2. Ứng dụng trong nông nghiệp và chăn nuôi

Kháng sinh cũng được sử dụng trong nông nghiệp để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra trên cây trồng. Trong chăn nuôi, kháng sinh được dùng để điều trị bệnh và kích thích tăng trưởng, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới , tỷ lệ bệnh nhiễm trùng trong cơ cấu bệnh còn rất cao , vì thế kháng sinh là rất quan trọng do kháng sinh là một trong những công cụ đắc lực của các bác sỹ , dược sỹ trong phòng và chữa bệnh, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm , ngoài ra kháng sinh còn được dùng trong chăn nuôi , trông trọt và công nghiệp thực phẩm. Tuy nhiên trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay , hầu hết các kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm , ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành. Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong các nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất thế giới của tổ chức y tế thế giới ( WHO ). Do đó, đẩy mạnh nghiên cứu , sản xuất các kháng sinh có hiệu quả điều trị cao , độc tính thấp và ít bị kháng thuốc là một yêu cầu tất yếu trong phát triển y tê.

Môi trường tự nhiên rất đa dạng của nước ta là một điều kiện thuận lới cho sự sinh sôi , phát triển của hệ vi sinh vật , trong đó đáng chú ỳ là các xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh , đặc biệt là chi xạ khuẩn Streptomyces vì trong tất cả các kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% nhuồn gốc từ xạ khuẩn và 55% trong số đó thuộc chi Streptomyces. Nắm bắt được xu hướng này , chúng tôi lựa chọn dề tài “ Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28” đề làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu như sau:  Nghiên cứu cải tạo giống đề nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 166.  Nghiên cứu điều kiện lên men , chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất.  Nghiên cứu 1 vài đặc tính của kháng sinh thu được 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về kháng sinh 1.1 Lich sử nghiên cứu kháng sinh Người đầu tiên đạt nền móng cho khoa học nghiên cứu chất kháng sinh là Alexander Fleming – nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra tác dụng kháng sinh vào tháng 10-1928 .[17] Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penicillin đã được nghiên cứu, sản xuất với số lượng lớn và trở thành “ một loại thuốc thần kỳ” .Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh.2 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những hợp chất cón nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh ( cũng như cả với các tế bào ung thư ) ở nồng độ thấp mà không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người , động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung.3 Phân loại kháng sinh Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng.

- Các kháng sinh khác : rifampicin … [9,16] 1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. [15]Có 6 kiểu chủ yếu: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất - Tác dụng lên sự tổng hợp ADN - Tác dụng lên sự tổng hợp protein - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh 1.5 Các ứng dụng của kháng sinh + Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.[15] + Lĩnh vực khác:  Trong chăn nuôi: Bác sỹ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật :Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò … kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc , gia cầm, giảm chi phí thức ăn , tăng sản lượng trứng ở gà , vịt … [15]  Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin.[15]  Trong công nghiệp thực phẩm: Một số kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm tươi, đóng hộp; ví dụ: Subtilin, Nisin.2 Đại cƣơng về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn.

Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều.[15] Trong số hơn 16,000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: - Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ.2 : khuẩn lạc xạ khuẩn 6 - Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm.

Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Xạ khuẩn phát triển theo kiểu mọc trồi. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… [5] - Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3.[15] Actinomycetes Actinomycetales VSV giống xạ khuẩn Actinoplanaceae Streptomycetaceae Actinomycetaceae … Streptoverticulum Streptomyces Themostreptomyces … Hình 1.3 : sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces.

(Tham khảo phụ lục 1) [7] - Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh: + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ.[6] 7 + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ.[6] + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp). [20] Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn.4 : Các khuẩn ty ở xạ khuẩn - Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao.

Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[8,19] - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid .3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Dưới dây giới thiệu sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh [4,9] Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Nhân giố ng trong phòng thí nghiê ̣m Nhân giố ng trên thiế t bi ̣nhân giố ng Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khố i Chiế t bằ ng dung môi hữu cơ Dịch lọc Dịch chiết sinh khối Dùng cột trao đổi ion… Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm tinh chế Kiể m nghiê ̣m Sản phẩm đã được kiểm nghiê ̣m Đóng gói Sản phẩm đóng gói Hình 1.5: Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 9 1.4 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống của xạ khuẩn 1. Chọn lọc ngẫu nhiên Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết , có cả thể có HTKS tăng lên 20-30% so với những cá thể khác , phương pháp này giúp tuyển chọn các cá thể có HTKS cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp [9] 1.

Đột biến cải tạo giống Trong thực tế việc chọn lọc ngẫu nhiên các cá thể có hoạt tính cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, chưa có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh người ta áp dụng phương pháp đột biến nhân tạo.[9] Có 3 nhóm tác nhân gây gây đột biến :  Tác nhân hóa học : Hydroxylamin, ethylenimin, nitroso-guanidine, HNO2…  Tác nhân vật lý : Ánh sáng UV, tia X, tia gamma hay electron… Khả năng gây đột biến của ánh sáng UV phụ thuộc vào cường độ bức xạ, khoảng cách chiếu và thời gian chiếu.  Tác nhân sinh học : Các yếu tố di truyền động transposan , phage Mu. Sau khi chiụ tác đô ̣ng của các tác nhân đô ̣t biế n , phầ n lớn các VSV chế t.

Trong số các biế n chủng số ng sót có biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh tổ ng hơ ̣p KS tăng (đô ̣t biế n dương), có biến chủng có hiệu suất giảm (đô ̣t biế n âm). Cầ n cho ̣n lo ̣c ra những biế n chủng có hiê ̣u suấ t sinh KS tăng để nghiên cứu tiế p .