Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn
Kháng sinh giữ vai trò thiết yếu trong y học điều trị và dự phòng các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm ở người, đồng thời được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi, trồng trọt và công nghiệp bảo quản thực phẩm. Tại Việt Nam – một quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa với cơ cấu bệnh tật mang tỷ lệ nhiễm trùng cao, nhu cầu sử dụng kháng sinh là rất lớn. Tuy nhiên, thị trường dược phẩm trong nước phần lớn vẫn phải nhập khẩu kháng sinh dưới dạng thành phẩm hoặc nguyên liệu bán thành phẩm; ngành công nghiệp sinh tổng hợp kháng sinh quy mô công nghiệp chưa thực sự hoàn thiện. Đi kèm với đó, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào nhóm các quốc gia có tỷ lệ kháng kháng sinh cao trên thế giới. Do đó, việc nghiên cứu phát triển các nguồn kháng sinh tự nhiên có hoạt lực mạnh, độc tính thấp và hạn chế nguy cơ kháng thuốc trở thành một định hướng thực tiễn cấp thiết.
Hệ sinh thái tự nhiên tại Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên vi sinh vật phong phú, trong đó xạ khuẩn (đặc biệt là chi Streptomyces) đóng vai trò quan trọng nhất trong việc sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học. Thống kê khoa học chỉ ra rằng khoảng 60% kháng sinh tự nhiên đã biết có nguồn gốc từ xạ khuẩn, và 55% trong số đó được sinh tổng hợp bởi các loài thuộc chi Streptomyces. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn này, đề tài "Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 166.28" được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng sinh học của chủng xạ khuẩn bản địa.
Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
Đề tài xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:
- Nghiên cứu cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 166.28.
- Nghiên cứu điều kiện lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất.
- Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh thu được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Chủng xạ khuẩn Streptomyces 166.28 đã qua phân lập, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, do Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
- Vi sinh vật kiểm định: Chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus ATCC 9946) và chủng vi khuẩn Gram âm (Shigella flexneri DT 11).
- Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học (phối hợp cùng Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, và Bộ môn Hóa vật liệu - Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội), hoàn thành vào tháng 5 năm 2013.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khung lý thuyết và mô hình nghiên cứu
Khóa luận xây dựng trên các nền tảng lý thuyết vi sinh học dược phẩm và hóa học các hợp chất thiên nhiên:
- Đặc điểm sinh học và sinh lý của chi Streptomyces: Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) Gram dương, hiếu khí hoại sinh, tỷ lệ G+C > 55%, có hệ khuẩn ty phân nhánh gồm khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai (idiolite), thường được tạo thành vào cuối pha lũy thừa hoặc trong pha cân bằng của đường cong sinh trưởng.
- Cơ chế tác động của kháng sinh: Ức chế chọn lọc tế bào vi sinh vật qua 6 cơ chế chính (tổng hợp thành tế bào, chức năng màng nguyên sinh chất, tổng hợp ADN, tổng hợp protein, trao đổi hô hấp, trao đổi chất trung gian).
- Nguyên lý cải tạo giống vi sinh vật: Sử dụng phương pháp chọn lọc biến dị tự nhiên kết hợp phương pháp gây đột biến nhân tạo bằng tác nhân vật lý (bức xạ tử ngoại - UV) và tác nhân hóa học ($\text{NaNO}_2$) nhằm thu nhận các biến chủng có hiệu suất tích lũy kháng sinh vượt trội (đột biến dương).
- Nguyên lý chiết tách và phân tích cấu trúc: Quá trình phân bố chất tan qua hệ dung môi hữu cơ phân cực/kém phân cực theo pH, kỹ thuật sắc ký hấp phụ (sắc ký lớp mỏng - TLC, sắc ký cột cổ điển - CC), cùng các phương pháp quang phổ học thực nghiệm (UV-Vis, IR, MS) để định danh nhóm chức và phân tử lượng.
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp giữ giống và nuôi cấy: Nuôi cấy cấy ria/zig-zag trên môi trường thạch nghiêng thích hợp ở nhiệt độ 28–29°C trong 6–10 ngày, bảo quản ở 2°C và định kỳ cấy chuyền sau 3–6 tháng.
- Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh (HTKS): Đánh giá khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (phương pháp khối thạch $\Phi = 6{,}0\text{ mm}$, phương pháp giếng thạch $\Phi = 6{,}0\text{ mm}$, phương pháp khoanh giấy lọc $\Phi = 6{,}0\text{ mm}$). Đo đường kính vòng vô khuẩn $D$ (mm) bằng thước kẹp Palmer (độ chính xác 0,02 mm), xử lý thống kê theo công thức độ lệch chuẩn hiệu chỉnh ($n = 3$).
- Phương pháp tạo đột biến:
- Đột biến vật lý: Chiếu đèn tử ngoại UV ($\lambda = 254\text{ nm}$, công suất 60 W, điện áp 220 V) ở khoảng cách 60 cm trong thời gian 5 phút lên hỗn dịch bào tử nồng độ $10^{-1}$, ủ tối 2 giờ trước khi pha loãng và cấy gạt.
- Đột biến hóa học: Xử lý hỗn dịch bào tử với tác nhân $\text{NaNO}_2$ ($0{,}07\text{ g}$ trong 9 ml dung dịch nồng độ $10^{-1}$), acid hóa bằng $\text{HCl } 1\text{N}$ về $\text{pH } 4{,}5$, sau đó trung hòa bằng $\text{NaOH } 1\text{N}$ đến $\text{pH } 7–8$.
- Phương pháp lên men chìm (Submerged Fermentation):
- Nhân giống cấp 1: Bình nón 500 ml chứa 100 ml môi trường dịch thể, nuôi trên máy lắc tròn Taitec Bio-Shaker BR 300 Lf (tốc độ 140 vòng/phút, nhiệt độ $28 \pm 0{,}1^\circ\text{C}$, thời gian 48 giờ).
- Lên men sản xuất: Cấy giống cấp 1 vào bình lên men theo tỷ lệ thể tích $V_{\text{giống}} : V_{\text{môi trường}} = 1 : 10$, lắc 140 vòng/phút ở $28 \pm 0{,}1^\circ\text{C}$ trong 120 giờ.
- Phương pháp chiết tách và tinh chế:
- Chiết dịch lọc lên men bằng dung môi hữu cơ với tỷ lệ $V_{\text{dung môi}} : V_{\text{dịch lọc}} = 1 : 5$ tại các giá trị pH khảo sát ($3, 5, 7, 9, 11$).
- Thu hồi kháng sinh thô bằng thiết bị cất quay chân không Buchi Waterbath B480 ở $60^\circ\text{C}$, áp suất $0{,}9\text{ atm}$.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản nhôm tráng sẵn Silicagel $60\text{ F}_{254}$ (Merck).
- Sắc ký cột hấp phụ (Column Chromatography) sử dụng hạt Silicagel $60\text{ F}_{254}$ kích thước $0{,}06–0{,}1\text{ mm}$ (cột đường kính 1 cm, chiều dài 50 cm, tốc độ rửa giải $0{,}5\text{ ml/phút}$).
- Phương pháp xác định tính chất lý hóa:
- Đo điểm nóng chảy bằng máy E2-Melt.
- Đo quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại (IR), và phổ khối lượng (MS).
Nội dung chính theo từng chương
Chương I: Tổng quan
Chương này hệ thống hóa các tư liệu khoa học liên quan đến đề tài:
- Trình bày lịch sử phát minh kháng sinh từ công trình của Alexander Fleming (1928), giải Nobel của Florey, định nghĩa kháng sinh và phân loại theo nguồn gốc, cấu trúc, cơ chế tác động.
- Nêu rõ đặc tính sinh học của xạ khuẩn và chi Streptomyces (hình thái sợi, khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, các dạng chuỗi bào tử trơn, xù xì, có gai; đặc điểm dị dưỡng oxy hóa, khả năng sinh sắc tố gồm sắc tố tan, sắc tố khuẩn ty và melanoid).
- Đưa ra sơ đồ quy trình công nghệ tổng quát sản xuất kháng sinh (nhân giống phòng thí nghiệm $\rightarrow$ nhân giống thiết bị $\rightarrow$ lên men $\rightarrow$ lọc tách pha $\rightarrow$ chiết dung môi/trao đổi ion $\rightarrow$ cô đặc, tinh chế $\rightarrow$ kiểm nghiệm $\rightarrow$ đóng gói).
- Tổng quan các phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên, cơ chế đột biến sinh học - hóa học - vật lý, các phương thức bảo quản giống vi sinh vật.
- Phân tích kỹ thuật lên men bề mặt và lên men chìm (lên men mẻ, bổ sung, liên tục, bán liên tục), ưu nhược điểm của từng phương pháp.
- Tổng hợp các nguyên lý phân tích cấu trúc sơ bộ qua phổ tử ngoại UV-Vis, phổ hồng ngoại IR (nhận diện dao động nhóm chức), và phổ khối MS (xác định tỷ số $m/z$ và phân tử lượng).
- Điểm luận hai nghiên cứu thực nghiệm tiêu biểu: (1) Phát hiện sceliphrolactam từ 200 chủng Streptomyces cộng sinh trên ong bắp cày tại Đại học Madison - Wisconsin; (2) Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Streptomyces orientalis 4912 sản xuất vancomycin (môi trường tối ưu giúp tăng kháng sinh 38,7% và tăng sinh khối 46,6%).
Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương II mô tả chi tiết các nguyên vật liệu, hóa chất, chủng vi sinh và quy trình thực nghiệm:
- Chủng giống: Streptomyces 166.28; vi sinh vật kiểm định gồm Bacillus cereus ATCC 9946 và Shigella flexneri DT 11.
- Hệ thống môi trường nuôi cấy:
- Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định (canh thang và thạch thường: NaCl 0,5%, cao thịt 0,3%, pepton 0,5%, thạch 1,8%, pH 7,0–7,4).
- Môi trường nuôi cấy và lên men xạ khuẩn (MT1, MT2, MT3 và các môi trường dịch thể tương ứng MT1dt, MT2dt, MT3dt không chứa thạch).
| Thành phần dinh dưỡng |
Đơn vị |
MT1 (MT1dt) |
MT2 (MT2dt) |
MT3 (MT3dt) |
| Tinh bột |
g |
2 |
- |
2 |
| Lactose |
g |
- |
3,0 |
- |
| Cao ngô |
g |
- |
0,5 |
- |
| $\text{KNO}_3$ |
g |
0,1 |
- |
- |
| $\text{KCl}$ |
g |
0,05 |
- |
- |
| $\text{NaNO}_3$ |
g |
- |
0,2 |
- |
| $\text{NH}_4\text{NO}_3$ |
g |
- |
0,2 |
- |
| $\text{CaCO}_3$ |
g |
- |
0,3 |
- |
| $\text{FeSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$ |
g |
0,05 |
0,05 |
0,15 |
| $\text{NaCl}$ |
g |
0,05 |
- |
- |
| Thạch (đối với môi trường đặc) |
g |
1,8 |
2,0 |
2,0 |
| Nước cất vừa đủ |
ml |
100 |
100 |
100 |
| pH |
- |
6,8–7,2 |
6,8–7,2 |
6,8–7,2 |
- Hóa chất và trang thiết bị: Danh mục 13 dung môi hữu cơ tinh khiết (aceton, n-butanol, butylacetat, cloroform, diclorometan, ethanol, ethylacetat, methanol, triethylamin...); tủ cấy vô trùng Aura VF 48, nồi hấp Hirayama HL3030, máy lắc sinh học Taitec Bio-Shaker, máy cất quay chân không Buchi B480, máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt.
Chương III: Kết quả thực nghiệm và nhận xét
Chương III trình bày toàn bộ số liệu thu được qua các bước nghiên cứu thực nghiệm:
1. Chọn lọc và đột biến cải tạo giống
- Sàng lọc ngẫu nhiên (SLNN): Thu nhận các dạng chủng phân lập tự nhiên có hoạt tính ức chế đối với B. cereus và S. flexneri. Dạng chủng SLNN.28 đạt đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là $18{,}44 \pm 0{,}52\text{ mm}$ (B. cereus) và $18{,}87 \pm 1{,}99\text{ mm}$ (S. flexneri).
- Đột biến UV lần 1: Chiếu xạ UV chủng SLNN.3 tạo ra biến chủng ĐB1.24 có hoạt tính kháng sinh tăng mạnh nhất:
- Với B. cereus: $D = 23{,}73 \pm 0{,}28\text{ mm}$ (tăng 129,09% so với mẫu chứng $18{,}38\text{ mm}$).
- Với S. flexneri: $D = 24{,}47 \pm 0{,}45\text{ mm}$ (tăng 126,05% so với mẫu chứng $19{,}41\text{ mm}$).
- Đột biến UV lần 2: Chiếu xạ tiếp trên biến chủng ĐB1.24 thu được chủng ĐB2.31 có hoạt tính tiếp tục tăng:
- Với B. cereus: $D = 25{,}11 \pm 0{,}12\text{ mm}$ (tăng 113,45% so với mẫu chứng $22{,}13\text{ mm}$).
- Với S. flexneri: $D = 24{,}87 \pm 0{,}26\text{ mm}$ (tăng 111,81% so với mẫu chứng $22{,}24\text{ mm}$).
- Đột biến hóa học bằng $\text{NaNO}_2$: Biến chủng ĐBHH.27 đạt $D = 23{,}05 \pm 0{,}38\text{ mm}$ (103,77% so với MC) trên B. cereus và $23{,}67 \pm 0{,}34\text{ mm}$ (105,70% so với MC) trên S. flexneri.
| Phương pháp cải tạo giống |
Biến chủng tối ưu |
Đường kính vòng vô khuẩn trên B. cereus (mm) |
% Biến đổi hoạt tính so với MC |
Đường kính vòng vô khuẩn trên S. flexneri (mm) |
% Biến đổi hoạt tính so với MC |
| Chọn lọc ngẫu nhiên |
SLNN.28 |
$18{,}44 \pm 0{,}52$ |
- |
$18{,}87 \pm 1{,}99$ |
- |
| Đột biến UV lần 1 |
ĐB1.24 |
$23{,}73 \pm 0{,}28$ |
129,09% |
$24{,}47 \pm 0{,}45$ |
126,05% |
| Đột biến UV lần 2 |
ĐB2.31 |
$25{,}11 \pm 0{,}12$ |
113,45% |
$24{,}87 \pm 0{,}26$ |
111,81% |
| Đột biến hóa học ($\text{NaNO}_2$) |
ĐBHH.27 |
$23{,}05 \pm 0{,}38$ |
103,77% |
$23{,}67 \pm 0{,}34$ |
105,70% |
2. Tối ưu hóa lên men chìm và chọn chủng lên men
- Chọn môi trường lên men: Tiến hành nuôi cấy chìm trên 3 môi trường dịch thể. Kết quả MT2dt cho hoạt tính kháng sinh cao nhất với $D = 23{,}59 \pm 0{,}49\text{ mm}$ (B. cereus) và $22{,}89 \pm 0{,}40\text{ mm}$ (S. flexneri), vượt trội so với MT1dt ($21{,}23\text{ mm}$ / $21{,}31\text{ mm}$) và MT3dt ($19{,}86\text{ mm}$ / $19{,}36\text{ mm}$). MT2dt được chọn làm môi trường lên men chính thức.
- Chọn chủng lên men chìm: Lên men kiểm tra 12 biến chủng ưu tú trong MT2dt; kết quả biến chủng ĐB2.8 cho hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất trong dịch lên men.
3. Chiết xuất và tinh chế kháng sinh
- Chiết xuất dịch lên men: Gộp 6,5 lít dịch lọc lên men, điều chỉnh về $\text{pH } 3$, chiết bằng n-butanol thu được 850 ml dịch chiết hữu cơ. Cất quay chân không thu hồi được $0{,}4953\text{ g}$ bột kháng sinh thô.
- Khảo sát hệ dung môi chạy bản mỏng (TLC):
- Hệ 1: Cloroform : Methanol : Amoniac 25% (2:2:1) $\rightarrow R_f = 0{,}91$ (vết kéo ngang).
- Hệ 2: Butanol : Ethanol : Dimethylformamid (3:1:1) $\rightarrow R_f = 0{,}75$ (vết tròn).
- Hệ 3: Butylacetat : Ethanol : Triethylamin (1:2:1) $\rightarrow R_f = 0{,}84$ (khả năng phân tách tốt nhất).
- Hệ 4: Ethylacetat : Propanol : Dicloromethan (2:2:1) $\rightarrow R_f = 0{,}88$ (vết tròn).
- Sắc ký cột lần 1: Nạp $0{,}4953\text{ g}$ kháng sinh thô lên cột Silicagel với pha động là Hệ 3. Thu 15 phân đoạn ($5\text{ ml/phân đoạn}$). Phân đoạn 1 đến 10 có hoạt tính kháng sinh mạnh ($D = 20{,}89 - 25{,}49\text{ mm}$) nhưng vết sắc ký kéo dài hình ngọn đuốc, chứng tỏ chưa tách triệt để các cấu tử. Gộp phân đoạn 1–10 và cô chân không thu được $0{,}2165\text{ g}$ bột.
- Sắc ký cột lần 2: Nạp $0{,}2165\text{ g}$ bột chạy cột lần 2 với hệ dung môi Ethylacetat : Methanol (15:1), thu 31 phân đoạn ($2{,}5\text{ ml/phân đoạn}$). Kết quả phân tách thành 3 nhóm rõ rệt:
| Phân đoạn |
Thành phần nhận diện trên TLC |
Hoạt tính kháng sinh $D \pm s$ (mm) trên B. cereus |
Đánh giá phân đoạn |
| 1 – 2 |
Không phát hiện |
$0{,}00 \pm 0{,}00$ |
Không chứa hoạt chất |
| 3 – 12 |
1 vết đơn ($R_{f1} = 0{,}83$) |
$21{,}54 \pm 0{,}67 \rightarrow 24{,}82 \pm 0{,}62$ |
Nhóm 1: Chứa kháng sinh 1 (KS1) |
| 13 – 24 |
2 vết ($R_{f1} = 0{,}83$ và $R_{f2} = 0{,}59$) |
$16{,}26 \pm 0{,}27 \rightarrow 24{,}67 \pm 0{,}47$ |
Nhóm 2: Phần xen phủ (KS1 + KS2) |
| 25 – 29 |
1 vết đơn ($R_{f2} = 0{,}59$) |
$15{,}93 \pm 0{,}52 \rightarrow 23{,}14 \pm 0{,}53$ |
Nhóm 3: Chứa kháng sinh 2 (KS2) |
| 30 – 31 |
Không phát hiện |
$0{,}00 \pm 0{,}00$ |
Kết thúc rửa giải |
- Kết quả thu hồi và hiệu suất tinh chế:
- Kháng sinh 1 (KS1 - thành phần chính, bột màu nâu đỏ): $m_1 = 0{,}0265\text{ g}$, hiệu suất tinh chế đạt $12{,}24%$.
- Kháng sinh 2 (KS2): $m_2 = 0{,}0113\text{ g}$, hiệu suất tinh chế đạt $5{,}21%$.
- Phần xen phủ: $m_{\text{xf}} = 0{,}1175\text{ g}$.
- Tổng hiệu suất tinh chế kháng sinh đạt: $12{,}24% + 5{,}21% = 17{,}45%$.
4. Tính chất lý hóa và dữ liệu phổ của KS1 tinh khiết
- Nhiệt độ nóng chảy ($T_{\text{nc}}$): $215{,}5^\circ\text{C}$.
- Phổ hấp thụ tử ngoại (UV-Vis trong Methanol): Xuất hiện 3 cực đại hấp thụ tại các bước sóng $\lambda_1 = 209{,}5\text{ nm}$, $\lambda_2 = 334\text{ nm}$ và $\lambda_3 = 443\text{ nm}$, chứng minh phân tử chứa hệ liên kết đôi liên hợp và dị tố.
- Phổ hồng ngoại (IR): Xác định các dải hấp thụ dao động đặc trưng cho các nhóm chức hóa học:
| Số sóng hấp thụ ($\text{cm}^{-1}$) |
Nhóm chức / Liên kết dự đoán |
| 3437 |
Amin $(>\text{NH})$ |
| 2961, 2926, 2857 |
$-\text{C}-\text{H}$ của nhóm $-\text{CH}_3$ |
| 1741 |
$>\text{C}=\text{O}$ của vòng cyclopentanon |
| 1651 |
$>\text{C}=\text{C}<$ |
| 1584 |
Liên kết trong muối amoni $(-\text{NH}_3^+)$ |
| 1464 |
$-\text{CH}_2-$ |
| 1379 |
Nhóm $-\text{CH}_3$ bất đối xứng |
| 1296 |
Nhóm $-\text{NO}_2^-$ |
| 1095 |
$-\text{C}-\text{O}-\text{C}$ của ether béo |
| 635 |
$\equiv\text{CH}$ hoặc $>\text{C}-\text{X}$ (với $\text{X}$ là $\text{Cl}, \text{Br}$) |
- Phổ khối lượng (MS): Xác định phân tử lượng của kháng sinh KS1 là $1291{,}80160\text{ đvC}$.
Kết quả và đóng góp
Kết quả chính
- Xác định được phương pháp đột biến thực nghiệm tối ưu để cải tạo giống Streptomyces 166.28; trong đó chiếu xạ UV hai lần liên tiếp (chủng ĐB2.31) và đột biến hóa học bằng $\text{NaNO}_2$ (chủng ĐBHH.27) giúp nâng cao đường kính vòng kháng khuẩn đối với B. cereus và S. flexneri từ $18{,}38\text{ mm}$ lên trên $25\text{ mm}$.
- Xác định được môi trường lên men chìm thích hợp nhất là MT2dt (chứa lactose 3,0%, cao ngô 0,5%, $\text{NaNO}_3$ 0,2%, $\text{NH}_4\text{NO}_3$ 0,2%, $\text{CaCO}_3$ 0,3%, $\text{FeSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$ 0,05%, pH 6,8–7,2).
- Thiết lập quy trình chiết xuất từ dịch lọc lên men bằng n-butanol ở $\text{pH } 3$, tinh chế qua hệ 2 cột sắc ký Silicagel (hệ dung môi Butylacetat : Ethanol : Triethylamin 1:2:1 và hệ Ethylacetat : Methanol 15:1).
- Phân lập thành công 2 hoạt chất kháng sinh riêng biệt từ dịch lên men, trong đó kháng sinh chính KS1 (màu nâu đỏ) đạt hiệu suất tinh chế $12{,}24%$, kháng sinh KS2 đạt $5{,}21%$ (tổng hiệu suất đạt $17{,}45%$).
- Xác định các thông số lý hóa chuẩn xác của KS1: nhiệt độ nóng chảy $215{,}5^\circ\text{C}$; phân tử lượng $1291{,}80160\text{ đvC}$; các đỉnh UV $209{,}5\text{ nm}, 334\text{ nm}, 443\text{ nm}$; các nhóm chức amin, carbonyl vòng cyclopentanon, liên kết đôi, nhóm nitro, ether béo và dẫn chất halogen trên phổ IR.
Giải pháp và đề xuất
- Đề xuất quy trình nuôi cấy chìm 120 giờ kết hợp chiết xuất phân đoạn làm tiền đề công nghệ cho việc thu nhận kháng sinh tự nhiên từ xạ khuẩn ở quy mô phòng thí nghiệm.
- Áp dụng hệ dung môi sắc ký Ethylacetat : Methanol (15:1) để tinh chế triệt để các phân đoạn kháng sinh có độ phân cực gần nhau.
Đóng góp về mặt khoa học
- Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về chủng xạ khuẩn Streptomyces 166.28 tại Việt Nam, từ khâu chọn tạo đột biến giống, tối ưu hóa thành phần cơ chất lên men đến quy trình phân lập và phân tích phổ cấu trúc của chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Nghiên cứu mới dừng lại ở bước dự đoán các nhóm chức và phân tử lượng của kháng sinh KS1 thông qua phổ UV, IR và MS; chưa xác định được công thức phân tử và cấu trúc không gian đầy đủ của hợp chất.
- Chủng xạ khuẩn mới được định danh sơ bộ ở mức độ chi (Streptomyces 166.28), chưa được giải trình tự gen để định danh chính xác loài sinh học.
- Quy trình chiết tách còn phân đoạn xen phủ khá lớn ($0{,}1175\text{ g}$ hỗn hợp KS1 và KS2), làm giới hạn hiệu suất thu hồi sản phẩm tinh khiết tuyệt đối.
Hướng nghiên cứu phát triển
- Tiếp tục gây đột biến chủng giống Streptomyces 166.28 bằng các phương pháp nâng cao (đột biến bậc thang, kỹ thuật di truyền, tái tổ hợp gen) để tạo các chủng siêu tổng hợp kháng sinh.
- Khảo sát sâu hơn các yếu tố công nghệ lên men (nồng độ oxy hòa tan, tốc độ khuấy, nhiệt độ theo từng pha sinh trưởng) nhằm tăng tỷ lệ tích lũy của từng cấu tử kháng sinh riêng biệt trong dịch lên men.
- Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết tách để nâng cao hiệu suất phân lập, đồng thời thay thế các hệ dung môi độc hại bằng các dung môi thân thiện và an toàn hơn.
- Thực hiện đo và biện giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$) kết hợp với phổ 2D-NMR để xác định chính xác công thức cấu tạo hóa học của kháng sinh KS1 và KS2.
- Tiến hành giải trình tự gen (đoạn gen 16S rRNA) để nhận biết, phân loại và đăng ký chủng Streptomyces 166.28 trên ngân hàng gen quốc tế.
Giá trị tham khảo
- Đối tượng tham khảo: Khóa luận là tài liệu chuyên khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Dược học, Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Hóa hợp chất thiên nhiên và Công nghệ lên men vi sinh.
- Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
- Quy trình thực nghiệm đột biến giống xạ khuẩn bằng bức xạ tử ngoại UV và hóa chất $\text{NaNO}_2$.
- Công thức môi trường dinh dưỡng dịch thể MT2dt và thông số vận hành lên men chìm (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc).
- Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (khối thạch, giếng thạch, khoanh giấy lọc) đối với cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm.
- Kỹ thuật sắc ký cột 2 giai đoạn để tinh chế các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học từ dịch lên men vi sinh vật.
Câu hỏi thường gặp
1. Chủng xạ khuẩn nào được sử dụng trong nghiên cứu và nguồn gốc từ đâu?
Nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces 166.28 đã qua phân lập, tuyển chọn và có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, do Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
2. Hai chủng vi sinh vật nào được dùng để kiểm định hoạt tính kháng sinh?
Hai chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Sinh học gồm có: vi khuẩn Gram dương Bacillus cereus ATCC 9946 và vi khuẩn Gram âm Shigella flexneri DT 11.
3. Phương pháp đột biến nào mang lại hiệu quả tăng hoạt tính kháng sinh cao nhất cho chủng giống?
Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV lần 2 trên biến chủng ĐB1.24 (tạo ra biến chủng ĐB2.31) mang lại hiệu quả cao nhất với đường kính vòng vô khuẩn đạt $25{,}11 \pm 0{,}12\text{ mm}$ trên B. cereus (tăng 113,45% so với mẫu chứng) và $24{,}87 \pm 0{,}26\text{ mm}$ trên S. flexneri (tăng 111,81% so với mẫu chứng).
4. Môi trường lên men chìm tối ưu nhất có thành phần cơ chất như thế nào?
Môi trường lên men chìm tối ưu là MT2dt, có thành phần gồm: lactose 3,0 g; cao ngô 0,5 g; $\text{NaNO}_3$ 0,2 g; $\text{NH}_4\text{NO}_3$ 0,2 g; $\text{CaCO}_3$ 0,3 g; $\text{FeSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$ 0,05 g trong 100 ml nước cất, điều chỉnh pH trong khoảng 6,8–7,2.
5. Kháng sinh tinh khiết chính (KS1) thu được có những đặc tính lý hóa và quang phổ cụ thể nào?
Kháng sinh KS1 là dạng tinh thể màu nâu đỏ, có nhiệt độ nóng chảy $215{,}5^\circ\text{C}$, khối lượng phân tử $1291{,}80160\text{ đvC}$ (đo trên phổ MS). Trên phổ UV-Vis trong methanol, chất có 3 cực đại hấp thụ tại $\lambda = 209{,}5\text{ nm}, 334\text{ nm}, 443\text{ nm}$. Phổ IR ghi nhận các nhóm chức đặc trưng gồm amin ($3437\text{ cm}^{-1}$), carbonyl vòng cyclopentanon ($1741\text{ cm}^{-1}$), liên kết đôi ($1651\text{ cm}^{-1}$), nhóm nitro ($1296\text{ cm}^{-1}$), ether béo ($1095\text{ cm}^{-1}$) và liên kết halogen ($635\text{ cm}^{-1}$).
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Soutthida Vongsavath đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu nghiên cứu thực nghiệm về sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Streptomyces 166.28. Nghiên cứu đã cải tạo thành công chủng giống thông qua đột biến UV và hóa học, xác định được môi trường lên men chìm MT2dt tối ưu và thiết lập quy trình sắc ký cột 2 giai đoạn để tinh chế sản phẩm với tổng hiệu suất $17{,}45%$. Các dữ liệu lý hóa và quang phổ (UV-Vis, IR, MS) đã cung cấp những đặc trưng ban đầu có giá trị khoa học về cấu trúc của kháng sinh KS1 phân tử lượng $1291{,}80160\text{ đvC}$, tạo cơ sở vững chắc cho các nghiên cứu giải mã cấu trúc chi tiết bằng NMR và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh tự nhiên tại Việt Nam.
