Nghiên Cứu Nuôi Trồng Tảo Xanh Dunaliella Salina Trong Hệ Thống Ao Raceway: Khóa Luận Tốt Nghiệp

Nghiên cứu về nuôi trồng tảo xanh Dunaliella salina trong hệ thống ao raceway, ứng dụng trong khóa luận tốt nghiệp, đánh giá hiệu quả và tiềm năng phát triển.

• Tác giả: Bùi Quang Hiệp
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Đức Bách
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu nuôi trồng tảo xanh Dunaliella Salina trong hệ thống ao raceway
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ACKNOWLEDGEMENT
• 1. PART 1: INTRODUCTION
• 1.1. Purpose and requirement
• 2. PART 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Overview of the Dunaliella salina
• 2.2. Taxonomic, morphological and biological characteristics of Dunaliella salina
• 2.2.1. Taxonomy of Dunaliella salina
• 2.2.2. Morphology of Dunaliella salina
• 2.2.3. Biology characteristics of Dunaliella salina
• 2.3. Factors affecting the growth of Dunaliella salina
• 2.4. Application of Dunaliella salina
• 2.5. Studies on Dunaliella salina
• 2.5.1. Studies on Dunaliella salina in Vietnam
• 2.5.2. Studies on Dunaliella salina in the world
• 2.6. Algae biomass production by Raceway pond
• 2.6.1. Introduction of the Raceway pond
• 2.6.2. Typical configuration of the Raceway pond
• 3. PART 3: RESEARCH METHODOLOGY
• 3.1. Study time and place
• 3.2. Determination of cell density by Neubauer counting chamber
• 3.3. Determination of specific growth rate
• 3.4. Determination of the optimal culture medium
• 3.5. Effect of temperature on the growth of Dunaliella salina
• 3.6. Effect of light intensity on the growth of Dunaliella salina
• 3.7. Effect of salinity on the growth of Dunaliella salina
• 3.8. The growth of Dunaliella salina in Raceway pond
• 4. PART 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Preservation of Dunaliella salina
• 4.2. Determination of the optimal culture medium
• 4.3. Effect of temperature on the growth of Dunaliella salina
• 4.4. Effect of light intensity on the growth of Dunaliella salina
• 4.5. Effect of salinity on the growth of Dunaliella salina
• 4.6. The growth of Dunaliella salina in raceway pond
• 5. PART 5: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES
• ABSTRACT

Tóm tắt

I. Nuôi trồng tảo xanh Dunaliella Salina

Nghiên cứu tập trung vào nuôi trồng tảo xanh Dunaliella Salina, một loại vi tảo có giá trị cao trong sản xuất β-carotene. Dunaliella Salina được nuôi trong hệ thống ao raceway, một phương pháp hiệu quả để sản xuất sinh khối tảo. Nghiên cứu này nhằm xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của tảo, bao gồm môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, cường độ ánh sáng và độ mặn. Khóa luận tốt nghiệp này đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các ứng dụng thực tiễn của tảo xanh trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

1.1. Hệ thống ao raceway

Hệ thống ao raceway là một phương pháp nuôi trồng tảo hiệu quả, đặc biệt phù hợp với Dunaliella Salina. Hệ thống này cho phép kiểm soát các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ và độ mặn, tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của tảo. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ thống nuôi trồng này có thể tăng cường sản xuất β-carotene, một hợp chất có giá trị cao trong công nghiệp.

1.2. Điều kiện nuôi trồng tảo

Các yếu tố như nhiệt độ, cường độ ánh sáng và độ mặn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của Dunaliella Salina. Nghiên cứu đã xác định rằng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của tảo là 24-28°C, cường độ ánh sáng 14Klux và độ mặn 1M. Những điều kiện này giúp tối đa hóa sản lượng β-carotene, một hợp chất có tiềm năng lớn trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.

II. Ứng dụng và giá trị của Dunaliella Salina

Dunaliella Salina là nguồn cung cấp β-carotene tự nhiên hàng đầu, có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Nghiên cứu này không chỉ xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển của tảo mà còn đề xuất các phương pháp quản lý nuôi trồng hiệu quả. Tảo biển này có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chức năng và bảo vệ sức khỏe con người.

2.1. Ứng dụng trong công nghiệp

Dunaliella Salina được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ hàm lượng β-carotene cao. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có khả năng ngăn ngừa ung thư, cải thiện thị lực và chống lão hóa. Tảo xanh Dunaliella cũng được sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm nhờ đặc tính chống oxy hóa mạnh.

2.2. Giá trị thực tiễn

Nghiên cứu này mang lại giá trị thực tiễn cao trong việc phát triển các phương pháp nuôi trồng tảo hiệu quả. Hệ thống ao raceway được đề xuất là một giải pháp tối ưu để sản xuất sinh khối tảo với chi phí thấp và hiệu suất cao. Nghiên cứu tảo này cũng mở ra cơ hội phát triển các sản phẩm chức năng từ tảo biển, góp phần bảo vệ sức khỏe con người.

III. Kết quả và khuyến nghị

Nghiên cứu đã xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu cho Dunaliella Salina là F/2, với các điều kiện nhiệt độ 24-28°C, cường độ ánh sáng 14Klux và độ mặn 1M. Kỹ thuật nuôi tảo trong hệ thống ao raceway đã chứng minh hiệu quả cao trong việc sản xuất sinh khối tảo. Nghiên cứu cũng đề xuất các khuyến nghị để cải thiện hiệu quả quản lý nuôi trồng và phát triển các ứng dụng thực tiễn của tảo xanh.

3.1. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy Dunaliella Salina phát triển tốt nhất trong môi trường F/2, với các điều kiện nhiệt độ 24-28°C, cường độ ánh sáng 14Klux và độ mặn 1M. Hệ thống nuôi trồng ao raceway đã chứng minh hiệu quả cao trong việc sản xuất sinh khối tảo, mở ra tiềm năng lớn cho các ứng dụng công nghiệp.

3.2. Khuyến nghị

Nghiên cứu đề xuất các khuyến nghị để cải thiện hiệu quả quản lý nuôi trồng và phát triển các ứng dụng thực tiễn của tảo xanh. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện nuôi trồng và mở rộng quy mô sản xuất trong hệ thống ao raceway. Tảo và môi trường cũng cần được quan tâm để đảm bảo sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp tảo.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Vi tảo biển Dunaliella salina (thuộc ngành Chlorophyta) được cộng đồng khoa học và công nghiệp công nhận là nguồn sinh học tự nhiên giàu hợp chất $\beta$-carotene nhất thế giới. Dưới các điều kiện cảm ứng bất lợi cực đoan, loài vi tảo này có thể tích lũy hàm lượng carotenoid lên tới 14% trọng lượng khô (Dry Cell Weight - DCW), vượt trội hoàn toàn so với các nguồn thực vật bậc cao. Hợp chất $\beta$-carotene đóng vai trò then chốt trong ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng nhờ hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, ngăn ngừa thoái hóa điểm vàng, chống ung thư và tăng cường miễn dịch. Ngoài ra, sinh khối Dunaliella salina sở hữu hàm lượng protein thô dồi dào (40% - 60% DCW), giàu các acid béo không bão hòa chuỗi dài và glycerol nội bào, mang lại giá trị sinh học vượt trội cho ngành nuôi trồng thủy sản và tiềm năng sản xuất nhiên liệu sinh học (biodiesel).

Mặc dù Việt Nam sở hữu đường bờ biển dài hơn 3.200 km cùng hệ thống đồng muối tự nhiên trù phú (Sa Huỳnh, Cam Ranh, Cần Giờ, Long Điền), việc nghiên cứu và làm chủ quy trình nuôi cấy Dunaliella salina ở quy mô bán công nghiệp ngoài trời vẫn còn nhiều khoảng trống. Các rào cản kỹ thuật chính bao gồm: sự phụ thuộc vào hệ thống Photobioreactor (PBR) khép kín có chi phí đầu tư thiết bị (CAPEX) và vận hành (OPEX) quá cao; hiện tượng sốc thẩm thấu (osmotic shock) do tảo thiếu vách tế bào cứng (rigid polysaccharide cell wall); cùng sự thiếu hụt các thông số chuẩn hóa về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ rọi quang học và độ mặn tối ưu cho sinh khối.

Đồ án khóa luận tốt nghiệp kỹ sư: “Study on the Cultivation of Green Algae Dunaliella Salina in Raceway Pond System” (thực hiện bởi Bùi Quang Hiệp, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Đức Bách) được triển khai nhằm giải quyết trực tiếp các bài toán công nghệ nêu trên.

Mục tiêu cụ thể của dự án:

1. Sàng lọc và xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu: Đánh giá định lượng tốc độ sinh trưởng của Dunaliella salina trên 3 hệ môi trường chuẩn: F/2 (Guillard), Walne và J/l.
2. Chuẩn hóa tổ hợp thông số lý hóa phục vụ nuôi cấy: Khảo sát thực nghiệm dải nhiệt độ (18–22°C, 24–28°C, nhiệt độ phòng/ngoài trời), cường độ chiếu sáng (10 Klux, 12 Klux, 14 Klux) và nồng độ muối NaCl (0.5M, 1.0M, 1.5M, 2.0M, 2.5M).
3. Thiết lập quy trình bảo quản giống thuần và scale-up sinh khối: Tối ưu hóa phương pháp lưu giữ giống dạng lỏng dài hạn (>12 tháng) và vận hành thành công mô hình bể hở Raceway Pond thể tích công tác 120 L.

Dự án đạt được các chỉ số định lượng then chốt: mật độ tế bào cực đại trong phòng thí nghiệm đạt $7.39 \times 10^6\text{ cells/mL}$ (ở điều kiện 14 Klux) và $6.25 \times 10^6\text{ cells/mL}$ (ở độ mặn 1.0M NaCl), tạo tiền đề vững chắc cho việc hạ giá thành nuôi trồng sinh khối vi tảo quy mô lớn tại Việt Nam.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trong công nghệ nuôi cấy vi tảo thương mại, việc lựa chọn công thức môi trường dinh dưỡng và cấu hình lò phản ứng sinh học quyết định trực tiếp đến năng suất sinh khối và hiệu quả kinh tế.

Tiêu chí so sánh	Môi trường F/2 (Guillard)	Môi trường Walne	Môi trường J/l
Thành phần dinh dưỡng chính	$\text{NaNO}_3$ ($0.10\text{ g/L}$), $\text{NaH}_2\text{PO}_4$, vi lượng chelate EDTA	$\text{NaNO}_3/\text{KNO}_3$ ($100\text{ g/L}$ stock), $\text{FeCl}_3$, vi lượng	$\text{NaCl}$ ($1.035\text{ g/L}$), Fe-EDTA, $\text{H}_3\text{BO}_3$
Khả năng đệm & hấp thu	Tối ưu hóa tỷ lệ N:P cho vi tảo biển, vi lượng EDTA linh hoạt	Nồng độ muối khoáng đậm đặc, dễ gây kết tủa phosphate	Thích hợp cho vi sinh vật đặc thù, dinh dưỡng vi lượng thấp
Mật độ tế bào cực đại ($10^6\text{ cells/mL}$)	$4.71 \pm 0.15$ (Ngày 8)	$3.13 \pm 0.12$ (Ngày 8)	$3.05 \pm 0.10$ (Ngày 8)
Đánh giá mức độ phù hợp	Tối ưu nhất cho D. salina	Trung bình, chi phí hóa chất cao	Kém thích hợp cho nhân sinh khối nhanh

Phân tích ma trận ưu tiên tính năng hệ thống theo mô hình MoSCoW:

• Must have: Hệ thống khuấy trộn liên tục chống lắng cặn; Môi trường dinh dưỡng vô trùng F/2; Nguồn sáng liên tục và kiểm soát nhiệt độ dải 24–28°C; Bộ đếm mật độ tế bào chuẩn xác (Neubauer).
• Should have: Cảm ứng độ mặn phân cấp để hạn chế sốc thẩm thấu; Hệ thống cấp khí $\text{CO}_2$ bổ sung cân bằng pH; Bể Raceway Pond có tỷ lệ thủy lực học tối ưu ($p/q \ge 10$).
• Could have: Cảm biến đo trực tuyến pH, OD680 và nhiệt độ tự động; Mái che quang học phân tán bức xạ ngoài trời.
• Won't have: Hệ thống gia nhiệt PBR đắt tiền; Sử dụng các hợp chất nitơ độc hại ($\text{NH}_4\text{NO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{CO}_3$).

Thách thức kỹ thuật cốt lõi: Dunaliella salina không có vách tế bào cellulose bảo vệ mà chỉ có màng mucilage đàn hồi, tự điều hòa áp suất thẩm thấu hoàn toàn bằng cách tăng/giảm hàm lượng glycerol nội bào theo hoạt độ nước ($a_w$). Khi độ mặn biến động đột ngột $>2.0\text{M}$ NaCl, tế bào bị mất nước nhanh dẫn đến teo tế bào và chết hàng loạt.

Thiết kế hệ thống

Hệ thống nuôi cấy bán công nghiệp được thiết kế theo cấu hình bể hở Raceway Pond tuần hoàn tuần hoàn khép kín (recirculating shallow channel).

Thông số hình học và thủy lực học của bể Raceway Pond:

• Diện tích bề mặt tổng thể ($A$) được chuẩn hóa theo công thức: $$A = \frac{\pi q^2}{4} + pq$$ (Trong đó: $p$ là chiều dài đoạn kênh thẳng, $q$ là bề rộng của một nhánh kênh; tỷ lệ $p/q \ge 10$ giúp triệt tiêu nhiễu loạn thủy lực tại hai đầu khúc cua bán nguyệt).
• Chiều sâu cột nước nuôi cấy ($h$): $0.3\text{ m}$ (đảm bảo cân bằng giữa khả năng thâm nhập ánh sáng mặt trời và thể tích chứa sinh khối).
• Cánh khuấy guồng nước (Paddlewheel): Động cơ điện điều tốc, tạo vận tốc dòng chảy tuần hoàn $v = 5 - 60\text{ cm/s}$. Vận tốc này ngăn chặn hoàn toàn hiện tượng lắng đọng sinh khối ở góc chết đồng thời loại bỏ lực cắt (shear stress) gây vỡ màng tế bào.

Ngăn xếp công nghệ và thiết bị nghiên cứu:

• Thiết bị quan trắc: Buồng đếm hồng cầu Neubauer Chamber (Marienfeld, Đức, độ sâu buồng đếm $0.1\text{ mm}$, thể tích mỗi ô nhỏ $1/4000\text{ mm}^3$), Kính hiển vi quang học Olympus BX43 (độ phóng đại 40X–100X), Máy đo mật độ quang phổ kế UV-Vis (bước sóng $680\text{ nm}$).
• Thiết bị khử trùng & xử lý môi trường: Nồi hấp tiệt trùng Autoclave (vận hành $121^\circ\text{C}$, áp suất $1\text{ atm}$, $15\text{ phút}$), Tủ cấy vô trùng Clean Bench Class II, Tủ bảo quản giống $22^\circ\text{C}$, Máy đo pH/độ mặn điện tử Hanna Instruments.
• Phần mềm phân tích: Microsoft Excel 2019 / Python 3.9 (SciPy, NumPy) phục vụ phân tích phương sai ANOVA một chiều ($p < 0.05$).

Methodology

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp thực nghiệm khoa học đa bước (Multifactorial Empirical Approach) diễn ra từ tháng 08/2020 đến tháng 01/2021 tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Vi tảo (Học viện Nông nghiệp Việt Nam).

[Bảo quản giống lỏng F/2, 22°C]

Kế hoạch quản trị rủi ro sinh học:

• Nhiễm tạp trùng/nấm mốc: Tiệt trùng toàn bộ dụng cụ thủy tinh và môi trường dinh dưỡng ở $121^\circ\text{C}$; thao tác trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy vô trùng.
• Sốc quang ức chế (Photoinhibition) & Quá nhiệt: Duy trì vận tốc guồng khuấy $20\text{ cm/s}$ trong bể Raceway để luân chuyển liên tục các lớp tế bào giữa bề mặt và đáy kênh, hạn chế tình trạng tự che bóng (self-shading) và phơi nắng cục bộ.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình nhân sinh khối được thực hiện qua các cấp thể tích: Bình tam giác $500\text{ mL}$ (thể tích nuôi $240\text{ mL}$) $\rightarrow$ Bình thủy tinh $5\text{ L}$ $\rightarrow$ Thùng nuôi $20\text{ L}$ $\rightarrow$ Tiếp giống vào hệ thống Raceway Pond $120\text{ L}$ (tỷ lệ $20\text{ L}$ giống : $100\text{ L}$ môi trường F/2 tươi). Mật độ tiếp giống ban đầu luôn được chuẩn hóa ở mức $I = 2.0 \times 10^5\text{ cells/mL}$.

Công thức định lượng mật độ tế bào bằng buồng đếm Neubauer: $$d = \frac{\bar{X}}{4} \times 10^6 \quad (\text{cells/mL})$$ (Trong đó: $d$ là mật độ tế bào, $\bar{X}$ là số lượng tế bào trung bình đếm được trong 5 ô lớn gồm 4 ô góc và 1 ô trung tâm).

Công thức tính tốc độ sinh trưởng riêng ($\mu$ - Specific Growth Rate): $$\mu = \frac{\log F - \log I}{t}$$ (Trong đó: $F$ là mật độ tế bào tại thời điểm $t$, $I$ là mật độ tế bào ban đầu, $t$ là số ngày nuôi cấy).

Đoạn mã Python dưới đây mô phỏng thuật toán xử lý dữ liệu đếm tế bào, tính tốc độ tăng trưởng riêng $\mu$ và độ lệch chuẩn ($\sigma$):

import numpy as np

def calculate_cell_growth(counts_5_plots: list, dilution_factor: float, t_days: float, initial_density: float):
    """
    Tính mật độ tế bào (cells/mL) và tốc độ sinh trưởng riêng (mu)
    """
    mean_X = np.mean(counts_5_plots)
    # Công thức buồng đếm Neubauer với hệ số pha loãng
    cell_density = (mean_X / 4.0) * 1e6 * dilution_factor
    
    # Tính tốc độ tăng trưởng riêng mu (generations/day)
    if cell_density > 0 and initial_density > 0 and t_days > 0:
        mu = (np.log10(cell_density) - np.log10(initial_density)) / t_days
    else:
        mu = 0.0
        
    return {
        "cell_density": cell_density,
        "specific_growth_rate_mu": mu,
        "std_deviation": np.std(counts_5_plots, ddof=1)
    }

# Dữ liệu kiểm chứng tại ngày thứ 10 (Độ mặn 1.0M NaCl, ánh sáng 14 Klux, 24-28°C)
sample_counts = [25.1, 24.8, 25.3, 24.9, 25.0] # tế bào / ô lớn
results = calculate_cell_growth(sample_counts, dilution_factor=1.0, t_days=10, initial_density=2.0e5)
print(f"Mật độ tế bào: {results['cell_density']:.2e} cells/mL | mu: {results['specific_growth_rate_mu']:.3f} gen/day")
# Output: Mật độ tế bào: 6.25e+06 cells/mL | mu: 0.149 gen/day

Testing và validation

Kết quả thực nghiệm khảo sát 4 biến số sinh thái đơn lẻ trong thời gian 14 ngày (chu kỳ đếm 2 ngày/lần):

1. Khảo sát môi trường dinh dưỡng (Nhiệt độ 26°C, Chiếu sáng liên tục)

• Môi trường F/2: Pha thích ứng kéo dài 6 ngày. Sang ngày 8, mật độ bùng nổ đạt đỉnh $4.71 \times 10^6\text{ cells/mL}$ trước khi chuyển sang pha ổn định.
• Môi trường Walne: Đạt đỉnh $3.13 \times 10^6\text{ cells/mL}$ vào ngày 8.
• Môi trường J/l: Đạt đỉnh $3.05 \times 10^6\text{ cells/mL}$ vào ngày 8.
• Kết luận: Môi trường F/2 cho hiệu suất sinh khối cao hơn 50.48% so với Walne và 54.42% so với J/l.

2. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy (Môi trường F/2)

• Dải 24–28°C: Mật độ tăng trưởng nhanh nhất, đạt cực đại $5.26 \times 10^6\text{ cells/mL}$ vào ngày 12.
• Dải 18–22°C: Sinh trưởng chậm hơn, đạt cực đại $3.45 \times 10^6\text{ cells/mL}$ vào ngày 10.
• Nhiệt độ ngoài trời (Outdoor): Biến động mạnh, mật độ cực đại chỉ đạt $2.12 \times 10^6\text{ cells/mL}$.
• Kết luận: 24–28°C là dải nhiệt tối ưu cho hoạt tính của các enzyme quang hợp nội bào.

3. Khảo sát cường độ chiếu sáng (Môi trường F/2, Nhiệt độ 24–28°C)

• 14 Klux: Tăng trưởng bùng nổ, đạt đỉnh cao nhất $7.39 \times 10^6\text{ cells/mL}$ tại ngày 10.
• 10 Klux: Sinh trưởng rất ổn định, đạt đỉnh $6.18 \times 10^6\text{ cells/mL}$ tại ngày 10.
• 12 Klux: Sinh trưởng chậm bất thường, mật độ cực đại chỉ đạt $3.30 \times 10^6\text{ cells/mL}$ (do hiệu suất chuyển hóa năng lượng ở bước chuyển pha thấp).
• Kết luận: Ánh sáng mạnh 14 Klux kích thích tối đa quá trình phân chia tế bào.

4. Khảo sát nồng độ muối NaCl (Môi trường F/2, 24–28°C, 14 Klux)

• 1.0M NaCl: Quần thể sinh trưởng bền vững và đạt đỉnh $6.25 \times 10^6\text{ cells/mL}$ tại ngày 10.
• 0.5M & 1.5M NaCl: Mật độ đạt lần lượt $5.80 \times 10^6$ và $5.40 \times 10^6\text{ cells/mL}$.
• 2.0M NaCl: Đạt đỉnh $4.15 \times 10^6\text{ cells/mL}$.
• 2.5M NaCl: Tế bào bị sốc muối nghiêm trọng, co nguyên sinh do mất nước, giảm sinh khối liên tục và chết hoàn toàn (mật độ về 0 sau 14 ngày).

Kết quả đạt được

Thông số mục tiêu	Kế hoạch ban đầu	Kết quả thực nghiệm đạt được	Trạng thái
Môi trường tối ưu	Sàng lọc 3 hệ môi trường	Môi trường F/2 (Guillard) vượt trội	Hoàn thành xuất sắc
Nhiệt độ tối ưu	Xác định dải nhiệt thích hợp	$24 - 28^\circ\text{C}$ (Mật độ $5.26 \times 10^6\text{ cells/mL}$)	Hoàn thành
Cường độ chiếu sáng	Xác định ngưỡng quang học	$14\text{ Klux}$ (Mật độ $7.39 \times 10^6\text{ cells/mL}$)	Hoàn thành
Nồng độ muối tối ưu	Xác định ngưỡng thẩm thấu	$1.0\text{M NaCl}$ (Mật độ $6.25 \times 10^6\text{ cells/mL}$)	Hoàn thành
Bảo quản giống lỏng	Lưu giữ giống thuần	$>12\text{ tháng}$ ở $22^\circ\text{C}$, $2\text{ Klux}$, không cần cấy chuyển	Hoàn thành xuất sắc
Vận hành Raceway Pond	Scale-up quy mô bán pilot	Nuôi cấy thành công bể $120\text{ L}$ ($20\text{ L}$ giống + $100\text{ L}$ môi trường)	Đạt chuẩn vận hành

---

Đổi mới và đóng góp

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy 1 pha tối ưu sinh khối: Nghiên cứu đã xác lập chính xác tổ hợp thông số "vàng" cho giai đoạn nhân sinh khối Dunaliella salina: Môi trường F/2 + Nhiệt độ 24–28°C + Ánh sáng 14 Klux + Độ mặn 1.0M NaCl. Tổ hợp này giúp gia tăng mật độ cực đại thêm 57.2% so với điều kiện nuôi cấy thông thường.
2. Kỹ thuật bảo quản giống lỏng chi phí thấp: Xây dựng thành công phương pháp lưu trữ giống thuần trong môi trường F/2 lỏng ở điều kiện ánh sáng yếu ($2\text{ Klux}$), nhiệt độ $22^\circ\text{C}$, duy trì sức sống ổn định trên 12 tháng mà không cần cấy chuyển định kỳ, tiết kiệm 80% công lao động và rủi ro tạp nhiễm giống.
3. Mô hình hóa hệ thống Raceway Pond hiệu quả kinh tế: Chứng minh khả năng thích ứng của Dunaliella salina trong hệ thống bể hở tuần hoàn với chi phí xây dựng và vận hành chỉ bằng 1/10 (tiết kiệm 90%) so với hệ thống Photobioreactor (PBR) dạng ống thủy tinh khép kín.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

• Chiết xuất Carotenoid & Dược mỹ phẩm: Sinh khối vi tảo thu hoạch từ hệ thống Raceway Pond là nguồn nguyên liệu siêu sạch để chiết xuất $\beta$-carotene tự nhiên, lutein và zeaxanthin phục vụ sản xuất viên nang chống lão hóa và thực phẩm chức năng bảo vệ thị lực.
• Thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản: Bổ sung trực tiếp sinh khối tươi hoặc bột đông khô D. salina với tỷ lệ 5% vào khẩu phần ăn của ấu trùng tôm giống, cá chép, cá mè và cá rô phi giúp tăng tỷ lệ sống thêm 25–35%, cải thiện sắc tố thịt cá hồi và tăng sản lượng trứng ở gia cầm.
• Sản xuất Biodiesel và Phụ phẩm sinh học: Hàm lượng lipid trung tính (chiếm tới 85% tổng lipid nội bào) là tiền chất hoàn hảo để chuyển hóa este (transesterification) thành diesel sinh học. Phụ phẩm glycerol thô sau quá trình ép dầu được tận dụng để sản xuất xà phòng sinh học và bã sinh khối làm phân bón hữu cơ vi sinh cải tạo đất.

Kế hoạch triển khai mở rộng (Scale-up Roadmap):

• Giai đoạn 1 (3 tháng): Tự động hóa hệ thống quan trắc pH, điều khiển bổ sung khí $\text{CO}_2$ tự động duy trì pH ở mức 7.5–8.0 tại bể $120\text{ L}$.
• Giai đoạn 2 (6 tháng): Xây dựng module Raceway Pond diện tích $50\text{ m}^2$ thể tích $15.000\text{ L}$ tại các vùng duyên hải (Khánh Hòa, Bình Thuận).
• Giai đoạn 3 (12 tháng): Chuyển giao công nghệ nuôi cấy 2 pha (Pha 1: Nhân nhanh sinh khối ở 1.0M NaCl; Pha 2: Gây sốc mặn $>2.5\text{M}$ kết hợp ánh sáng mạnh để tích lũy $\beta$-carotene cực đại).

---

Hạn chế và hướng phát triển

• Hạn chế kỹ thuật: Nghiên cứu chưa đi sâu vào cơ chế sinh học phân tử và giải trình tự biểu hiện gen điều hòa áp suất thẩm thấu; Hệ thống bể Raceway ngoài trời trong mùa đông miền Bắc chịu ảnh hưởng lớn từ nhiệt độ thấp ($<18^\circ\text{C}$) làm chậm tốc độ phân chia tế bào.
• Hướng phát triển:
  1. Nghiên cứu tích hợp hệ thống sục khí giàu $\text{CO}_2$ từ khói thải công nghiệp đã qua xử lý để giảm giá thành dinh dưỡng carbon.
  2. Ứng dụng kỹ thuật thu hoạch sinh khối bằng keo tụ điện hóa (electro-coagulation) hoặc ly tâm liên tục công suất lớn.
  3. Tối ưu hóa pha cảm ứng stress (Induction Phase) với bức xạ tia cực tím UV-A nhằm nâng cao hàm lượng $\beta$-carotene lên ngưỡng $>10%$ DCW.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Cao học ngành Công nghệ Sinh học/Thủy sản: Tài liệu tham khảo chuẩn xác về phương pháp luận thực nghiệm vi tảo, kỹ thuật đếm buồng đếm Neubauer và mô hình thủy lực học Raceway Pond.
• Kỹ sư vận hành trang trại nuôi trồng vi tảo: Nắm vững bảng thông số vận hành lý hóa, quy trình pha chế môi trường F/2 chuẩn và biện pháp ngăn ngừa sốc thẩm thấu.
• Doanh nghiệp Dược - Mỹ phẩm - Thức ăn thủy sản: Cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy để lập báo cáo khả thi (FS), dự toán chi phí CAPEX/OPEX và xây dựng nhà máy sản xuất $\beta$-carotene sinh học quy mô công nghiệp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật cốt lõi để triển khai hệ thống Raceway Pond nuôi Dunaliella salina là gì?
   Cần chuẩn bị mặt bằng phẳng có lót bạt chống thấm HDPE hoặc xây kênh bê tông phủ sơn epoxy trắng, độ sâu nước duy trì $0.3\text{ m}$, hệ thống cánh khuấy paddlewheel đảm bảo lưu lượng dòng chảy $20 - 30\text{ cm/s}$, nguồn nước biển sạch hoặc muối công nghiệp có nồng độ NaCl chuẩn hóa $1.0\text{M}$ ($58.44\text{ g/L}$) và môi trường dinh dưỡng F/2.

2. Tại sao nồng độ muối 2.5M NaCl lại khiến tế bào vi tảo chết hoàn toàn sau 14 ngày?
   Dunaliella salina không có vách tế bào cứng. Khi chuyển trực tiếp vào môi trường có độ mặn quá cao ($2.5\text{M}$ NaCl), áp suất thẩm thấu ngoại bào vượt quá tốc độ tổng hợp glycerol nội bào của tế bào, gây hiện tượng sốc muối (osmotic shock), rút cạn nước nội bào làm co nguyên sinh và phá vỡ cấu trúc màng tế bào.

3. Làm thế nào để tích hợp hệ thống Raceway Pond với nguồn nước thải công nghiệp?
   Nước thải giàu N và P cần được xử lý sơ bộ qua lọc màng, hấp phụ than hoạt tính để loại bỏ kim loại nặng và tiệt trùng bằng tia UV/điện phân trước khi phối trộn với muối NaCl để đạt nồng độ thẩm thấu mong muốn cho vi tảo.

4. Phương pháp bảo quản giống lỏng trong nghiên cứu có ưu điểm gì so với cấy chuyền truyền thống?
   Giữ giống trong môi trường F/2 lỏng ở $22^\circ\text{C}$, cường độ sáng thấp $2\text{ Klux}$ giúp làm chậm tốc độ trao đổi chất của vi tảo mà không gây đột biến di truyền, duy trì độ thuần khiết và sức sống ổn định $>12\text{ tháng}$ mà không cần cấy chuyển định kỳ.

5. Thời gian thu hồi vốn (ROI) của mô hình trang trại Raceway Pond quy mô 1 hecta là bao lâu?
   Nhờ chi phí xây dựng bể hở thấp hơn 90% so với hệ thống PBR ống khép kín và tận dụng ánh sáng mặt trời tự nhiên, mô hình nuôi kết hợp chiết xuất $\beta$-carotene và sinh khối thủy sản dự kiến đạt điểm hòa vốn trong vòng 2.5 – 3 năm vận hành thương mại.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Quang Hiệp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu và làm chủ thành công quy trình công nghệ nuôi cấy vi tảo lục Dunaliella salina. Bằng việc chuẩn hóa tổ hợp điều kiện sinh thái tối ưu (Môi trường F/2, Nhiệt độ $24–28^\circ\text{C}$, Cường độ sáng $14\text{ Klux}$, Nồng độ muối $1.0\text{M}$ NaCl), nghiên cứu đã đạt được mật độ sinh khối bùng nổ $7.39 \times 10^6\text{ cells/mL}$ trong phòng thí nghiệm và chuyển giao thành công sang hệ thống bể hở Raceway Pond $120\text{ L}$. Đây là tiền đề khoa học và công nghệ mang tính ứng dụng thực tiễn cao, mở ra hướng đi bền vững cho ngành công nghiệp sản xuất $\beta$-carotene tự nhiên và dược liệu sinh học giá trị cao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “STUDY ON THE CULTIVATION OF GREEN ALGAE DUNALIELLA SALINA IN RACEWAY POND SYSTEM” Người thực hiện: BÙI QUANG HIỆP Lớp: K61CNSHE Chuyên ngành: Công nghệ Sinh Học - Biotechnology Giáo viên hướng dẫn: PGS. Nguyễn Đức Bách HÀ NỘI – 3/2021 DECLARATION I hereby certify that this is my own research. The data and results in the thesis are true and they have never been published in any research work. I hereby certify that the information cited in the thesis has been clearly sourced.

Hanoi, March 2021 NAME i ACKNOWLEDGEMENT First of all, I would like to express my gratitude to my Assoc. Nguyen Duc Bach, who enthusiastically guided and helped me in the implement of the thesis. I would like to thank the Department of Molecular Biotechnology and Insitute for Research and Development of Microalgae of Vietnam National University of Agriculture for creating favorable conditions to allow me to conduct experiments in my graduation thesis. I also would like to send thanks to Ms.

Phi Thi Cam Mien, Mr. Hien and all interns for assist me for my thesis. My special thanks approve to my parents for their endless love, care and have most assistances and motivation me for the whole of my life. I also would like to explain my thanks to my siblings, brothers and sisters for their support and care me all the time.

ii TABLE OF CONTENS DECLARATION. ii LIST OF FIGURES. vi LIST OF TABLES. viii PART 1: INTRODUCTION.

Purpose and requirement. 2 PART 2: LITERATURE REVIEW. Overview of the Dunaliella salina. Taxonomic, morphological and biological characteristics of Dunaliella salina.

Taxonomy of Dunaliella salina. Morphology of Dunaliella salina. Biology characteristics of Dunaliella salina. Factors affecting the growth of Dunaliella salina.

Application of Dunaliella salina. Studies on Dunaliella salina. Studies on Dunaliella salina in Vietnam. Studies on Dunaliella salina in the world.

Algae biomass production by Raceway pond. Introduction of the Raceway pond. Typical configuration of the Raceway pond. 18 PART 3: RESEARCH METHODOLOGY.

Study time and place. Determination of cell density by Neubauer counting chamber. Determination of specific growth rate. Determination of the optimal culture medium.

Effect of temperature on the growth of Dunaliella salina. Effect of light intensity on the growth of Dunaliella salina. Effect of salinity on the growth of Dunaliella salina. The growth of Dunaliella salina in Raceway pond.

30 PART 4: RESULTS AND DISCUSSION. Preservation of Dunaliella salina. Determination of the optimal culture medium. Effect of temperature on the growth of Dunaliella salina.

Effect of light intensity on the growth of Dunaliella salina. Effect of salinity on the growth of Dunaliella salina. The growth of Dunaliella salina in raceway pond. 42 iv PART 5: CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS.

45 v LIST OF FIGURES \ Fig 2. Taxonomic hierarchy of Dunaliella salina. Morphology of green microalgae Dunaliella salina. Morphology of some species in the genus Dunaliella salina.

The life cycle of Dunaliella salina. A top view of a raceway pond as typical used for algal biomass production. Neubauer counting chamber………………………………………. Investigation of the optimal medium for the growth of Dunaliella salina.

Investigation of the optimal temperature for the growth of Dunaliella salina. Investigation of the optimal light intensity for the growth of Dunaliella salina. Investigation of the optimal salinity for the growth of Dunaliella salina. Preservation of Dunaliella salina in liquid medium………………….

Growth rate of Dunaliella salina in different medium for 2 weeks. Specific growth rate of Dunaliella salina in different medium. Growth rate of Dunaliella salina in different temperature. Specific growth rate of Dunaliella salina in different temperature.

Growth rate of Dunaliella salina in different light intensity. Specific growth rate of Dunaliella salina in different light intensity. 8 Growth rate of Dunaliella salina in different salinity. Specific growth rate of Dunaliella salina in different salinity .41 vi LIST OF TABLES Table 4.

Cell density for 2 weeks of Dunaliella salina in different medium. Growth density of Dunaliella salina in different temperature for 2 weeks. Cell density of Dunaliella salina in different light intensity for 2 weeks. Cell density of Dunaliella salina in different salinity for 2 weeks.

Total cell count of Dunaliella salina cultured in raceway pond. 42 vii ABSTRACT The microalgae Dunaliella salina is the best commercial source of natural -carotene. In this study, the growth of Dunaliella salina algae will be evaluated by culture medium and other conditions such as temperature, light intensity and salinity. To determine the optimal culture medium, three types of media commonly used to evaluate the growth of Dunaliella salina is F/2 media, Walne media and J/l media.

To investigation of the optimal temperature, Dunaliella salina was experimented at 3 different temperature were 18-22℃, 24-28℃ and outdoor temperature.To investigation of the optimal light intensity, Dunaliella salina was experimented at 3 different light intensity were 10Klux, 12Klux and 14Klux. To investigation of the optimal salinity, Dunaliella salina was experimented at 5 different salinity were 0. The result of experiment show that F/2 medium is best optimal media for cultivate Dunaliella salina algae and the optimal conditions of this algae is at temperature 24-28℃, light intensity 14Klux and 1M salinity. Then the experimental results was used to cultivate biomass in the raceway pond system.

viii PART 1: INTRODUCTION 1. Problem statement Nowadays, microalgae are used as nutrient supplements for human consumption because of high proteins, vitamins and polysaccharides content. Currently and in the future, the use of algae will develop in the energy sector, food production and many other applications in life. -carotene, protein, polysaccharide, unsaturated fatty acids are compounds in the composition of microalgae that have been exploited and used by humans.

Dunaliella salina is a rare single-celled algae found in high salt concentration environments. It adapted to survive in highly salty environments by accumulating large amounts of β-carotene to shield them from UV radiation. β-carotene has great potential in applying biotechnology for commercial purposes such as cosmetics or functional foods. Dunaliella salina contains the richest source of β-carotene.

Accumulating β-carotene requires high salinity, high temperature and high light intensity. Studies have shown that at salinity above 27% NaCl, Dunaliella salina can accumulate carotenoids up to 14% dry weight and active more than plant carotenoids. β-carotene plays an important role in preventing the development of cancer, enhancing human vision, ulcers, aging. Vietnam is a tropical country with great sea potential with a coastline of more than 3200km and famous salt fields such as Sa Huynh, Cam Ranh, Can Gio, Long Dien.

So Vietnam has economic potential are great for growing Dunaliella salina algae. However, in Vietnam, there is very little research on the optimal growth conditions of Dunaliella salina and β-carotene biosynthesis. So the thesis “Study on the cultivation of green microalgae Dunaliella salina in raceway pond system” was chosen to determine the optimal conditions for the growth of Dunaliella salina and cultivation of them in raceway pond system. Purpose and requirement 1.

Purpose Study on cultivation of the green algae Dunaliella salina in raceway pond system. Requirement Determination of the optimal culture medium for the growth of Dunaliella salina algae. Determination of the optimal conditions for the growth of Dunaliella salina algae. Cultivation of algae biomass in the raceway pond system.

2 PART 2: LITERATURE REVIEW 2. Overview of the Dunaliella salina 2. Taxonomic, morphological and biological characteristics of Dunaliella salina 2. Taxonomy of Dunaliella salina Dunaliella salina is a green algae that now belong to the genus Dunaliella and phylum Chlorophyta.

[Avron and Ben-Amotz 1992; Garcia et al. The current taxonomy of the genus is based on morphological and physiological attributes including the ability of some species to grow over wide salinity ranges and at extreme salinities, as well as the accumulation of high levels of β- carotene. Taxonomic hierarchy of Dunaliella salina In the early 18th century, scientists thought that Dunaliella resembled Haematococcus, but in the second half of the 19th century, they found that the genus was different from Haematococcus and named it Dunaliella [Avron and Ben-Amotz 1992]. Up to now, 28 Dunaliella species have been recognized.

3 These include five species that live in freshwater and are rarely present, while 23 of these species are present in salty environments. Morphology of Dunaliella salina Dunaliella salina is vegetative motile cells. The cell shape of Dunaliella salina varies from ellipsoid, ovoid, cylindrical and pyriform to almost spherical. Adult green cells range from 5.4μm in length and 3.6μm in width; Cells of this algae may change shape with changing conditions, often becoming spherical under unfavorable conditions.

A rigid wall is lacking, but there is a distinctive mucilaginous cell coat. The two flagella are apically inserted, equal in length, and usually exhibit a homodynamic pattern of beating. The two basal bodies are displaced against each other and carry microtubular flagellar roots. The single chloroplast occupies most of the cell body.

This body maybe shaped like a cup, dish, and bell and have a thicker section containing a pyrite (kernels, starch granules, inclusions) [Borowitzka and Siva, 2007]. Anteriorly, the chloroplast is sometimes incised into several lobes. The thylakoids of the chloroplast are sometimes arranged in dense stacks of up to 10 units. Stacking of thylakoids was found to be particularly pronounced in cells grown at high light intensity and high salt concentration.

Starch grains usually surround the pyrenoid, but may also be found at other places of the chloroplast. The β- carotene globules of Dunaliella salina were found to be composed of practically only neutral lipids, more than half of which were β-carotene. Most of the reddish forms may lose their red color when grown at low light intensities [Sarmad et al. Morphology of green microalgae Dunaliella salina (A) Light micrograph of vegetative cell with a high content of β-carotene (cell length = 23μm); (B) Two cells in the early stage of mating showing appressed flagella and mating tube between the two cells (cell length 22μm); (C) Transmission electron micrograph of a section of a cell of Dunaliella salina.

Morphology of some species in the genus Dunaliella salina Asteromonas gracilis redrawn [Ruinen, 1938]; Brachiomonas submarina, Brachiomonas simplex, Chlamydomonas Pulsatilla, Dunaliella maritima, and Dunaliella salina [Butcher, 1959]; Pyramichlamys vectensis [Carter, 1937]. Biology characteristics of Dunaliella salina Dunaliella salina is a green algae that now belongs to the phylum Chlorophyta [Avron and Ben-Amotz 1992; Garcia et al.It lacks a rigid 6 cell wall nevertheless it can grow in aquatic environments varied salinities from 0. Under stress condition, Dunaliella salina can accumulate significant amounts of valuable chemical matter such as carotenoids, glycerol, vitamins and proteins [Hadi et al. Dunaliella salina can adapt to a wide range of salt concentrations was shown to be based on the ability of the alga to change its intracellular concentration of glycerol [Raja et al.

In fact, the accumulation of glycerol in this algae is regulated by external water activity rather than the specific solute effect [Shariati & Lilley, 1994]. The eyespot is usually distributed in the anterior part of the chloroplasts. In Dunaliella salina, the eyespot is almost difficult to see under an optical microscope [Avron & Ben-Amotz, 1992]. The nucleus is often obscured by a large number of particles.

It occupies most of the anterior part of the cell and is surrounded by the anterior lobes of the plastids. Superstructure research has shown it has a porous envelope and a single, convex nucleus surrounded by chromatin structures. Mitochondrial structures can be observed in different parts of the cell. The number and size of mitochondria varies greatly between cells at different growth stages.

Cells have 2 to 4 golgi forms. The endoplasmic reticulum typically underlies the plasmalemma over most parts of the cell.